KHẢO SÁT HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ VÀ TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT H5N1 TRÊN VỊT TRƯỚC VÀ SAU TIÊM PHÒNG TẠI 3 HUYỆN TỈNH BẾN TRE LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH LÊ HỒNG PHONG KHẢO SÁT HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ VÀ TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT H5N1 TRÊN VỊT TRƯỚC VÀ SAU TIÊM PHÒNG TẠI 3 HUYỆN TỈNH BẾN TRE LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 102010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH LÊ HỒNG PHONG KHẢO SÁT HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ VÀ TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT H5N1 TRÊN VỊT TRƯỚC VÀ SAU TIÊM PHÒNG TẠI 3 HUYỆN TỈNH BẾN TRE Chuyên ngành: Thú y Mã số : 60.6250 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 102010 i KHẢO SÁT HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ VÀ TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT H5N1 TRÊN VỊT TRƯỚC VÀ SAU TIÊM PHÒNG TẠI 3 HUYỆN TỈNH BẾN TRE LÊ HỒNG PHONG Hội đồng chấm luận văn: 1. Chủ tịch: PGS. TS. TRẦN ĐÌNH TỪ Hội Thú Y Việt Nam 2. Thư ký: TS. NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh 3. Phản biện 1: TS. NGUYỄN TẤT TOÀN Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh 4. Phản biện 2: PGS. TS. LÂM THỊ THU HƯƠNG Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh 5. Ủy viên: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Lê Hồng Phong, sinh ngày 24 tháng 10 năm 1974 tại Thị trấn Việt Lâm, tỉnh Hà Giang. Con Ông Lê Quang Dinh và Bà Đinh Thị Mai. Tốt nghiệp phổ thông trung học tại Trường Phổ thông Trung học Bình Sơn, huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi, 1993. Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ chính qui năm 1999 tại Trường Đại Học Nông Lâm Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế. Sau khi tốt nghiệp đến nay đã trải qua các công việc sau : Từ tháng 31999 đến 32000 cán bộ kỹ thuật công ty CPViệt Nam. Từ tháng 42000 đến 82004 cán bộ Kiểm dịch Động vật CảngBưu điện – Trung Tâm Thú y vùng Tp. Hồ Chí Minh. Từ 92004 đến 102007 Cán bộ chẩn đoán vi rút thuộc phòng Chẩn đoán xét nghiệm – Trung Tâm Thú y vùng Tp. Hồ Chí Minh. Từ tháng 102007 – 122008 Cán bộ Dịch tễ Cơ Quan Thú y vùng VI. Từ tháng 12009 – 122010 Phụ trách Dịch tễ Bộ phận thường trực Cục Thú y Phía Nam – Cục Thú y. Từ tháng 12011 – đến nay Phó phụ trách Bộ phận thường trực Cục Thú y Phía Nam – Cục Thú y. Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng gia đình: kết hôn năm 2004. Vợ Huỳnh Thị Ngọc Lan, sinh năm 1978, nghề nghiệp Cử nhân Kinh tế. Con gái Lê Huỳnh Hồng An sinh năm 2008. Địa chỉ liên lạc: B126 chung cư Hoàng Anh Gia Lai, 783 đường Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, Tp. Hồ Chính Minh Bộ phận thường trực Cục Thú y Phía Nam – Cục Thú y 5211 đường Hoàng Văn Thụ, phường 4, quận Tân Bình, Tp. Hồ Chí Minh Điện thoại : 083. 8444024, 0913655220, fax : 083.8444029 Email : lehongphong256yahoo.com, lehongphong256gmail.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Lê Hồng Phong iv LỜI CẢM TẠ Chúng tôi chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Phòng Đào tạo sau Đại học Khoa Chăn Nuôi Thú Y Tập thể Cơ Quan Thú y vùng VI Tập thể Bộ phận thường trực Cục Thú y phía Nam Chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này. Cùng toàn thể thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, động viên, đóng góp những ý kiến quí báu trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài. v TÓM TẮT Đề tài ‘’Khảo sát hiệu giá kháng thể và tình hình nhiễm vi rút H5N1 trên vịt trước và sau tiêm phòng tại 3 huyện tỉnh Bến Tre’’ được thực hiện từ tháng 12007 đến tháng 122007 nhằm đánh giá hiệu giá kháng thể kháng vi rút H5N1 trên các đàn vịt chưa tiêm phòng, khả năng bảo hộ của vắcxin cúm đối với đàn vịt được tiêm phòng và sự hiện dịch của vi rút H5N1 trên đàn vịt tiêm phòng và chưa tiêm phòng. Khảo sát được tiến hành theo phương pháp cắt ngang. Kết quả khảo sát cho thấy chương trình tiêm phòng vắcxin có hiệu quả đã làm giảm đáng kể dịch cúm gia cầm xảy ra trên địa bàn tỉnh Bến Tre. Năm 2007 dịch cúm gia cầm xảy ra tại huyện Ba Tri. Trên các đàn vịt chưa tiêm phòng thì tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính là 16,96 % và tỷ lệ dương tính trên đàn vịt xét nghiệm là 43,48 %. Các đàn vịt tiêm đủ 2 mũi vắcxin có tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng trên đủ bảo hộ theo quy định của Cục Thú y (≥ 70 %), trên các đàn vịt tiêm 1 mũi vắcxin không đủ bảo hộ theo quy định, chỉ đạt tỷ lệ bảo hộ 58,06 % trên đàn. Có sự lưu hành vi rút cúm H5N1 (theo phương pháp realtime RT – PCR) trên các đàn vịt chưa tiêm phòng với tỷ lệ là 8,70 % trên đàn xét nghiệm và 1,45 % trên mẫu xét nghiệm. Vịt đã tiêm phòng vắcxin không có sự hiện diện vi rút cúm H5N1. Nhưng trên các đàn vịt tiêm đủ 2 mũi vắcxin vẫn có sự hiện diện vi rút cúm typ A với tỷ lệ 20,00 % trên đàn xét nghiệm, còn trên các đàn vịt tiêm phòng 1 mũi vắcxin có sự hiện diện của vi rút cúm typ A (31,18 %) và cả vi rút cúm subtyp H5 (15,05 %) trên đàn xét nghiệm. Phát hiện sự hiện diện vi rút cúm H5N1 trên mẫu huyết thanh của vịt chỉ báo sau 4 tháng theo dõi với tỷ lệ nhiễm 12,00 % và có sự lưu hành của vi rút cúm typ A (4,00 %) và vi rút cúm subtyp H5 (2,00 %) trên các vịt chỉ báo. vi SUMMARY “The survey of the antibody level and H5N1 vi rút infection the duck before and after vaccination in 03 districts of Ben Tre province” was carried out from January 2007 to December 2007 with the purpose of evaluating the antibody level against H5N1 vi rút in the flocks of ducks with and without vaccination in flocks of ducks as well as H5N1 vi rút occurrence. The survey was carried according to method of retrospectivestudy and transection. The result showed that the vaccination program is effective and remarkably reduces H5N1 avian flu epidemic occurring in Ben Tre province. In 2007, H5N1 avian flu epidemic occurred in Ba Tri district. In flocks of ducks without vaccination serum samples positive was is 16.96 % and 43.48 % of tested flocks was positive. Protection rate in flocks of ducks with two for vaccination was according to the regulation of Veterinary Bureau (≥ 70 %), but in flocks of ducks with one vaccine injection, the protection rate only reached 58.06 %. Is 8.70 % of tested flocks and 1.45 % of test samples of the flocks of duck without vaccinated were prositive for H5N1 vi rút by realtime RTPCR, ducks which were injected vaccine do not have circulation of H5N1 vi rút. Flocks of ducks which were vaccinated two times still spread vi rút of typ A with 20.00 % of tested flocks, and flocks which were vaccinated once still spread vi rút of typ A with 31.18 % and vi rút of subtyp H5 with 15.05 %. H5N1 vi rút were discovered 12.00 % in of sentinel duck’s serum samples after four months’ monitoring and there was a circulation of vi rút typ A (4.00 %) and vi rút subtyp H5 (2.00 %) in the sentinel flocks of ducks. vii MỤC LỤC Trang TRANG TỰA TRANG CHUẨN Y ................................................................................. i LÝ LỊCH CÁ NHÂN ...................................................................................... ii LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... iii LỜI CẢM TẠ ................................................................................................. iv TÓM TẮT ........................................................................................................ v SUMMARY ................................................................................................... vi MỤC LỤC..................................................................................................... vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT........................................................... xi DANH SÁCH HÌNH .................................................................................... xii DANH SÁCH SƠ ĐỒ ................................................................................... xii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ ............................................................................. xiii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................. xiv Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu .......................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu ......................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu .......................................................................................................... 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 2.1. Tổng quan về tỉnh Bến Tre ............................................................................... 3 2.1.1. Điều kiện tự nhiên dân số............................................................................ 3 2.1.2. Tình hình phát triển chăn nuôi vịt ................................................................. 4 2.2. Bệnh cúm gia cầm ............................................................................................ 6 2.3. Lịch sử bệnh ..................................................................................................... 6 viii 2.4. Căn bệnh ........................................................................................................... 6 2.4.1. Phân loại ........................................................................................................ 6 2.4.2. Hình thái ........................................................................................................ 7 2.5. Dịch tễ học ........................................................................................................ 8 2.5.1. Phân bố địa lý ................................................................................................ 8 2.5.2. Loài cảm thụ .................................................................................................. 9 2.5.3. Đường truyền lây ........................................................................................... 9 2.5.4. Cơ chế sinh bệnh ......................................................................................... 10 2.5.5. Sự nhân lên của vi rút trong động vật ký chủ ........................................... 10 2.6. Chất chứa căn bệnh và bài thải vi rút CGC .................................................. 11 2.7. Miễn dịch chống bệnh cúm gia cầm ............................................................... 11 2.7.1. Miễn dịch tự nhiên ....................................................................................... 11 2.7.2. Miễn dịch đặc hiệu ...................................................................................... 12 2.8. Chẩn đoán ....................................................................................................... 16 2.8.1. Chẩn đoán lâm sàng .................................................................................... 16 2.8.2. Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm ................................................................... 16 2.8.3. Kỹ thuật realtime RT – PCR ....................................................................... 17 2.9. Chương trình tiêm phòng vắcxin cúm gia cầm tại nước ta ........................... 19 2.9.1. Quan điểm sử dụng vắcxin phòng chống bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao.......................................................................................................................... 19 2.9.2. Ưu điểm và hạn chế khi tiêm phòng vắcxin cúm gia cầm ......................... 19 2.9.3. Tiêm phòng vắcxin cúm gia cầm ở nước ta ............................................... 20 2.9.4.Theo dõi sau tiêm phòng .............................................................................. 20 2.9.5. Các loại vắcxin cúm gia cầm được sử dụng tại Việt Nam ......................... 21 2.10. Tình hình nghiên cứu bệnh cúm gia cầm trên thế giới và Việt Nam ........... 23 2.10.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 23 2.10.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................. 23 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 26 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 26 ix 3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài ............................................................................ 26 3.1.2. Địa điểm thực hiện ...................................................................................... 26 3.2. Đối tượng khảo sát ......................................................................................... 26 3.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 26 3.4. Vật liệu xét nghiệm ........................................................................................ 27 3.4.1. Mẫu xét nghiệm ........................................................................................... 27 3.4.2. Kháng nguyên .............................................................................................. 28 3.4.3. Kít ly trích RNA và realtime RTPCR ........................................................ 28 3.4.4. Thiết bị xét nghiệm...................................................................................... 28 3.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 28 3.5.1. Nội dung 1: Ghi nhận tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trong 4 năm (20042007) và kết quả tiêm phòng vắc – xin H5N1 chủng Re1 đợt 22006 và 2 đợt năm 2007 ......................................................................................................... 28 3.5.2. Nội dung 2: Tình hình nhiễm vi rút cúm H5N1 trên vịt chưa tiêm phòng và tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng trên vịt.................................................................. 28 3.5.2.1. Mục tiêu khảo sát ..................................................................................... 29 3.5.2.2. Phương pháp khảo sát ............................................................................... 29 3.5.2.3. Phương pháp xét nghiệm HI ..................................................................... 30 3.5.2.4. Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................. 36 3.5.3. Nội dung 3: Xác định sự hiện diện và lưu hành của vi rút cúm H5N1 trên đàn vịt chưa tiêm phòng và tiêm phòng vắc – xin. ................................................ 36 3.5.3.1. Mục tiêu khảo sát ..................................................................................... 36 3.5.3.2. Phương pháp khảo sát ............................................................................... 36 3.5.3.3. Phương pháp xét nghiệm .......................................................................... 37 3.5.3.4. Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................. 40 3.6. Xử lý số liệu ................................................................................................... 40 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 41 4.1.Tình hình bệnh cúm gia cầm H5N1 từ năm 2004 – 2007 ............................... 41 4.2.Tình hình tiêm phòng vắcxin trên vịt tỉnh Bến Tre năm 2006, 2007............. 43 x 4.3.Khảo sát hiệu giá kháng thể trên các đàn vị chưa tiêm phòng ........................ 44 4.4. Khảo sát hiệu giá bảo hộ trên các đàn vịt đã tiêm phòng ............................... 49 4.4.1.Kết quả khảo sát tỷ lệ bảo hộ trên mẫu huyết thanh vịt đã tiêm phòng theo quy mô chăn nuôi, hình thức chăn nuôi và mục đích chăn nuôi ........................... 51 4.4.2.Khảo sát tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng trên mẫu huyết thanh của vịt tiêm 1 mũi và tiêm đủ 2 mũi vắc xin .............................................................................. 54 4.5.Khảo sát sự hiện diện vi rút cúm H5N1 trên vịt tiêm phòng và chưa tiêm phòng vắc xin ...................................................................................................... 57 4.5.1. Khảo sát sự hiện diện vi rút cúm typ A trên cá thể và đàn vịt chưa tiêm phòng ..................................................................................................................... 59 4.5.2. Khảo sát sự hiện diện vi rút cúm subtyp H5 trên cá thể và đàn vịt chưa tiêm phòng ............................................................................................................. 60 4.5.3. Khảo sát hiện diện vi rút cúm typ A và subtyp H5 trên cá thể và đàn vịt tiêm 1 mũi vắc xin ............................................................................................... 61 4.5.4. Khảo sát hiện diện vi rút cúm typ A và subtyp H5 trên cá thể và đàn vịt tiêm đủ 2 mũi vắc xin .......................................................................................... 62 4.6. Kết quả khảo sát sự lưu hành vi rút cúm H5N1 trên vịt chỉ báo .................. 63 4.6.1. Kết quả xét nghiệm mẫu huyết thanh của vịt chỉ báo ................................. 63 4.6.2. Kết quả xét nghiệm mẫu dịch ngoáy của vịt chỉ báo .................................. 65 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 67 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 70 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 78 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AGID : Agar gel immunodiffusion CGC : Cúm gia cầm cDNA : Complenmentary deoxyribonucleic acid dATP : Deoxyadenosine triphosphates dCTP : Deoxycytosine triphosphates dGTP : Deoxyguanosine triphosphates DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphates dTTP : Deoxythymine triphosphates H : Haemaglutinin HI : Haemaglutination inhibition HPAI : Highly Pathogenic Avian Influenza LPAI : Low Pathogenic Avian Influenza M : Matrix protein N : Neuraminidase NI : Neuraminidase inhibition OIE : Office international of epizooties PCR : Polymerase chain reaction RNA : Ribonucleic acid Realtime RT – PCR : Real time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RT – PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction WHO : World Health Organization μl : Microlittre xii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1. Bản đồ hành chính tỉnh Bến Tre ................................................................. 4 Hình 2.2. Nuôi vịt nhốt tại huyện Ba Tri .................................................................... 5 Hình 2.3. Nuôi vịt thả đồng tại huyện Ba Tri ............................................................. 5 Hình 2.4. Mô hình vi rút cúm A H5N1 .................................................................. 8 Hình 2.5. Hạt vi rút cúm nhuộm âm cực dưới kính hiển vi điện tử quét ................. 8 Hình 2.6. Cơ chế của phản ứng realtime RT PCR .................................................. 18 DANH SÁCH SƠ ĐỒ xiii Trang Sơ đồ 3.1: Xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm ................. 30 Sơ đồ 3.2: Cách thực hiện phản ứng HA .................................................................. 33 Sơ đồ 3.3. Cách thực hiện phản ứng HI .................................................................. 35 Sơ đồ 3.4. Xét nghiệm Realtime RT PCR phát hiện vi rút H5N1 trên mẫu dịch ngoáy ....................................................................................... 38 DANH SÁCH BIỂU ĐỒ xiv Trang Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ tiêm vắcxin năm 20062007 .............................................. 44 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ bảo hộ trên cá thể và đàn vịt tiêm 1 mũi và đủ 2 mũi vắcxin.................................................................................. 56 Biểu đồ 4.3. Tỷ lệ hiện diện vi rút cúm H5N1 trên cá thể và đàn vịt tiêm phòng và chưa tiêm phòng .................................................. 58 Biểu đồ 4.4. Tỷ lệ hiện diện vi rút cúm typ A và vi rút cúm subtyp H5 trên vịt tiêm 1 mũi và tiêm đủ 2 mũi vắc xin ............................ 63 DANH SÁCH BẢNG xv Trang Bảng 3.1. Quy trình tiêm phòng vắcxin cúm trên vịt .............................................. 26 Bảng 3.2. Phân bổ mẫu kiểm tra huyết thanh vịt chưa tiêm phòng .......................... 29 Bảng 3.3. Phân bổ mẫu kiểm tra huyết thanh vịt sau tiêm phòng năm 2007 ............ 30 Bảng 3.4. Phân bổ kiểm tra mẫu gộp dịch ngoáy vịt chưa tiêm phòng .................... 36 Bảng 3.5. Phân bổ kiểm tra mẫu gộp dịch ngoáy vịt sau tiêm phòng năm 2007 ...... 37 Bảng 4.1. Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trong 4 năm từ 20042007 ............... 41 Bảng 4.2. Kết quả tiêm phòng vắcxin đợt 22006 và năm 2007 ............................. 43 Bảng 4.3. Kết quả xét nghiệm kháng thể HI trên đàn vịt chưa tiêm phòng .............. 45 Bảng 4.4. Kết quả khảo sát tỷ lệ HI (+) trên vịt theo quy mô chăn nuôi .................. 46 Bảng 4.5. Kết quả khảo sát tỷ lệ HI (+) trên vịt chưa tiêm phòng theo hình thức chăn nuôi ................................................................................................................... 47 Bảng 4.6. Kết quả khảo sát tỷ lệ HI (+) trên vịt chưa tiêm phòng theo mục đích chăn nuôi ............................................................................................................................ 48 Bảng 4.7. Tỷ lệ mẫu đạt hiệu giá bảo hộ chống vi rút cúm gia cầm trên các đàn vịt đã tiêm phòng ............................................................................................................ 50 Bảng 4.8. Tỷ lệ bảo hộ trên cá thể và trên đàn vịt tiêm phòng theo quy mô chăn nuôi ................................................................................................................................... 51 Bảng 4.9. Tỷ lệ bảo hộ trên cá thể và trên đàn vịt tiêm phòng theo hình thức chăn nuôi ............................................................................................................................ 52 Bảng 4.10. Tỷ lệ bảo hộ trên cá thể và trên đàn vịt tiêm phòng theo mục đích chăn nuôi ............................................................................................................................ 53 Bảng 4.11. Tỷ lệ bảo hộ trên cá thể và trên đàn vịt tiêm 1 mũi vắcxin ................... 54 Bảng 4. 12. Tỷ lệ bảo hộ trên cá thể và trên đàn vịt tiêm đủ 2 mũi vắcxin ............. 55 Bảng 4.13. Tỷ lệ hiện diện vi rút cúm H5N1 trên vịt tiêm phòng và chưa tiêm phòng vắc xin .......................................................................................................... 57 Bảng 4.14. Tỷ lệ hiện diện vi rút cúm typ A trên cá thể và đàn vịt chưa tiêm phòng ................................................................................................................................... 59 xvi Bảng 4.15. Tỷ lệ hiện diện vi rút cúm subtyp H5 trên cá thể và đàn vịt chưa tiêm phòng ......................................................................................................................... 60 Bảng 4.16. Tỷ lệ hiện diện vi rút cúm typ A và subtyp H5 trên cá thể và đàn vịt tiêm 1 mũi vắc xin .................................................................................................. 61 Bảng 4.17. Tỷ lệ hiện diện vi rút cúm typ A và subtyp H5 trên cá thể và đàn vịt tiêm đủ 2 mũi vắc xin ............................................................................................. 62 Bảng 4.18. Tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính với vi rút cúm H5N1 trên vịt chỉ báo ................................................................................................................................... 64 Bảng 4.19. Tỷ lệ mẫu dịch ngoáy dương tính với vi rút cúm H5N1 trên vịt chỉ báo ................................................................................................................................... 65 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Theo báo cáo của Cục Thú Y năm 2007, vào cuối năm 2006 và những tháng đầu năm 2007, dịch cúm ra cầm xảy ra rất nhiều trên vịt tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long gây thiệt hại rất lớn cho người chăn nuôi mặc dù chương trình tiêm phòng vắcxin vẫn được triển khai. Như vậy khả năng tồn tại vi rút cúm gia cầm H5N1 trên những đàn vịt đã được tiêm phòng và chưa được tiêm phòng là rất cao. Theo khẳng định của ông Nguyễn Văn Cảm (Giám Đốc Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương) trong cuộc họp ngày 26062007 của ban chỉ đạo quốc gia phòng chống dịch CGC, vi rút cúm gia cầm H5N1 vẫn đang lưu hành rộng rãi trong môi trường chăn nuôi của nước ta và vịt là đối tượng chính mang mầm bệnh và làm dịch lây lan, vịt mang kháng thể vi rút H5N1 nhiễm tự nhiên lên tới 12,2 % (http:vietnamnet.vnxahoi200706710869). Đây là một dịch bệnh cực kỳ nguy hiểm có nguy cơ bùng phát thành đại dịch ảnh hưởng nghiêm trọng đến tính mạng và sức khỏe con người. Theo cảnh báo của Tổ chức Y tế thế giới khi đại dịch xảy ra, ở Việt Nam sẽ có khoảng 10 % dân số mắc bệnh (tức là khoảng 8,2 triệu người) và khoảng 1 % tử vong (820.000 người). Bệnh cúm gia cầm typ A (H5N1) ngoài việc gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm mà còn gây bệnh cho con người do ăn thịt gia cầm hoặc tiếp xúc với các loại gia cầm, thủy cầm, chim nuôi, chim hoang dã mang vi rút cúm gia cầm H5N1. Bệnh diễn biến nhanh gây suy hô hấp và dẫn tới tử vong rất cao nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời. Tính từ tháng 122003 đến 122007, ở Việt 2 Nam đã có 92 người mắc bệnh và 42 người tử vong ở 32 tỉnh, thành phố trong cả nước. Bến Tre là một trong những tỉnh miền Tây có mật độ chăn nuôi vịt cao. Theo báo cáo của Chi Cục Thú y tỉnh Bến Tre trong những năm 2006, 2007 dịch cúm vẫn xảy ra trên địa bàn tỉnh và đã phát hiện vi rút cúm gia cầm H5N1 lưu hành trên những đàn vịt khỏe mạnh tại các huyện Thạnh Phú, Ba Tri và Giồng Trôm. Khảo sát, đánh giá hiệu quả tiêm phòng vi rút cúm H5N1 cũng như xác định sự hiện diện của vi rút cúm gia cầm H5N1 trong các đàn vịt trước và sau các đợt tiêm phòng đại trà là hết sức cần thiết. Đề tài “Khảo sát hiệu giá kháng thể và tình hình nhiễm vi rút H5N1 trên vịt trước và sau tiêm phòng tại 3 huyện tỉnh Bến Tre”, được tiến hành nhằm để có cơ sở khuyến cáo cho các nhà quản lý các biện pháp phòng chống và giám sát bệnh cúm H5N1 trên gia cầm và trên vịt và những chính sách khống chế hiệu quả hơn. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu Đánh giá tình hình nhiễm vi rút cúm H5N1 và đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm phòng trên vịt tại 3 huyện tỉnh Bến Tre để làm cơ sở cho việc xây dựng biện pháp kiểm soát bệnh. 1.2.2. Yêu cầu Ghi nhận tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trong 4 năm (20042007) và kết quả tiêm phòng vắc – xin H5N1 chủng Re1 đợt 22006 và 2 đợt năm 2007. Tình hình nhiễm vi rút cúm H5N1 trên vịt chưa tiêm phòng và tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng trên vịt. Xác định sự hiện diện và lưu hành của vi rút cúm H5N1 trên đàn vịt chưa tiêm phòng và tiêm phòng vắc – xin. 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về tỉnh Bến Tre 2.1.1. Điều kiện tự nhiên dân số Tỉnh Bến Tre có diện tích đất tự nhiên 2.356,8 km2. Vị trí địa lý của tỉnh có hình rẻ quạt mà đầu nhọn nằm ở thượng nguồn, các nhánh sông lớn giống như nan quạt xoè rộng ra ở phía đông. Phía Bắc giáp với tỉnh Tiền Giang có ranh giới chung là sông Tiền, phía Tây và phía Nam giáp với tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Trà Vinh, có ranh giới chung là sông Cổ Chiên và phía Đông giáp với Biển Đông với chiều dài bờ biển là 65km. Bến Tre là một tỉnh châu thổ nằm sát biển, nên có địa hình bằng phẳng, rải rác có những giồng cát xen kẽ với ruộng vườn, không có rừng cây lớn. Bốn bề đều có sông nước bao bọc, kênh rạch chằng chịt đan xen vào nhau rất thuận tiện cho giao thông vận tải cũng như thuỷ lợi. Tàu bè từ thành phố Hồ Chí Minh đi về miền Tây và ngược lại đều đi qua đất Bến Tre. Cùng với hệ thống đường thuỷ thuộc loại lý tưởng, Bến Tre còn có hệ thống đường bộ thuận tiện. Chính từ những đặc điểm trên, Bến Tre có vị trí đặc biệt trong thời chiến cũng như thời bình, được minh họa ở hình 2.1. Tỉnh Bến Tre có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nằm ở vùng nội chí tuyến bắc bán cầu, cận xích đạo nên nhiệt độ trung bình hàng tháng trong năm là 27,02 0C, vào tháng một có nhiệt độ thấp nhất cũng chỉ là 24,70 0C. Số giờ nắng cao nhất là vào tháng ba có 252 giờ và thấp nhất vào tháng 12 là 90 giờ. Lượng mưa các tháng trong năm 2005 đo được là 1.695,5 mm. Lượng mưa phân bổ không đều ở tất cả các tháng trong năm. Mùa mưa tập trung từ tháng 5 – 12, chiếm 80 – 90 % lượng mưa cả năm. Lượng mưa cao nhất vào tháng 10 là 366,2 mm, thấp nhất là tháng 5 với 85,1 mm. Độ ẩm trung bình các tháng trong năm 2005 là 84,33 %. 4 Dân số hiện nay của tỉnh là 1.351.472 người, trong đó nam là 655.701 người, nữ là 695.771 người. Trên địa bàn tỉnh, dân tộc kinh chiếm đại đa số khoảng 98– 99 %, và các dân tộc khác chiếm tỉ lệ thấp không đáng kể, khoảng 1 %. Hình 2.1. Bản đồ hành chính tỉnh Bến Tre 2.1.2. Tình hình phát triển chăn nuôi vịt Do vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên thuận lợi do vậy nghề chăn nuôi vịt tại tỉnh Bến Tre rất phát triển là một nghề truyền thống, đã và đang giúp người dân nơi đây phát triển kinh tế hộ gia đình, là một trong những vật nuôi được chính quyền địa phương rất quan tâm để nhằm cải thiện kinh tế cho các hộ dân trên địa bàn tỉnh. Vịt được phát triển và chăn nuôi hầu hết trên tất cả các huyện thị của tỉnh Bến Tre, do vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên khác nhau mà các huyện có số lượng vịt khác nhau, các huyện có tổng đàn vịt trên 100 ngàn con gồm các huyện Ba Tri và huyện Giồng Trôm, các huyện có tổng đàn vịt từ 50 100 ngàn con gồm các huyện Bình Đại, Mỏ Cày, Thạnh Phú, các huyện có tổng đàn dưới 50 ngàn con gồm các huyện Châu Thành, Chợ Lách và Thị xã, người dân chăn nuôi vịt chủ yếu theo 2 phương thức là nuôi nhốt và thả đồng, nuôi nhốt chủ yếu là vịt nuôi đẻ đề lấy trứng 5 cung cấp cho các lò ấp, còn nuôi thả đồng chủ yếu nuôi vịt thịt. Còn quy mô các đàn vịt tại các huyện cũng tương đối nhỏ, chăn nuôi theo hộ gia đình hầu hết có quy mô đàn nhỏ hơn 200 con, còn chăn nuôi trang trại có quy mô từ 200 – 500 con là chủ yếu, so với các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long thì tỉnh Bến Tre các đàn vịt có quy mô đàn nhỏ nhưng số lượng đàn trên hộ dân thì nhiều hơn các tỉnh khác trong vùng là vì chủ yếu người dân chăn nuôi cải thiện kinh tế gia đình là chủ yếu, minh họa ở hình 2.2 và 2.3. Hình 2.2. Nuôi vịt nhốt tại huyện Ba Tri Hình 2.3. Nuôi vịt thả đồng tại huyện Ba Tri Qua báo cáo tình hình chăn nuôi vịt của Chi Cục Thú y tỉnh Bến Tre năm 2006, cho thấy các huyện Ba Tri, huyện Thạnh Phú và huyện Châu Thành có tình 6 hình chăn nuôi vịt, quy mô các đàn vịt, phương thức chăn nuôi vịt của người dân tương đối đại diện cho việc chăn nuôi vịt của tỉnh. 2.2. Bệnh cúm gia cầm Cúm gia cầm (viết tắt là CGC) thể độc lực cao là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, mạnh ở gia cầm. Với tính chất nguy hiểm của bệnh, CGC được Tổ chức Dịch tễ Thú y thế giới xếp bệnh này vào bảng A – bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm (Trương Văn Dung, 2008). Các loài chim đóng vai trò quan trọng trong dịch tễ học của bệnh bởi vì tất cả các typ phụ của vi rút cúm A đã biết đều lưu hành trong các chim hoang, đặc biệt là các loại thuỷ cầm. Vi rút CGC thường không làm cho chim hoang bị bệnh nhưng có thể gây bệnh và giết chết gia cầm (Tô Long Thành, 2004). 2.3. Lịch sử bệnh Bệnh CGC được Perroncito phát hiện ở Italia vào năm 1878, lúc đó bệnh được mô tả như một “dịch bệnh” do vi rút gây ra ở gia cầm. Năm 1901, Centanni và Savonuzzi đã chứng minh bệnh là do vi rút gây ra. Đến năm 1955 bệnh đã được Achafer xác định là do vi rút cúm thuộc typ A thông qua các kháng nguyên bề mặt là H và N. Bệnh được Beard mô tả khá kỹ ở Mỹ vào năm 1971 qua đợt dịch cúm khá lớn trên gà tây, các năm tiếp theo bệnh được phát hiện lần lượt ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Nam Phi, Trung Cận Đông, Châu Âu, Vương Quốc Anh và Liên Xô cũ, bệnh xuất hiện đầu tiên ở nước ta vào cuối tháng 12 năm 2003 (Lê Văn Năm, 2004). 2.4. Căn bệnh 2.4.1. Phân loại Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là loại vi rút ARN. Vi rút được chia ra làm 3 nhóm (vi rút cúm A, B và C) dựa trên bản chất kháng nguyên protein M của vỏ và nucleoprotein của vi rút. Tất cả các vi rút gây bệnh cúm tác động lên gia súc, gia cầm (ngựa, heo, gia cầm) đều thuộc vi rút typ A, vi rút thuộc typ này cũng thường gây nên những bệnh dịch nghiêm trọng trên người. Các vi rút cúm được phân loại thành các subtyp theo các kháng nguyên của haemagglutinin (H) và neuraminidase (N) trên bề mặt của chúng. Vi rút cúm A có 16 subtyp 7 haemagglutinin và 9 subtyp neuraminidase. Vi rút cúm gia cầm có tất cả các subtyp này (Alexander, 2000). 2.4.2. Hình thái Vi rút CGC thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Influenza vi rút typ A, có dạng đa hình thái, đường kính khoảng 80 – 120 nm, nhiều khi virion có dạng kéo dài hình sợi, đôi khi dài đến vài μm. Vỏ vi rút có bản chất protein. Nucleocapsid bao bọc lấy nhân vi rút là tập hợp của nhiều protein phân đoạn, cấu trúc đối xứng xoắn, 130 – 150 nm. Hệ gen của vi rút là ribonucleic axit (RNA) một sợi, có cấu trúc là sợi âm. Hệ gen phân chia làm 68 đoạn, mỗi phân đoạn là một gen tương ứng với mỗi loại protein của vi – rút, minh họa ở hình 2.4 và 2.5. Cấu trúc từ ngoài vào trong bao gồm: Màng lipid: hai lớp, có nguồn gốc từ màng nguyên sinh chất của tế bào vật chủ. Protein bề mặt bao gồm: H (hemagglutinin): hình gậy; N (neuraminidase): hình nấm. M1 (matrix protein): nằm xếp ngay dưới màng lipid, gắn kết với những ribonucleoprotein (RNPs) ở bên trong, quyết định hình dạng của vi rút. Tám đoạn nucleocapsid đối xứng hình xoắn ốc, có kích thước khác nhau (từ 8902341 nucleotide) tạo nên genome của vi rút. Ngoài ra còn có phức hợp enzym transcriptase gắn kết với các chuỗi nucleocapsid, bao gồm: PB1, PB2 (polymerase kiềm) và PA (polymerase axít) Các protein không cấu trúc NS1, NS2 (Non structure): NS2 nằm rải rác ngay dưới M (matrix protein) và SN1, không phải là thành phần cấu trúc của vi rút nhưng cũng được tìm thấy ở những tế bào vật chủ khi vi rút nhân lên. 8 Hình 2.5. Hạt vi rút cúm nhuộm âm cực dưới kính hiển vi điện tử quét (Nguồn: CDCMurphy., Public Health Image Library) 2.5. Dịch tễ học 2.5.1. Phân bố địa lý Vi rút cúm gia cầm phân bố rộng khắp thế giới, đã được phân lập ở châu Phi, Châu Á, Úc, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ. Nguồn vi rút cúm gia cầm phổ biến nhất là các loài chim thuộc bộ Anseriformes và Charadriiformes (chim cánh cụt, mồng biển, nhạn biển). Các loài này nhiễm vi rút cúm gia cầm không gây bệnh (vi rút độc lực thấp), ngoại trừ tỷ lệ chết cao trên nhạn biển ở Nam Phi vào năm 1961. Hình 2.4. Mô hình vi rút cúm A H5N1 (Nguồn: Russell Kightle Media: Scientific Illustration) 9 2.5.2. Loài cảm thụ Vi rút gây nhiễm tự nhiên cho gia cầm nuôi và hoang dã (bao gồm gà, gà tây, vịt, ngỗng, cút, chim trĩ, đà điểu, gà nhật, mòng biển, chim biển...), bao gồm các loại sống dưới nước, hoặc trên cạn. Vi rút CGC gây bệnh trên tất cả các loại gia cầm và trên tất cả các lứa tuổi khác nhau (Taisuke và Yoshihiro, 2001). Người ta đã phân lập được vi rút CGC từ hơn 90 loài gia cầm sống tự do thuộc 13 bộ khác nhau: Anseriformes (vịt ngỗng, thiên nga), Charadriiformes (mồng biển, nhạn biển), Ciconiiformes (con diệc, cò quăm), Columbiformes (bồ câu), Falconiformes (chim ăn thịt), Galliformes (gà gô, chim trĩ), Gaviiformes (chim lặn gavia), Gruiformes (chim sâm cầm, gà nước), Passeriformes (chim sẻ, chim sâu), Pelecaniformes (chim cốc), Piciformes (chim gõ kiến), Podicipediformes (chim lặc), và Procellariiformes (chim hải âu). Ngoài ra, vi rút còn gây bệnh cho cá voi, hải cẩu, chồn,… ngay cả người. Trong nghiên cứu thí nghiệm vi rút cúm gia cầm có thể nhiễm cho heo, chuột cống, thỏ, chuột lang, chồn hương, chuột nhắt, mèo, động vật linh trưởng và con người (Swayne và ctv, 2003). 2.5.3. Đường truyền lây Vi rút cúm gia cầm được bài thải ra môi trường từ mũi, miệng, kết mạc, lỗ huyệt gia cầm bệnh vì vi rút nhân lên trong cơ quan hô hấp, ruột, thận, sinh dục. Vi rút lây lan do tiếp xúc trực tiếp giữa gia cầm mẫn cảm và gia cầm bệnh hay tiếp xúc gián tiếp thông qua không khí hay do con người (quần áo, giày dép…) trang thiết bị (dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển…) nhiễm vi rút. Tuy nhiên có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến việc lây nhiễm vi rút như: giới hạn phân bố địa lý, sự trộn lẫn giữa các loài, mật độ chăn nuôi, tuổi loài cầm, thời tiết khí hậu… Nguồn khởi đầu mang vi rút cúm vào các trại gia cầm thương phẩm thường từ 4 nguồn: gia cầm khác nuôi trong trại, thủy cầm di trú (chim hoang), heo và chim kiểng. Sự truyền lây theo chiều ngang của vi rút cúm gia cầm thường xảy ra nhưng hiện nay thiếu bằng chứng về truyền lây theo chiều dọc. Tuy nhiên, trên gà mái bị nhiễm vi rút cúm gia cầm, người ta có thể phân lập được vi rút trên vỏ 10 trứng và từ thành phần bên trong trứng (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004; Tô Long Thành, 2004). Đường gây bệnh thành công trong thí nghiệm bao gồm: khí dung, trong mũi, trong khí quản, miệng, kết mạc, trong cơ, trong xoang bụng, túi khí, mạch máu, lỗ huyệt. 2.5.4. Cơ chế sinh bệnh Đầu tiên vi rút xâm nhập qua đường hô hấp hay tiêu hóa và nhân lên trên tế bào niêm mạc, sau đó vi rút theo hệ thống mạch máu hay bạch huyết gây nhiễm trùng huyết và nhân lên ở các cơ quan nội tạng, não và da. Những biểu hiện lâm sàng và chết xảy ra do hư hoại của các cơ quan. Sự tổn hại do vi rút cúm gây ra là kết quả của một trong 3 tiến trình: (1) Việc nhân lên trực tiếp của vi rút trong tế bào, mô và cơ quan. (2) Ảnh hưởng gián tiếp từ sự sản sinh chất trung gian như cytokine. (3) Nghẽn mạch cục bộ do huyết khối. Đối với vi rút có độc lực thấp thì việc nhân lên thường giới hạn ở đường hô hấp và tiêu hóa. Gia cầm có biểu hiện bệnh và chết đa số thường do tổn hại cơ quan hô hấp đặc biệt khi kèm theo nhiễm trùng thứ phát. 2.5.5. Sự nhân lên của vi rút trong động vật ký chủ Trong cơ thể thủy cầm, loại ký chủ được coi là ký chủ lưu trữ vi rút (Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2004), vi rút cúm chỉ gây bệnh nhẹ trên niêm mạc ruột trong vòng 3 ngày sau khi nhiễm và sau đó bị loại thải hết khỏi cơ thể. Đối với vi rút H5N1 dòng châu Á, người ta đã chứng minh, vi rút này gây bệnh lâm sàng và thậm chí gây chết cho thủy cầm sau khi gây bệnh hệ thống (vi rút xâm nhập vào tất cả các cơ quan trong cơ thể mà chủ yếu là não, gây ra tử vong cho thủy cầm). Thời gian hiện diện của vi rút cúm H5N1 trong cơ thể thủy cầm cũng lâu hơn, trung bình 14 ngày, lâu nhất 17 ngày. Thời gian hiện diện trong cơ thể của gia cầm phụ thuộc vào mức độ miễn dịch của gia cầm, mức độ độc của vi rút. 11 2.6. Chất chứa căn bệnh và bài thải vi rút CGC Vi rút có trong phân, chất độn chuồng, trong nước ao hồ, trong không khí chuồng nuôi, chất thải từ lò ấp, phòng thí nghiệm, cơ sở kinh doanh trứng. Trong 1 g phân có chứa tới 107 hạt vi rút gây nhiễm (Alexander, 2000), các loài chim hoang dã là nguồn lưu giữ vi rút rất quan trọng. Từ chim hoang dã, vi rút có thể biến thành chủng có độc lực cao lây truyền sang gia cầm nuôi. Các loại thuỷ cầm có thể mang bệnh và thải vi rút ra bênh ngoài nhưng không có biểu hiện lâm sàng. Sau khi vào cơ thể chỉ 1 – 2 ngày sau là vi rút được thải ra ngoài theo phân, nước mũi và miệng. Vi rút tồn tại khá lâu trong các chất hữu cơ như phân gà (30 – 35 ngày ở 40C và 7 ngày ở 200C), các nguồn thức ăn, nước uống bị ô nhiễm vi rút có khả năng tồn tại hàng tuần, đây chính là chất chứa mầm bệnh nguy hiểm đối với không những gà mà vịt, ngan mà cả các loài động vật khác (Lê Văn Năm, 2004a). 2.7. Miễn dịch chống bệnh cúm gia cầm Cũng như miễn dịch chống lại các bệnh khác, miễn dịch chống bệnh cúm bao gồm miễn dịch tự nhiên và miễn dịch đặc hiệu. 2.7.1. Miễn dịch tự nhiên Miễn dịch là trạng thái đặc biệt của cơ thể không mắc phải tác động có hại của yếu tố gây bệnh, trong khi đó các cơ thể cùng loài hoặc khác loài lại bị tác động trong điều kiện sống như nhau. Gia cầm cũng như các vật sống khác có cơ chế phòng chống tự nhiên (Tizard, 1982). Những hàng rào vật lý như da hoặc hệ lông nhầy bình thường ngăn cản tác nhân gây bệnh vào cơ thể. Đối với mầm bệnh lần đầu xâm nhập vào cơ thể, sự phòng thủ đầu tiên của ký chủ sẽ do cơ chế miễn dịch tự nhiên như các tế bào thực bào, bổ thể và các tế bào diệt tự nhiên quyết định. Các tế bào tham gia quá trình thực bào bao gồm: Tiểu thực bào, quan trọng nhất là bạch cầu đa nhân trung tính chiếm 60 70 % tổng số bạch cầu ở máu ngoại vi, nó thực bào những phần tử nhỏ và vi khuẩn ngoài tế bào. Đại thực bào là các tế bào lớn có khả năng thực bào, khi được hoạt hóa nó sẽ nhận biết và loại bỏ các vật lạ, ngoài ra nó còn giữ vai trò quan trọng trong sự 12 trình diện kháng nguyên tới tế bào T và kích thích tế bào T sản sinh ra IL1. Đại thực bào còn tiết ra interferol có hoạt tính kháng vi – rút, lysozyme và các yếu tố khác có tác dụng kích thích phản ứng viêm. Các bổ thể là phần quan trọng và nhạy cảm của hệ phòng thủ chống lại mầm bệnh hiện diện trong huyết tương của gia cầm. Bổ thể có tác dụng làm tan màng vi khuẩn, làm tăng khả năng thực bào của đại thực bào, opsonin hóa. Bổ thể còn có vai trò nhất định trong cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (Suarez và Schultz, 2000). Interferol: do nhiều loại tế bào tiết ra nhưng nhiều nhất là tế bào diệt tự nhiên, khi Interferol được sản sinh ra, nó gắn vào tế bào bên cạnh và cảm ứng tế bào đó sinh ra protein kháng vi – rút, làm cho vi – rút xâm nhập vào trong tế bào nhưng cũng không nhân lên được (Suarez và Schultz, 2000). Những tế bào diệt tự nhiên của gia cầm là tế bào lympho hạt lớn và gây lên sự phá hủy của tế bào dích gắn kháng thể. Ở gia cầm, tế bào diệt tự nhiên có thể tái tạo ở nhiều nơi như lách, máu và ruột…là một phần của hệ thống phòng vệ (Tizard, 1982). 2.7.2. Miễn dịch đặc hiệu Những mầm bệnh vượt qua hàng rào vật lý hoặc cơ chế phòng vệ miễn dịch tự nhiên sẽ kích thích một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, miễn dịch đặc hiệu có tính đặc hiệu cao đối với tác nhân kích thích đặc hiệu. Đáp ứng của kháng thể khi gặp kháng nguyên lần đầu tiên được gọi là đáp ứng tiên phát (sơ cấp). Một số tế bào lympho sau khi nhận biết kháng nguyên sẽ thành thục thành tế bào lympho nhớ và những tế bào nhớ có đáp ứng đối với lần phơi nhiễm sau đối với cùng mầm bệnh bằng cách kích thích một đáp ứng miễn dịch có tính đặc hiệu cao và rất nhanh chóng (Tizard, 1982). Tính hiệu quả chống bệnh của một vắc – xin phụ thuộc vào các phản ứng của hệ miễn dịch với vắc – xin. Tế bào T là tế bào chính của miễn dịch trung gian tế bào, nhận biết kháng nguyên lạ sau khi kháng nguyên đã được xử lý bởi các tế bào trình diện kháng nguyên, đáp ứng tế bào lympho T gây độc có thể làm giảm sự bài thải các vi – rút có độc lực thấp (LPAI) nhưng triệu chứng có khả năng bảo vệ chống lại các vi – rút có độc lực cao (HPAI). Swayne (2003) nhận thấy có sự giảm đáp ứng tế 13 bào lympho T ở những vịt được gây nhiễm thực nghiệm chủng vi – rút AMallardOhio18486. Theo Seo và ctv (2001) nghiên cứu cho thấy vi – rút H9N2 có khả năng bảo hộ chéo chống lại vi – rút H5N1 thông qua miễn dịch tế bào. Miễn dịch dịch thể Do các tế bào lympho B đảm nhận, các tế bào bắt nguồn từ tế bào nguồn ở tủy xương đi tới túi Fabricius, ở đây chúng được biệt hóa để trở thành các lympho B, sau đó di tản đến các cơ quan lympho ngoại biên. Các tế bào lympho B khu trú ở các tâm điểm mầm và vùng tủy của lách, hạch lâm ba. Trong hạch lâm ba, các tế bào lympho B có thể gặp một kháng nguyên và nhận biết kháng nguyên đó bởi các kháng thể có trên bề mặt của chúng. Tế bào B có thể nhận dạng kháng nguyên khi nó tương tác với globulin miễn dịch nhô ra trên bề mặt tế bào. Sau khi đã nhận biết kháng nguyên và được kích thích bởi các cytokines do tế bào T tiết ra, các tế bào lympho B được biệt hóa thành tương bào để sản sinh kháng thể (Tizard, 1982). Chúng tiết ra các loại globulin miễn dịch (Ig) gồm có 3 lớp chính là IgM, IgG, IgA. IgG của gia cầm lớn hơn của động vật có vú nên thường được gọi là IgY. Đáp ứng của kháng thể khi gặp kháng nguyên lần đầu tiên được gọi là đáp ứng tiên pháp (sơ cấp). Sau khi xuất hiện vài ngày, hàm lượng kháng thể trong máu mới tăng và các kháng thể đầu tiên chủ yếu là IgM, đáp ứng tiên phát cũng có thể có IgG nhưng với hàm lượng thấp. Kháng thể dịch thể chỉ có tác dụng với vi – rút khi nó còn ở ngoài tế bào, lớp IgM và IgG kết hợp với vi – rút với sự tham gia của bổ thể làm tiêu diệt vi – rút, 2 lớp kháng thể này còn ngăn vi – rút không cho kết hợp với thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ, ngăn cản sự hòa màng giữa vỏ vi – rút và màng tế bào. Kháng thể dịch thể có thể hiện diện trong các loại dịch trong cơ thể nhưng thường được xác định trong huyết thanh. IgA là Ig quan trọng nhất trong miễn dịch thuộc màng nhầy và tập trung nhiều nhất ở các bề mặt nhầy. IgA bảo vệ màng nhầy chống lại các mầm bệnh đặc 14 biệt là vi – rút bằng cách trung hòa và ngăn cản sự liên kết của chúng với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào đích, không cho vi – rút xâm nhập vào trong. IgG của gia cầm lớn hơn của động vật có vú, thường được gọi là IgY, IgY có thể là tiền chất tổ tiên của IgE và IgG của động vật có vú. IgM được tìm thấy trên bề mặt của hầu hết các tế bào B và là kháng thể được sản xuất ra đầu tiên trong phản ứng miễn dịch sơ cấp. Sau đó các tế bào chuyển sang sản xuất IgG hoặc IgA. Khả năng gắn kết kháng nguyên của các kháng thể không thay đổi hoặc sau khi chuyển lớp. Các cytokin IL4, TGFβ và IFNy kích thích tế bào B trải qua sự chuyển lớp (Tizard, 1982). Một đáp ứng miễn dịch điển hình của gia cầm bắt đầu bằng sự sản xuất ra IgM, sau vài lần đáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgY, IgG là kháng thể chính sinh ra trong miễn dịch thứ phát và chiếm ưu thế trong máu gia cầm. Kháng thể IgA dường như rất yếu. Vịt thường có đáp ứng miễn dịch yếu và thiếu kháng thể kháng nguyên HA cả trong trường hợp nhiễm tự nhiên và gây bệnh thực nghiệm. Nếu chúng ta so sánh mức độ đáp ứng miễn dịch đối với vi – rút cúm gia cầm ở các loài gia cầm thì chúng được sắp xếp như sau: Gà >> Gà lôi >> Gà tây >chim cút > vịt (Tizard, 1982). Cơ chế phòng vệ của kháng thể chống lại mầm bệnh Trung hòa: kháng thể trung hòa các kháng nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) cung cấp sự bảo vệ ban đầu chống lại bệnh. Những vi – rút bị trung hòa không thể bám vào điểm tiếp nhận bề mặt của tế bào đích và bởi vậy bị ngăn cản sự xâm nhập của vi – rút vào trong tế bào. Việc phòng hộ chống lại bệnh cúm gia cầm là kết quả của đáp ứng miễn dịch chống lại protein haemagglutinin và ở một mức độ nào đó chống lại protein neuraminidase. Các đáp ứng miễn dịch chống lại các protein bên trong như nucleoprotein và matrixprotein của vi – rút đã được chứng minh là không có tác dụng phòng hộ. Cũng chính vì thế không có một loại vắc – xin nào dùng chung cho tất cả các vi – rút cúm gia cầm. Trên thực tế, sự phòng hộ được tạo ra nhờ các suptyp haemagglutinin có trong vắc – xin (Suarez và Schultz, 2000). 15 Hoạt động của bổ thể: có tác dụng làm tăng khả năng thực bào của đại thực bào, opsonin hóa. Bổ thể gắn với receptor của thể thực bào, kích thích cho sự thực bào và phân hủy mầm bệnh. Ngoài ra, bổ thể cũng có vai trò nhất định trong cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Trong nhiều trường hợp, sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể cần sự có mặt của bổ thể. Các kháng thể tồn tại trong cơ thể trong một thời gian nhất định. Tuy vậy phải một thời gian sau khi kháng nguyên kích thích, thường là 57 ngày thì kháng thể mới xuất hiện. Hàm lượng kháng thể sẽ đạt tới đỉnh cao nhất và sẽ được duy trì trong một thời gian rồi sau đó giảm dần (Tizard, 1982). Miễn dịch vô trùng là trạng thái tại đó cơ thể được bảo hộ hoàn toàn chống lại sự lây nhiễm mầm bệnh. Khả năng miễm dịch vô trùng đối với vi – rút cúm không thể có trong thực tế sản xuất. Trong thực tế, vắc – xin làm giảm sự nhân lên của vi – rút gây bệnh trong đường hô hấp và đường tiêu hóa, gián tiếp làm giảm sự bài thải vi – rút ra môi trường và sự lan truyền vi – rút. Sự bảo hộ của vắc – xin đối với các đàn gia cầm trong sản xuất luôn thấp hơn những đàn gia cầm sạch được nuôi trong điều kiện thí nghiệm (Suarez và Schultz, 2000). Những yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành kháng thể Sự hình thành kháng thể và quá trình đáp ứng miễn dịch phụ thuộc rất nhiều yếu tố như trạng thái sức khỏe của cơ thể, điều kiện ngoại cảnh, sự chăm sóc nuôi dưỡng… Nhưng quan trọng hơn cả là phụ thuộc bản chất kháng nguyên. + Liều lượng kháng nguyên: lượng kháng nguyên đưa vào vừa đủ sẽ kích thích cơ thể sinh sản miễn dịch ở mức tối đa mà không gây ức chế và tê liệt miễn dịch. + Số lần đưa kháng nguyên vào cơ thể: tiêm nhắc lại vắc – xin có tác dụng tốt, kháng thể sinh ra niều hơn và được duy trì trong thời gian lâu hơn. + Chất bổ trợ: chất bổ trợ cho vào khi chế vắc – xin với mục đích giữ và duy trì lượng kháng nguyên lâu trong cơ thể nhờ đó tạo kích thích liên tục, đều đặn các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể ở mức cao và duy trì được lâu hơn. Những chất bổ trợ thường dùng là keo phèn, nhũ tương. 16 2.8. Chẩn đoán 2.8.1. Chẩn đoán lâm sàng Sốt cao, ho, thở nhanh, khó thở, chảy nước mắt, chảy nước dãi ở mỏ, phù đầu và mặt, xuất huyết ở vùng da không có lông, đặc biệt ở chân; da tím bầm, lông xù, đứng tụm một chỗ, khát nước, bỏ ăn và chết nhanh. Biểu hiện thần kinh như đi lại không bình thường, loạng choạng, run rẩy, ngoạy đầu, đi vòng quanh. Có thể dựa vào dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích của bệnh để có hướng chẩn đoán ban đầu và đưa ra các biện pháp phòng chống khẩn cấp thích hợp. Cần phân biệt với một số bệnh khác trên gia cầm như Dịch tả vịt, Tụ huyết trùng vịt … 2.8.2. Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm (1) Phát hiện kháng nguyên Bằng phương pháp huỳnh quang phát hiện nhanh vi rút cúm gia cầm trong mô. Phương pháp này ít được sử dụng bởi vì số lượng mẫu thực hiện trong một thời gian là rất ít. Dùng phương pháp kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên vi rút trong mô bằng kỹ thuật nhuộm immunoperoxidase (IPX). Phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và thời gian thực hiện dài. Phản ứng realtime RTPCR hiện nay được các phòng xét nghiệm sử dụng rộng rãi vì trong một thời gian xét nghiệm được nhiều mẫu và có độ nhạy cao. Đối với vi rút CGC hiện nay nhiều tác giả ở Việt Nam đã nghiên cứu, tìm hiểu đặc tính, giải mã bộ gen của vi rút như: Tô Long Thành (2004a), Lê Thanh Hòa (2004), Nguyễn Tiến Dũng (2004), Trương Văn Dung (2008). (2) Phát hiện kháng thể Phản ứng huyết thanh học: được dùng để chứng minh sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu đối với cúm gia cầm 7 ngày sau khi nhiễm. Có nhiều kỹ thuật được dùng để giám sát và chẩn đoán huyết thanh học như ELISA, HI, AGID. Huyết thanh nhiều loài có chứa các yếu tố ức chế không đặc hiệu có thể làm ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của HI và các test khác. Vì vậy huyết thanh phải được xử lý để làm giảm hoặc loại bỏ hoạt tính của các yếu tố này. Ngoài các yếu tố ức chế không đặc 17 hiệu trên, huyết thanh từ các loài gia cầm khác như gà tây, ngỗng có thể gây ngưng kết hồng cầu gà dùng trong phản ứng HI, do đó phải loại bỏ yếu tố này bằng cách xử lý trước huyết thanh với hồng cầu gà hoặc dùng hồng cầu trong phản ứng HI cùng loài với huyết thanh được kiểm tra (Swayne và ctv, 1998). ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm, chỉ thích hợp để kiểm tra trên gà và gà tây. Phát hiện kháng thể trong vòng 1 tuần sau khi nhiễm . Khuếch tán miễn dịch trên thạch (AGID – agar gel immunodiffusion): không phân biệt được các typ phụ (subtyp) của cúm gia cầm. Phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm 1 tuần sau khi nhiễm. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI haemagglatiantion inhibition) đặc hiệu cho serotyp. Phản ứng HI phát hiện kháng thể tồn tại một thời gian dài sau khi nhiễm. Phản ứng này thích hợp để kiểm tra mẫu huyết thanh cho thủy cầm. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFT immunofluorescent test): Phát hiện kháng thể kháng typ phụ N đặc hiệu. Hiện nay quy định của Cục thú y là sử dụng phương HI để kiểm tra mẫu huyết thanh các đàn gia cầm sau tiêm phòng vắcxin của chương trình tiêm phòng cúm gia cầm Quốc gia để đánh giá việc sử dụng vắcxin H5N1 Re1 của Trung Quốc (theo CV 431TYDT của cục thú y ngày 26 tháng 3 năm 2007). (3) Phân lập vi rút Phân lập trên trứng gà có phôi 911 ngày tuổi. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng rất nguy hiểm cho cán bộ xét nghiệm. Việc phân lập vi rút cúm chỉ được thực hiện trong phòng xét nghiệm B3 (phòng xét nghiệm an toàn sinh học bậc 3). 2.8.3. Kỹ thuật realtime RT – PCR Realtime RT PCR là phản ứng nhân bản DNA từ ARN đang xảy ra theo từng chu kỳ nhiệt, độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng DNA tạo thành. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được thực hiện qua điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gel khi phản ứng kết thúc. Realtime RT PCR thì cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản 18 ứng đang xảy ra. Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang này bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với mồi gọi là probe (mẫu dò). Máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phận phát hiện tín hiệu huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra, tín hiệu huỳnh quang được đo lường sẽ phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ (Bio – Rad Laboratories, Inc, 2001), minh họa ở hình 2.6. Hình 2.6. Cơ chế của phản ứng realtime RT PCR (Nguồn: www.Biorad.com) Real