Đang tải... (xem toàn văn)
Thông tư 13 2013 TT-BTNMT quy định quy trình kỹ thuật và định mức kinh tế-kỹ thuật trong phát hiện sinh vật biến đổi gen...
Cơng ty Luật Minh Gia BỘ TÀI NGUN VÀ MƠI TRƯỜNG Số: 13/2013/TT-BTNMT www.luatminhgia.com.vn CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc -Hà Nội, ngày 21 tháng 06 năm 2013 THÔNG TƯ QUY ĐỊNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT VÀ ĐỊNH MỨC KINH TẾ-KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT DEOXYRIBONUCLEIC Căn Luật Đa dạng sinh học số 20/2008/QH12 ngày 13 tháng 01 năm 2008 Quốc hội Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam; Căn Nghị định số 69/2010/NĐ-CP ngày 21 tháng năm 2010 an toàn sinh học sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền sản phẩm sinh vật biến đổi gen; Căn Nghị định số 21/2013/NĐ-CP ngày 04 tháng năm 2013 Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn cấu tổ chức Bộ Tài nguyên Môi trường; Theo đề nghị Tổng cục trưởng Tổng cục Môi trường, Vụ trưởng Vụ Kế hoạch Vụ trưởng Vụ Pháp chế; Bộ trưởng Bộ Tài nguyên Môi trường ban hành Thơng tư quy định quy trình kỹ thuật Định mức kinh tế - kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng axit deoxyribonucleic, QUY ĐỊNH: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Điều Ban hành kèm theo Thơng tư quy trình kỹ thuật Định mức kinh tế - kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic Điều Thơng tư có hiệu lực thi hành kể từ ngày 05 tháng 08 năm 2013 Điều Bộ trưởng, Thủ trưởng quan ngang Bộ, quan thuộc Chính phủ, Chủ tịch Ủy ban nhân dân tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương, Tổng cục trưởng Tổng cục Môi trường, Thủ trưởng đơn vị trực thuộc Bộ Tài nguyên Môi trường, Giám đốc Sở Tài nguyên Môi trường tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương tổ chức, cá nhân có liên quan chịu trách nhiệm thi hành Thơng tư này./ Nơi nhận: - Văn phòng Quốc hội; - Văn phòng Chủ tịch nước; - Văn phòng Chính phủ; - Văn phòng Trung ương Ban Đảng; - Tòa án nhân dân tối cao; - Viện kiểm sát nhân dân tối cao; - Các Bộ, quan ngang Bộ, quan thuộc Chính phủ; - Kiểm toán Nhà nước; - Ủy ban Trung ương Mặt trận Tổ quốc Việt Nam; - Cơ quan Trung ương đoàn thể; - HĐND, UBND tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương; - Cục kiểm tra văn QPPL (Bộ Tư pháp); - Các Thứ trưởng Bộ TN&MT; - Các đơn vị trực thuộc Bộ TN&MT, Website Bộ; - Cơng báo, Cổng Thơng tin điện tử Chính phủ; - Lưu VT, PC, TCMT (D) 200 KT BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Cách Tuyến LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn QUY TRÌNH KỸ THUẬT VÀ ĐỊNH MỨC KINH TẾ - KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT DEOXYRIBONUCLEIC (Ban hành kèm theo Thơng tư số 13/2013/TT-BTNMT ngày 21 tháng năm 2013 Bộ trưởng Bộ Tài ngun Mơi trường) Phần QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) Q trình phân tích định tính, định lượng ADN sinh vật biến đổi gen bao gồm 04 bước (chi tiết xem lại Phụ lục kèm theo Thông tư này): Bước 1: Tách chiết ADN; Bước 2: Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng ADN; Bước 3: Phát nhận dạng ADN sinh vật biến đổi gen phương pháp PCR; Bước 4: Định lượng ADN sinh vật biến đổi gen phương pháp realtime PCR (phản ứng PCR tức thời); Tách chiết ADN Theo TCVN 7606:2007 (ISO 21571), nguyên tắc việc tách chiết ADN bao gồm việc giải phóng ADN dung dịch hỗn hợp chất tinh ADN khỏi hỗn hợp Các bước để tách chiết ADN bao gồm: - Chuẩn bị dụng cụ hóa chất; LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn - Nghiền mẫu; - Tách chiết ADN; - Tinh ADN Có nhiều phương pháp để tách chiết ADN tùy thuộc vào nguồn gốc loại mẫu phẩm (động vật, thực vật hay vi sinh vật) có phương pháp tách chiết phù hợp Trong tập định mức kinh tế-kỹ thuật áp dụng phương pháp tách ADN đối tượng động vật, thực vật vi sinh vật, cụ thể sau: - Tách chiết ADN mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide); - Tách chiết ADN mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa phenol/cloroform; - Phương pháp chiết ADN nấm men và/hoặc nấm sợi thu từ thực phẩm dựa phenol/cloroform Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng ADN Chất lượng, số lượng tính nguyên vẹn mẫu ADN ảnh hưởng lớn đến kết phương pháp phân tích Theo TCVN 7606:2007 (ISO 21571), bước bước đánh giá chất lượng xác định hàm lượng ADN bao gồm: - Chuẩn bị dụng cụ hóa chất; - Điện di ADN gel agarose; - Xác định hàm lượng ADN máy quang phổ; - Phân tích xử lý kết Có phương pháp thơng dụng để xác định nồng độ ADN dung dịch: Phương pháp điện di phương pháp đo hàm lượng ADN quang phổ Phát nhận dạng ADN sinh vật biến đổi gen (định tính) thơng qua phản ứng chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR) Phương pháp PCR thông thường sử dụng để nhân đoạn gen sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho trình tự gen Trong trường hợp PCR sử dụng để phát nhận dạng sinh vật biến đổi gen hay PCR định tính Theo TCVN 7605:2007 (ISO 21569), bước để phát nhận dạng sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR bao gồm: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn - Chuẩn bị dụng cụ hóa chất; - Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen; - Tiến hành phản ứng PCR; - Phân tích xử lý kết điện di gel agarose Định lượng ADN sinh vật biến đổi gen kỹ thuật real-time PCR (phản ứng PCR tức thời) Theo tiêu chuẩn quốc tế ISO 21570, bước định lượng sản phẩm biến đổi gen kỹ thuật real-time PCR bao gồm: - Chuẩn bị dụng cụ hóa chất; - Xây dựng đường chuẩn ADN cho gen chuẩn (gen nội sinh) gen đích; - Tiến hành phản ứng real-time PCR; - Phân tích xử lý kết Phần ĐỊNH MỨC KINH TẾ - KỸ THUẬT Chương QUY ĐỊNH CHUNG Phạm vi điều chỉnh: Định mức kinh tế-kỹ thuật áp dụng để lập, giao kế hoạch tính đơn giá sản phẩm phục vụ lập dự tốn, tốn cơng trình, dự án, nhiệm vụ liên quan đến việc xác định sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic Đối tượng áp dụng: Định mức áp dụng cho quan, tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến xác định sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic Căn xây dựng định mức LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Định mức xây dựng theo: - Nghị định số 204/2004/NĐ-CP ngày 14 tháng 12 năm 2004 Chính phủ chế độ tiền lương cán công chức, viên chức lực lượng vũ trang; - Thông tư số 06/2005/TT-BLĐTBXH ngày 05 tháng 01 năm 2005 Bộ Lao động - Thương binh Xã hội hướng dẫn phương pháp xây dựng định mức lao động công ty nhà nước theo Nghị định số 206/2004/NĐ-CP ngày 14 tháng 12 năm 2004 Chính phủ; - Quyết định số 32/2008/QĐ-BTC ngày 29 tháng năm 2008 Bộ trưởng Bộ Tài việc ban hành chế độ quản lý, tính hao mòn tài sản cố định quan nhà nước, đơn vị nghiệp cơng lập tổ chức có sử dụng ngân sách nhà nước Định mức thành phần Định mức kinh tế - kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng ADN bao gồm định mức thành phần sau: 4.1 Định mức lao động công nghệ Định mức lao động công nghệ (sau gọi định mức lao động) thời gian lao động cần thiết để sản xuất sản phẩm Nội dung định mức lao động công nghệ bao gồm: a) Nội dung công việc: bao gồm thao tác thực bước công việc cho hoạt động phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng ADN b) Định biên: số lượng cấp bậc kỹ thuật bước công việc c) Định mức: thời gian lao động để sản xuất sản phẩm Đơn vị tính cơng nhóm/đơn vị sản phẩm; ngày cơng tính làm việc 4.2 Định mức vật tư thiết bị Định mức vật tư thiết bị gồm định mức dụng cụ, định mức thiết bị định mức vật liệu: a) Định mức dụng cụ: thời gian sử dụng dụng cụ cần thiết để sản xuất sản phẩm Thời hạn dụng cụ: xác định phương pháp thống kê, kinh nghiệm; đơn vị tháng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Mức sử dụng dụng cụ nhỏ, phụ tính 5% mức sử dụng dụng cụ tính định mức b) Định mức thiết bị: thời gian sử dụng thiết bị cần thiết để sản xuất sản phẩm Thời hạn (niên hạn tính khấu hao) thiết bị theo quy định Bộ Tài c) Định mức vật liệu: số lượng vật liệu cần thiết để sản xuất sản phẩm Mức vật liệu phụ, vụn vặt hao hụt tính 8% mức vật liệu tính định mức Định mức khơng quy định công việc khảo sát, thu thập mẫu Quy định chữ viết tắt TT Chữ viết tắt Nội dung viết tắt Định mức KT-KT BHLĐ Bảo hộ lao động TCVN Tiêu chuẩn Quốc gia ĐVT Đơn vị tính KS1 Kỹ sư bậc KS4 Kỹ sư bậc ADN Axít deoxyribonucleic RNA Axít ribonucleic CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Định mức kinh tế-kỹ thuật LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia 10 PCR 11 Real-time PCR www.luatminhgia.com.vn Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction) Phản ứng PCR tức thời Áp dụng định mức: Trong trình áp dụng Định mức kinh tế-kỹ thuật này, có vướng mắc phát bất hợp lý, đề nghị phản ánh Bộ Tài nguyên Môi trường để tổng hợp, điều chỉnh kịp thời Chương ĐỊNH MỨC KINH TẾ-KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXÍT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) Định mức lao động 1.1 Nội dung công việc Phương pháp phân tích dựa vào tính chất cụ thể trình tự ADN đích để xác định có mặt định lượng ADN có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen 1.2 Định biên: nhóm lao động gồm KS1 KS4 1.3 Định mức: công nhóm/mẫu Bảng số 01 TT Cơng việc Mức Tách chiết ADN 0,50 Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng ADN 0,25 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Phát nhận dạng ADN sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR 0,60 Định lượng ADN sinh vật biến đổi gen kỹ thuật realtime PCR 0,60 Định mức vật tư thiết bị 2.1 Định mức dụng cụ: ca/mẫu 2.1.1 Tách chiết ADN a) Tách chiết ADN mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB Bảng số 02 ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu) Áo BHLĐ 0,80 Giá để dụng cụ, hóa chất 60 0,20 Đồng hồ treo tường 48 0,20 Đồng hồ hẹn 24 0,07 Kính bảo hộ 0,80 Ống đong (loại 50, 100, 250 ml) ống 12 0,06 Hộp bảo quản mẫu 81 vị trí hộp 24 0,40 Khay đựng mẫu 45 vị trí 24 0,40 TT Danh mục dụng cụ LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Hộp đựng đầu tip 10 ml tiệt trùng hộp 24 0,40 10 Hộp đựng đầu tip 200 ml tiệt trùng hộp 24 0,40 11 Máy trộn mẫu (vortex) 60 0,02 12 Phích đá giữ mẫu 24 0,40 13 PIPETman loại ml 36 0,10 14 PIPETman loại 10 ml 36 0,10 15 PIPETman loại 100 ml 36 0,10 16 PIPETman loại 1000 ml 36 0,10 17 Bút viết 0,02 18 Bút viết kính 0,02 24 0,02 20 Chày, cối sứ 12 0,02 21 Đèn neon 40W 48 0,80 22 Máy hút ẩm kW 36 0,05 23 Máy hút bụi 1,5 kW 36 0,01 24 Quạt thơng gió 40W 12 0,13 19 Sổ hướng dẫn thí nghiệm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn a) Tách chiết ADN mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB Bảng số 11 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức Nitơ lỏng lít 0,50 CTAB (500 g/lọ) lọ 0,001 RNase (25 mg) lọ 0,02 Na2EDTA (500 g/lọ) lọ 0,002 Tris-Cl (500 g/lọ) lọ 0,0002 Cloroform lít 0,01 2-isopropanol lít 0,0015 Nước cất khử ion vơ trùng lít 0,02 Proteinase K (25 mg) lọ 0,05 10 Alpha amylase (100 mg) lọ 0,005 11 Ethanol lít 0,01 12 NaCl kg 0,0011 13 HCl 37% lít 0,005 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn 14 NaOH kg 0,001 15 Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi) túi 0,20 16 Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi) túi 0,04 17 Khẩu trang dùng lần (50 chiếc/hộp) hộp 0,08 18 Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi) túi 0,02 19 Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi) túi 0,02 20 Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,03 21 Ống eppendorf ml (1000 cái/túi) túi 0,005 22 Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,01 b) Tách chiết ADN mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa phenol/cloroform Bảng số 12 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức Nitơ lỏng lít 0,50 Natri dodecyl sulfat (SDS) 100 g lọ 0,025 RNase (12 mg) lọ 0,04 Na2EDTA (500 g/lọ) lọ 0,004 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Tris-Cl (500 g/lọ) lọ 0,002 Cloroform lít 0,0216 Phenol lít 0,025 Isoamyl alcohol lít 0,001 Nước cất khử ion vơ trùng lít 0,02 10 Proteinase K (25 mg) lọ 0,16 11 Acid acetic băng lít 0,001 12 Ethanol lít 0,02 13 Kali acetat kg 0,001 14 Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi) túi 0,2 15 Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi) túi 0,04 16 Khẩu trang dùng lần (50 cái/hộp) hộp 0,08 17 Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi) túi 0,02 18 Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi) túi 0,04 19 Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,03 20 Ống eppendorf ml (1000 cái/túi) túi 0,015 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia 21 Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn www.luatminhgia.com.vn lít 0,01 c) Tách chiết ADN nấm men nấm sợi thu từ thực phẩm dựa phenol/ cloroform Bảng số 13 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức RNase (25 mg) lọ 0,004 Na2EDTA(500 g/lọ) lọ 0,0006 Tris-CI (500 g/lọ) lọ 0,0002 Cloroform lít 0,0015 Phenol lít 0,0016 Isoamyl alcohol lít 0,0006 Nước cất khử ion vơ trùng lít 0,02 Natri dodecyl sulfat (SDS) 100 g lọ 0,012 Acid acetic glacial lít 0,001 10 Ethanol lít 0,003 11 Kali acetat kg 0,001 12 Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi) túi 0,10 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn 13 Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi) túi 0,10 14 Khẩu trang dùng lần (50 cái/hộp) hộp 0,08 15 Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi) túi 0,03 16 Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi) túi 0,02 17 Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,01 18 Ống eppendorf ml (1000 cái/túi) túi 0,01 19 Hạt thủy tinh 100 g lọ 0,01 20 Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,01 2.3.2 Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng ADN sinh vật biến đổi gen (tính cho mẫu) Bảng số 14 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức Tris-Cl (1000 g/lọ) lọ 0,02 Na2EDTA (500g/lọ) lọ 0,001 H3BO3 (500g/lọ) lọ 0,002 Glycerol (1000 ml/lọ) lọ 0,005 Bromophenol blue (5g/lọ) lọ 0,0005 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Nước cất khử ion vơ trùng lít 1,00 Ethidium bromide (10 mg/lọ) lọ 0,05 ống 0,05 Agarose (100 g/lọ) lọ 0,005 10 Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,01 11 Găng tay hộp 0,04 12 Parafilm (0,1 x 38m) cuộn 0,001 13 Đầu côn loại 10 ml (1000 cái/túi) túi 0,05 14 Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi) túi 0,02 15 Đầu côn loại 1000 ml (500 cái/túi) túi 0,05 16 Cuvet nhựa 5,00 17 Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,025 Thang ADN chuẩn kb (100 ml/ống) 2.3.3 Phát nhận dạng ADN sinh vật biến đổi gen: tính cho mẫu - sử dụng cặp mồi Bảng số 15 TT Danh mục vật liệu Các cặp mồi (Primers) ĐVT Mức nucleotide 0,005 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Taq polymerase (100 units/lọ) lọ 0,05 dNTPs 100 mM, 1ml/lọ lọ 0,005 Ethidium bromide (10 mg/Iọ) lọ 0,10 Tris Cl (500 g/lọ) lọ 0,08 EDTA (500g/lọ) lọ 0,002 Glycerol (1000 ml/lọ) lọ 0,0005 Bromophenol blue (5g/lọ) lọ 0,0005 Nước cất khử ion vơ trùng lít 1,50 10 Agarose (100 g/lọ) lọ 0,01 ống 0,1 lít 0,05 13 Găng tay (50 đôi/hộp) hộp 0,08 14 Khẩu trang (50 cái/hộp) hộp 0,08 15 Đầu côn loại 10 mI (1000 cái/túi) túi 0,05 16 Đầu côn loại 100 ml, 200 ml (1000 cái/túi) túi 0,04 17 Ống PCR 0,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,05 11 Thang ADN chuẩn kb (100 ml/ống) 12 Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn 18 Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,01 2.3.4 Định lượng ADN sinh vật biến đổi gen: tính cho mẫu Bảng số 16 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức nucleotide 0,005 trình tự nucleotide 0,005 Nước cất khử ion vơ trùng lít 0,005 LightCycle® Taqman Master CAT.No 04535286001 (bao gồm: FastStart Taq ADN Polymerase, đệm phản ứng, MgCl2 dNTP (dùng dUTP thay dTTP) kít 0,17 LightCycle® Uracil N-glycosylase (tối ưu) kít 0,02 Đầu loại 10 ml (1000 cái/túi) túi 0,02 Đầu côn loại 100, 200 ml (1000 cái/túi) túi 0,02 Ống eppendorf loại 1,5 ml (500 cái/túi) túi 0,02 hộp 0,18 lít 0,10 Các cặp mồi nucleotide Các trình tự nucleotide đặc hiệu chuỗi đánh dấu huỳnh quang Ống mao quản cho phản ứng real-time PCR (96 ống/hộp) 10 Hóa chất sát trùng tiêu chuẩn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn 11 Găng tay (dùng lần) hộp 0,06 12 Giấy A4 ram 0,02 13 Mực in hộp 0,004 14 Mực photocopy hộp 0,008 PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (Ban hành kèm theo Thơng tư số 13/2013/TT-BTNMT ngày 21 tháng năm 2013 Bộ trưởng Bộ Tài nguyên Môi trường) Tách chiết ADN Đối với động vật, thực vật vi sinh vật phương pháp tách chiết ADN áp dụng theo phương pháp khác nhau, sau: a) Phương pháp chiết ADN mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB Phương pháp sử dụng để chiết ADN từ thực vật loại chất có nguồn gốc từ thực vật, có khả loại bỏ hợp chất polysacarit polyphenol vốn có ảnh hưởng đến chất lượng ADN Phương pháp dùng cho loại chất khác Các bước tiến hành bản: - Nghiền mẫu thử thành dạng bột mịn cối chày sứ nitơ lỏng; - Phân giải mẫu nhiệt với có mặt CTAB, tùy thuộc vào loại chất nền, cần bổ sung thêm enzyme khác vào đệm chiết alpha amylaza để thủy LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn phân tinh bột, enzyme proteinaza-K để loại trừ protein enzyme Ribonucleaza để phân giải RNA; - Loại bỏ tạp chất polysacarit protein cloroform; - Kết tủa ADN isopropanol rửa ethanol b) Phương pháp chiết ADN từ mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa phenol/ cloroform Phương pháp dùng để chiết ADN khỏi loại chất khác Phenol thường thích hợp để biến tính protein phá hủy enzyme nucleaza Các bước tiến hành bản: - Nghiền mẫu thử thành dạng bột mịn cồi chày sứ nitơ lỏng; - Phân hủy mẫu có mặt natri dodecyl sulfat hàm lượng EDTA cao; tùy thuộc vào loại chất cần bổ sung thêm enzyme proteinaza-K để loại trừ protein enzyme Rnaza để phân giải RNA; - Loại bỏ tạp chất phân tử ưa mỡ, chất polysacarit, protein nuleaza phenol cloroform; - Kết tủa ADN cuối isopropanol rửa ethanol loại trừ muối cloroform dư c) Phương pháp chiết ADN mẫu sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật dựa phenol/cloroform Phương pháp mơ tả qui trình chiết tinh ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR từ nấm men nấm sợi, quần thể vi khuẩn phân lập Phương pháp thích hợp việc truy nguyên ADN từ sinh vật biến đổi gen loại chất phức hợp cao Việc phân lập vi khuẩn khỏi chất nền, nuôi cấy vi khuẩn tăng thu sinh khối tế bào, sau tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn phân lập cho kết tin cậy Các bước tiến hành bản: - Các vi khuẩn, nấm men nấm sợi bị phá vỡ ADN tách chiết đồng thời cách nghiền hỗn hợp Tris-phenol-cloroform-EDTA-SDS với tốc độ cao có mặt hạt thủy tinh; - Đối với phản ứng PCR định lượng cần ủ mẫu với Rnaza để phân giải RNA; LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn - Kết tủa ADN ethanol Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng ADN Hai phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN dung dịch: Phương pháp điện di ADN phân tách phương pháp điện di khn gel agarose dựa điện tích phân tử lượng Sau điện di, gel nhuộm dung dịch Ethidium bromide (EtBr), EtBr liên kết vào phân tử ADN kích thích ánh sáng UV phát huỳnh quang da cam Do lượng huỳnh quang tỉ lệ với lượng ADN tổng số, nên số lượng ADN có mẫu ước tính cách so sánh huỳnh quang tạo mẫu chưa biết với dãy định lượng chuẩn Đo hàm lượng ADN quang phổ Các acid nucleic dung dịch hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại 260 nm Vì ADN RNA nucleotide có độ hấp thụ cực đại 260 nm, nên ADN xác định máy đo quang phổ vùng cực tím dung dịch bị nhiễm nucleotide RNA Do RNA cần loại bỏ phương pháp thủy phân với enzyme RNase Các nucleotide oligonucleotide thu từ thủy phân RNA cần loại bỏ, không loại bỏ dẫn đến đánh giá thừa hàm lượng ADN mẫu thử Ngoài ADN xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV ADN xoắn đơn nên cần lưu ý đến hệ số hấp thụ tính tốn nồng độ Việc chuẩn máy đo quang phổ cần thực định kỳ cách đo nồng độ dung dịch ADN đối chứng Phát nhận dạng ADN sinh vật biến đổi gen (định tính) thơng qua phản ứng chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR) Nguyên tắc chung Phương pháp PCR dựa nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu đoạn ADN có trình tự bổ sung phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq ADN polymerase để khuyếch đại theo hàm mũ đoạn ADN đích lên hàng triệu lần PCR xem dịch đơn giản hóa q trình mã ADN mà trình xuất suốt thời kì phân chia tế bào PCR bao gồm bước chính: biến tính đoạn ADN, gắn mồi oligonucleotide tổng hợp, kéo dài mồi ADN polymerase Chu kì gồm bước lặp lặp lại nhiều lần, lần làm tăng gấp đôi số lượng sản phẩm ban đầu Sự khuếch đại tính theo cơng thức x(1+E)n với x số lượng mẫu ban đầu, E hiệu suất trình LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn khuếch đại, n chu kì phản ứng PCR Sau vài chu kì, sản phẩm tạo thành tính kích thước hai đầu cuối 5’ hai đoạn mồi Các phương pháp phát nhận dạng ADN sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR bao gồm phương pháp sau: Phương pháp đặc hiệu taxon - đích Taxon cấp phân loại, đơn vị phân loại Taxon đích đơn vị phân loại sinh vật biến đổi gen Đây phương pháp thơng thường để phát trình tự ADN taxon đích, thường lồi cấp phân loại nhỏ cao Các phương pháp dựa vào taxon đích để đánh giá có mặt, chất lượng số lượng ADN có nguồn gốc từ taxon đơi sử dụng đơn vị chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen Ví dụ trình tự nucleotide gen lectin Le1 đậu tương thu từ Ngân hàng liệu gen sử dụng làm gen đơn đặc hiệu xác định đặc hiệu taxon đích để phát thành phần từ đậu tương Phương pháp sàng lọc PCR để phát ADN sinh vật biến đổi gen Phương pháp sàng lọc PCR phương pháp phát yếu tố di truyền thông thường số sinh vật biến đổi gen (chẳng hạn gen khởi động, gen kết thúc số yếu tố di truyền quan tâm khác) Phương pháp sàng lọc nhanh đáng tin cậy số lượng lớn mẫu thử Phát sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR chủ yếu dựa vào cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter terminator Hầu hết trình tự ADN chuyển vào hệ gen thực vật điều khiển CaMV 35S promoter, có vài trường hợp sử dụng promoter biểu đặc hiệu phần chuyển hóa rễ, thân, hạt hay promoter cảm ứng Hiện nhiều trồng biến đổi gen cấp phép trồng mang 35S promoter T-Nos terminator (phân lập từ gen tổng hợp nopaline Agrobacterium tumefaciens) Một gen khác sử dụng phổ biến gen chọn lọc kanamycin nptII phân lập từ Escherichia coli transposon Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens virus khảm súp lơ (Cauliflower mosaic virus) nằm danh mục loài gây hại cho thực vật đặc biệt virus khảm súp lơ gây bệnh cho súp lơ gây bệnh cho thành viên khác thuộc họ Brassicceae (Cruciferae) họ Resedaceae Solanaceae Vì thế, kết dương tính từ mẫu Brassicaceae, Resedceae Solanaceae cần xử lý cẩn thận Để phân biệt nhiễm virus vật liệu biến đổi gen cần có phương pháp phát virus Đối với động vật biến đổi gen, thường promoter sử dụng có nguồn gốc từ động vật methallothionein (MT), thymidine kinase, b-actin, amylase, insulin, b-lactoglobulin, adiposite P2 từ virus động vật Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV) Tuy nhiên promoter có nguồn gốc từ LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn động vật dễ gây nhầm lẫn với promoter nội sinh vật chủ, nên promoter có nguồn gốc từ virus động vật sử dụng để sàng lọc có mặt ADN có nguồn gốc động vật Phương pháp nhận dạng cấu trúc đặc thù (event specific) để phát trình tự gen đích sản phẩm biến đổi gen Phương pháp sử dụng nhằm phát tổ hợp trình tự ADN đưa vào hệ gen vật chủ, cấu trúc tìm thấy dòng có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen Trường hợp để phát ngô T25/"LibertyLink" kháng lại thuốc diệt cỏ nhờ biến đổi gen nguyên liệu thô cách khuếch đại vùng nối trình tự ADN có nguồn gốc từ promoter 35S-CaMV gen pat (gen kháng thuốc trừ cỏ) Phương pháp không phân biệt giống ngô mà sử dụng để phát có mặt đoạn gen chuyển hạt ngơ Kích thước đoạn gen đích sau khuếch đại phản ứng PCR xác định kích thước sản phẩm PCR tương ứng với kích thước đoạn ADN đích dự kiến Các sản phẩm PCR phân tích xử lý phương pháp điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide Gel agarose 1,5 % thích hợp để phân tích sản phẩm PCR từ 150-1000 bp Thang ADN chuẩn có kích thước khoảng 0,1-10kb để phân biệt độ lớn đoạn nucleotide khác Định lượng ADN sinh vật biến đổi gen kỹ thuật real-time PCR Real-time PCR hiểu phản ứng PCR động (kinetic PCR) mà số liệu phân tích thu nhận thơng qua phản ứng PCR, mà nhân gen đặc hiệu việc phát sản phẩm kết hợp bước tiến hành thông qua việc sử dụng loại chất phát huỳnh quang phản ứng Cường độ huỳnh quang biểu thị nồng độ sản phẩm PCR tạo thành Phản ứng xác định sau điểm thời gian (hoặc chu kì PCR) mà nhân trình tự đích phát Giá trị biểu thị với tên gọi ngưỡng chu kì C t (cycle threshold), thời điểm mà cường độ huỳnh quang lớn giá trị huỳnh quang sở Lượng ADN đích nhân nhiều tín hiệu phát huỳnh quang nhanh, mà giá trị Ct thấp Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng loại thuốc nhuộm liên kết ADN sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, probe primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR) Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt gắn với module phát tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khuếch đại xảy Tín hiệu huỳnh quang đo phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại chu kỳ LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Trong phân tích định lượng ADN sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen, cần thiết phải xác định gen chuẩn - gen tham chiếu (là gen nội sinh sinh vật chuyển gen) để chuẩn hóa phương pháp Gen chuẩn phải phù hợp với điều kiện: i) trình tự có tính đặc hiệu cao; ii) có gen đoa bội, iii) biểu ổn định dòng khác loài Do real-time PCR định lượng cần có hai loại phản ứng cho gen đích cho gen tham chiếu Đối với phương pháp hiệu nhân mẫu chuẩn mẫu nghiên cứu coi Để dựng đường chuẩn gen đích cần tách chiết ADN tổng số mẫu chuẩn (là ADN tách chiết từ vật liệu chuẩn chứng nhận ADN sinh vật biến đổi gen hay ADN plasmid mang trình tự gen đích) mẫu đối chứng âm (vật liệu chuẩn biết khơng chứa trình tự gen đích) Ví dụ: phân tích định lượng ADN từ sản phẩm có nguồn gốc từ ngơ chuyển gen Bt11, để dựng đường chuẩn gen đích, ADN tổng số ngô chuyển gen Bt11 (100% Bt mẫu chuẩn chứng nhận hợp lệ) ngô không chuyển gen tách chiết định lượng Pha loãng ADN Bt11 thành mẫu (M1-M6) mang số gen đơn bội khác sau: M1:20000; M2:5000; M3: 1250; M4: 312; M5: 78; M6: 19 (được biết gen đơn bội ngơ có khối lượng 2,725 pg) Trộn ADN Bt11 pha loãng với ADN ngô không chuyển gen để đảm bảo lượng ADN mẫu Để dựng đường chuẩn gen tham chiếu - adh1, ADN tổng số ngô không chuyển gen tách chiết, định lượng pha loãng thành mẫu (S1-S6) mang số gen đơn bội khác sau: S1: 183486; S2: 61162; S3: 20387; S4: 6796; S5: 2265; S6:755 (được biết gen đơn bội ngô có khối lượng 2,725 pg) Hiệu chỉnh tính tốn kết Bằng cách sử dụng mẫu pha loãng với nồng độ biết để tạo đường chuẩn cho gen chuẩn gen đích Đường chuẩn thể mối quan hệ tuyến tính giá trị C t nồng độ ADN ban đầu, vào xác định nồng độ ADN mẫu nghiên cứu vào giá trị C t mẫu Đầu tiên, ta phải xây dựng đường chuẩn cho gen chuẩn gen đích Trong cột nồng độ ADN, cột lại số gen Để định lượng tỷ lệ phần trăm sinh vật biến đổi gen mẫu, cần thiết phải xác định giá trị số gen đích số gen chuẩn Tỷ lệ phần trăm (%) sinh vật biến đổi gen (GM) mẫu tỉ lệ % số gen đích so với số gen chuẩn, tính cơng thức sau: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn Tỷ lệ % sinh vật biến đổi gen = (số gen đích/số gen chuẩn) x 100./ LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 ... hành kèm theo Thơng tư quy trình kỹ thuật Định mức kinh tế - kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic Điều Thơng tư có hiệu lực thi... Tuyến LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7: 1900 6169 Công ty Luật Minh Gia www.luatminhgia.com.vn QUY TRÌNH KỸ THUẬT VÀ ĐỊNH MỨC KINH TẾ - KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG... sản phẩm; ngày cơng tính làm việc 4.2 Định mức vật tư thiết bị Định mức vật tư thiết bị gồm định mức dụng cụ, định mức thiết bị định mức vật liệu: a) Định mức dụng cụ: thời gian sử dụng dụng cụ