CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH TRONG CHUẨN ĐOÁN VI SINH I KHÁI NIỆM : Miễn dịch ? Miễn dịch (MD) trạng thái bảo vệ đặt biệt thể chống lại yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, độc tố vi sinh vật, phân tử lạ…) chúng xâm nhập vào thể CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH TRONG CHUẨN ĐOÁN VI SINH : CÁC PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT (AGGLUTINATION REACTIONS) a) Khái niệm: II Ngưng kết: Tương tác kháng thể kháng nguyên dạng hạt (particulate antigen) tạo thành cục Các kháng thể tạo phản ứng gọi ngưng kết tố Các phản ứng ngưng kết có nguyên tắc tương tự phản ứng kết tủa, chúng dựa vào liên kết chéo kháng nguyên đa hóa trị Giống dư thừa kháng thể kìm hãm phản ứng kết tủa, dư thừa kìm hãm phản ứng ngưng kết; kìm hãm gọi hiệu ứng tiền vùng (prozone effect) Hiệu ứng tiền vùng gặp nhiều thử nghiệm miễn dịch Một vài chế tạo nên hiệu ứng tiền vùng Đầu tiên, nồng độ kháng thể cao, số vị trí bắt cặp kháng thể vượt giới hạn số lượng epitop nhiều Dẫn đến hầu hết kháng thể bắt cặp với kháng ngun đơn hóa trị thay đa hóa trị Các kháng thể kết hợp đơn hóa trị khơng thể liên kết chéo kháng nguyên với kháng nguyên khác Hiệu ứng tiền vùng dễ dàng chẩn đoán việc thực thử nghiệm nhiều nồng độ kháng nguyên (kháng thể) khác Khi pha loãng đến nồng độ kháng thể tối ưu thấy mức độ ngưng kết cao Khi sử dụng kháng thể đơn dòng tượng tiền vùng xảy số lý Kháng huyết chứa nồng độ kháng thể cao kết hợp với kháng nguyên không gây ngưng kết; kháng thể gọi kháng thể khơng hồn tồn (incomplete antibodies) thường lớp IgG Ở nồng độ cao IgG, kháng thể khơng hồn tồn chiếm giữ hầu hết vị trí kháng nguyên Hiện tượng không thấy với ngưng kết kháng thể đơn dòng Sự thiếu hụt hoạt tính ngưng kết kháng thể khơng hồn tồn tính linh hoạt vùng lề (hinge region) bị giới hạn, làm khó khăn cho kháng thể chiếm lấy góc cần thiết cho liên kết chéo tối ưu epitop hai hay nhiều kháng thể dạng hạt Như lựa chọn, mật độ phân bố epitop hay vị trí vài epitop túi sâu kháng thể dạng hạt gây khó khăn cho kháng thể đặc hiệu cho epitop để ngưng kết kháng nguyên dạng hạt Có thể giải hai vấn đề bắng cách thử kháng thể khác nhau, chúng phản ứng với epitop kháng nguyên mà không xuất giới hạn b) Phân loại: Phản ứng kết tủa - Ngưng kết hồng cầu việc xác định kiểu máu (Hemagglutination Is Used in Blood Typing) Ngưng kết vi khuẩn dùng đẻ chẩn đoán nhiễm trùng (Bacterial Agglutination Is Used To Diagnose Infection)  Ngưng kết thụ động hữu ích với kháng ngun hòa tan (Passive Agglutination Is Useful with Soluble Antigens)  Phản ứng kết hợp bổ thể Phản ứng kết tủa: a Khái niệm:  Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan liều lượng chuẩn xuất kết tủa có liều lượng chuẩn nhìn thấy mắt thường Phản ứng dùng phổ biến để phát kháng nguyên có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát kháng thể có sẵn kháng ngun hòa tan đặc hiệu b Phân loại – ứng dụng: • Ngưng kết (phản ứng kết tủa ) hồng cầu việc xác định kiểu máu ( Hemagglutination Is Used in Blood Typing ) Các phản ứng ngưng kết thường thực để định loại tế bào hồng cầu (red blood cells - RBCs) (hình 3.6) Trong việc định kiểu kháng nguyên ABO, RBCs trộn phiến kính với kháng huyết với kháng nguyên nhóm máu A hay B Nếu kháng nguyên diện tế bào, chúng ngưng kết tạo thành dạng cục nhìn thấy phiến kính Việc xác định kháng nguyên diện RBCs người cho người nhận tảng cho việc lựa chọn nhóm máu thích hợp truyền máu Hình 3.6 Ngưng kết hồng cầu dùng kháng thể kháng tế bào hồng cầu cừu (SRBCs) Ống đối chứng (10) chứa SRBCs đọng lại thành cục Các ống thí nghiệm 1-9 chứa lượng SRBCs không đổi cộng với dãy huyết kháng SRBCs pha lỗng hai lần Ống có phản ứng ngưng kết hồng cầu dương tính [Louisiana State University Medical Center/MIP Courtesy of Harriet C W Thompson.] • Ngưng kết vi khuẩn dùng để chuẩn đoán nhiễm trùng ( Bacterial Agglutination Is Used To Diagnose Infection) Sự nhiễm khuẩn thường kích thích việc sản xuất huyết chứa kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn Sự diện kháng thể phát phản ứng ngưng kết vi khuẩn Huyết từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn với vi khuẩn pha lỗng thành dãy ống nghiệm sau vi khuẩn thêm vào Ống nghiệm cuối cho thấy ngưng kết nhận thấy phản ánh hiệu giá kháng thể huyết bệnh nhân Hiệu giá ngưng kết định nghĩa nghịch đảo độ pha loãng huyết cao gây phản ứng ngưng kết dương tính Ví dụ, dãy mẫu pha loãng hai lần độ pha lỗng 1/640 thấy có ngưng kết độ pha lỗng 1/1208 khơng, hiệu giá ngưng kết huyết bệnh nhân 640 Trong số trường hợp huyết pha lỗng tới 1/50.000 mà thấy ngưng kết vi khuẩn Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên dùng để chẩn đoán nhiễm khuẩn Bệnh nhân bệnh thương hàn ví dụ, cho thấy tăng đáng kể hiệu giá ngưng kết với Salmonella typhi Các phản ứng kết cung cấp cách để phân loại vi khuẩn Ví dụ, lồi vi khuẩn Salmonellakhác phân biệt phản ứng ngưng kết với rãnh loại kháng huyết Ngưng kết thụ động: a Khái niệm: Nhưng kết thụ động gọi phản ưng ngưng kết Phản ứng cần kháng ngun hữu hình Đó kháng ngun có kích thước lớn hồng cầu tế bào vi sinh vật b Phân loại - ứng dụng: • Ngưng kết thụ động hữu ích với kháng nguyên hòa tan (Passive Agglutination Is Useful with Soluble Antigens) Sự nhạy đơn giản phản ứng ngưng kết mở rộng với kháng nguyên hòa tan kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động Trong kỹ thuật tế bào hồng cầu gắn kháng nguyên cách trộn kháng nguyên hòa tan với tế bào hồng cầu xử lý với tannic acid chromium chloride, hai gia tăng khả hấp thụ kháng nguyên với bề mặt tế bào Huyết chứa kháng thể pha loãng thành dãy giếng đĩa, sau tế bào hồng cầu gắn kháng nguyên thêm vào giếng; ngưng kết đánh giá kích thước tế bào hồng cầu ngưng kết đáy giếng giống kiểu phản ứng ngưng kết (hình 3.6) Những năm gần đây, tế bào hồng cầu thay hạt tổng hợp hạt nhựa, giá thể cho phản ứng ngưng kết Khi mà kháng nguyên bắt cặp vào hạt nhựa hạt đem sử dụng đem bảo quản để dùng sau Việc sử dụng hạt tổng hợp mang lại nhiều lợi ích ổn định, đồng bền Hơn phản ứng ngưng kết thực hạt tổng hợp đọc nhanh hơn, thường đến phút hỗn hợp hạt với mẫu thử Dù tế bào hồng cầu hay hạt tổng hợp đa tiện lợi phản ứng ngưng kết dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền phát lượng nhỏ kháng thể (nồng độ ng/l) Phản ứng kết hợp bổ thể: a Nguyên lý: Kháng thể đặc hiệu với tham gia bổ thể gây ly giải tế bào vi khuẩn số tế bào động vật khác b Các giai đoạn tiến hành phản ứng kết hợp bổ thể: Gồm hai hệ thống: • • Kháng thể - kháng nguyên – bổ thể Hồng cầu cừu, huyết kháng hồng cầu cừu đun nóng để phá vỡ bổ thể Hệ thống 1: kháng thể - kháng nguyên – bổ thể Nếu kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể kết hợp vs bổ thể, nên bổ thể có dạng tự Do phản ứng khơng nhìn thấy nên phải làm hệ thống làm thị Hệ thông 2: bao gồm hồng cầu cừu, huyết kháng hồng cầu cừu đun nóng để phá vỡ bổ thể c Cơ chế: Nếu hệ thống kháng ngun đặc hiệu với kháng thể khơng kết hợp với bổ thể trạng thái tự do.khi thêm hệ thống vào phần phản ứng, hồng cầu cừu khơng bị tan: phản ứng dương tính  Ngược lại phản ứng xét nghiệm ( hệ thống ) kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể không kết hợp với bổ thể Khi thêm hệ thống 2, bổ thể tự kết hợp với hệ thống làm tan hồng cầu cừu: phan ứng âm tính  Kháng thể chống vi sinh vật (và độc tố chúng) trung hòa tác dụng gây hại tác nhân này; đồng thời hoạt hóa chúng đề đại thực bào ăn để bị tiêu diệt phản ứng ADCC; kháng thể hoạt hóabổ thể Các chức hiệu trung gian isotyp kháng thể khác Web: http://elearning.lrc-hueuni.edu.vn/coe/mod/resource/view.php?id=1477 CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA 1.Khái niệm : Phản ứng trung hòa: xảy kết tủa bao vây, trung hòa ngoại độc tố vi khuẩn bao vây virus Ví dụ: kết tủa bao quanh virut ngưng kết virut Nguyên lý: Kháng thể đặc hiệu có khả trung hoà độc tố vi sinh vật làm tính chất vi sinh vật sản phẩm 3.Phân loại : a) Phản ứng trung hòa độc tố: Khi tiêm vào thể động vật với liều lượng lớn độc tố hỗn hợp với lượng thích nghi kháng độc tố thích hợp vật khơng bị nguy hiểm Tính độc độc tố bị kháng độc tố trung hòa Phản ứng đặc hiệu (một độc tố trung hòa với kháng độc tố tương ứng Lượng kháng độc tố cần thiết để trung hòa lượng độc tố phụ thuộc vào cách thức hỗn hợp cấu trúc với tùy theo điều kiện thí nghiệm độc tố có khả kết hợp với kháng độc tố tỷ lệ khác Thay cho lượng độc tố biết vào lượng kháng độc tố để trung hòa, người ta cho lượng độc tố hai lần vào lượng kháng độc tố hỗn hợp khơng trung hòa động vật thí nghiệm Đó tượng Danysz Nếu cho nửa lượng độc tố vào kháng độc tố độc tố kết hợp với nhiều kháng độc tố số lượng phân tử kháng độc tố tự lại khơng đủ để trung hòa lượng độc tố lại b) Phản ứng trung hòa virus: Hiện tượng tế bào bệnh lý xuất lồi virus phát triển ni cấy tế bào phá hủy tế bào Đề tượng tế bào bệnh lý không xảy ta cho kháng thể virus vào đồng thời với virus virus bị trung hòa khơng nhân lên Phản ứng sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể huyết định kiểu virus.Mặt khác định lượng kháng thể virus huyết cách hỗn hợp kháng huyết với virus tiêm hỗn hợp vào nhóm động vật nhạy cảm Nếu động vật thử nghiệm khơng cho thấy triệu chứng bệnh diện kháng thể trung hòa chứng minh c)Phản ứng trung hòa enzyme: Nhiều enzyme vi khuẩn có tính chất sinh kháng tốt kích thích tạo thành kháng thể streptolysin O, streptokinase liên cầu khích động tạo thành kháng streptolysin O (antistreptolysin O - ASO), kháng streptokinase (anti streptokinase - ASK) Ta định lượng kháng streptolysin O (ASO), kháng streptokinase (ASK) có huyết bệnh nhân để chẩn đoán nhiễm liên cầu dựa nguyên tắc phản ứng trung hòa.Đặc biệt phản ứng ASO phát kháng thể kháng streptolysin O sử dụng chẩn đoán bệnh thấp tim viêm cầu thận cấp sau nhiễm liên cầu nhóm A PHẢN ỨNG ELISA I.PHẢN ỨNG ELISA : 1.Khái miệm : ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Nguyên tắc kĩ thuật ELISA giống kĩ thuật MD huỳnh quang, khác chỗ thay gắn kháng thể với thuốc nhuộm huỳnh quang người ta gắn kháng thể với enzyme Khi cho thêm chất thích hợp vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên, thong qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên cần phát Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học,nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an tồn chất lượng sản phẩm sinh học 2.Nguyên lý : Nguyên lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể gồm bước sau: (1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết gắn bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước "rửa" qua bề mặt Kháng thể gắn kết với enzyme; (3) Thêm vào chất (substance); enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu xác định Đối với ELISA phát quang, ánh sáng phát từ mẫu chứa KN-KT Sự diện phức hợp KN-KT định cường độ sáng phát Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định có mặt hay khơng có mặt lượng KN mẫu nghiên cứu http://vi.wikipedia.org/wiki/ELISA II.PHÂN LOẠI PHẢN ỨNG ELISA : ELISA trực tiếp (Direct ELISA ) : Đây dạng đơn giản phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) - Ưu điểm: Đơn giản - Nhược điểm: + Độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng ngun có epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitope + Phải đánh dấu cho kháng thể chuyên biệt với đối tượng ELISA gián tiếp (Indirect ELISA): Phương pháp khác Direct ELISA chỗ kháng thể bắt kháng ngun khơng gắn enzyme mà mục tiêu gắn đặc hiệu kháng thể khác (kháng thể kháng thể gắn với enzyme) - Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa - Nhược điểm: Độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ ELISA : - Nếu đối chứng âm cho kết dương tính nhiễm từ chất tạo màu từ kháng thể đánh dấu đối chứng bị nhiễm - Nếu màu không xuất đối chứng dương mẫu phải kiểm tra lại tất hố chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản -Nếu màu xuất thấp đối chứng dương mẫu kiểm tra phải kiểm tra lại kháng thể gắn enzyme nồng độ chất tạo màu -Nếu có tạo màu mẫu khơng tạo màu với đối chứng dương kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng điều kiện bảo quản -Khi chạy lại thử nghiệm điều kiện gặp cố nên thay đổi yếu tố thí nghiệm IV.ỨNG DỤNG : 1.Trong thực phẩm : Phương pháp elisa sử dụng để đánh giá dư lượng kháng sinh thủy sản Bảng Yêu cầu thị trường giới hạn phát phương pháp phân tích số kháng sinh cấm TT Kháng sinh cấm Chloramphenicol Malachite green/Leucomalachite green Furazolidone Furaltadone Nitrofurantoin Nitrofurazone Chỉ tiêu kiểm tra Chloramphenicol (CAP) Malachite green / Leucomalachite green (MG/LMG) 3-amino-2-oxazolidone (AOZ) 5-methylamorfolino-3amino-2-oxazolidone (AMOZ) 1-aminohydantoin (AHD) Semicarbazide (SEM) Giới hạn phát tối thiểu EU Mỹ Nhật 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb 2.0 ppb 2.0 ppb 2.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Trong nơng nghiệp : - Phân tích tồn dư quinolone (là nhóm kháng sinh tổng hợp hóa học có khả khuếch tán tốt mơ bào, nhanh chóng tiêu diệt vi khuẩn thơng qua ức chế AND.Tuy nhiên tác động xấu đến mơi trường sức khỏe người) tôm - Xác định số virus gây bệnh trồng Trong y tế : - Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp cho ELISA-IgM ELISA-IgG để chuẩn đoán bệnh sởi - Phân tích quan hệ phả hệ,vai trò truyền bệnh thành viên phức hợp Anophenes minimus Anophenes dirus thị di truyền (phân tích mối quan hệ di truyền,các quan hệ phả hệ quần thể loài thành viên phức hợp loài An.mininus An.dirus; xác định vai trò truyền bệnh sốt rét thành viên hai phức hợp loài An.mininus An.dirus kĩ thuật ELISA.) - Sự phát kháng nguyên Úc châu Blumberg nhận dạng kháng nguyên bề mặt virus B (HBsAg) tượng trưng ý nghĩa quan trọng xuyên phá để hiểu biết bệnh viêm gan viêm gan huyết Người ta biết việc sàng lọc kiểm tra diện kháng nguyên máu người hiến máu giảm thiểu cách đáng kể tỉ lệ nhiễm HB truyền máu  ...  Phản ứng kết hợp bổ thể Phản ứng kết tủa: a Khái niệm:  Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan liều lượng chuẩn xuất kết tủa có liều lượng chuẩn nhìn thấy mắt thường Phản. .. tố vi khuẩn bao vây virus Ví dụ: kết tủa bao quanh virut ngưng kết virut Nguyên lý: Kháng thể đặc hiệu có khả trung hồ độc tố vi sinh vật làm tính chất vi sinh vật sản phẩm 3.Phân loại : a) Phản. .. đáng kể hiệu giá ngưng kết với Salmonella typhi Các phản ứng kết cung cấp cách để phân loại vi khuẩn Ví dụ, lồi vi khuẩn Salmonellakhác phân biệt phản ứng ngưng kết với rãnh loại kháng huyết Ngưng