SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HCM TRUNG TÂM THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  BÁO CÁO PHÂN TÍCH XU HƯỚNG CƠNG NGHỆ Chun đề: XU HƯỚNG CƠNG NGHỆ PHÁT HIỆN DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỦY SẢN – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH Biên soạn: Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ TP HCM Với cộng tác của:  GS.TS Chu Phạm Ngọc Sơn Chủ tịch HĐKH, Công ty Sắc ký Hải Đăng  TS Phan Văn Tiến Trung tâm Nghiên cứu triển khai, Khu Công nghệ cao TP.HCM  ThS Bùi Quốc Anh Trung tâm Nghiên cứu triển khai, Khu Công nghệ cao TP.HCM TP.Hồ Chí Minh, 04/2014 -1- MỤC LỤC I TÌNH HÌNH NHIỄM KHÁNG SINH TRONG THỦY SẢN XUẤT KHẨU CỦA VIỆT NAM TRONG NHỮNG NĂM GẦN ĐÂY Thành tựu xuất thủy sản năm gần Tình hình nhiễm kháng sinh xuất thuỷ sản giai đoạn từ 2011-2014 II XU HƢỚNG CƠNG NGHỆ PHÂN TÍCH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG THỦY SẢN VÀ THỰC PHẨM TRÊN CƠ SỞ SỐ LIỆU SÁNG CHẾ QUỐC TẾ 11 Tình hình đăng ký sáng chế phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản thực phẩm theo thời gian 11 Tình hình đăng ký bảo hộ sáng chế phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản thực phẩm quốc gia 13 Các hướng nghiên cứu quan tâm nhiều phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản, thực phẩm theo bảng phân loại sáng chế quốc tế IPC 15 Nhận xét 19 III PHÂN TÍCH THUỐC THÚ Y THỦY SẢN BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS – THUẬN LỢI VÀ KHÓ KHĂN 20 Sử dụng hóa chất, kháng sinh sản xuất kinh doanh thủy sản 20 Kiểm định thuốc thú y thực phẩm 25 Những thuận lợi thiết bị phân tích 27 3.1 Thiết bị sắc ký lỏng siêu nhanh UPLC 27 3.2 Cải tiến đầu dò khối phổ: 29 Nhận danh định lượng chất khơng biết có mẫu 31 Một số thí dụ phân tích thuốc thú y cơng ty dịch vụ KH&CN Sắc Ký Hải Đăng 33 5.1 Phân tích Cơng ty EDC-HD Chloramphenicol thủy sản mua chợ siêu thị TP Hồ Chí Minh 33 5.2 Phân tích Nitrofurans tôm công ty EDC- HD 37 IV MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM DỰA TRÊN MIỄN DỊCH 43 Phương pháp phân tích khơng cạnh tranh 43 Phương pháp phân tích có cạnh tranh 43 Các dạng đánh dấu 44 3.1 Đánh dấu đồng vị phóng xạ 44 3.2 Đánh dấu enzyme 45 3.3 Đánh dấu phát quang hoá học 45 -2- 3.4 Đánh dấu huỳnh quang 45 Ưu nhược điểm phương pháp xét nghiệm dựa miễn dịch 46 4.1 Ưu điểm 46 4.2 Nhược điểm 46 V QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ENROFLOXACIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA CẠNH TRANH TRỰC TIẾP 47 Khái niệm ELISA 47 1.1 Phân loại ELISA 47 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy phản ứng ELISA 54 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết ELISA 54 Quy trình phân tích Enrofloxacin phương pháp ELISA cạnh tranh trực tiếp 55 2.1 Nguyên lý 55 2.2 Các bước tiến hành 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 -3- XU HƢỚNG CÔNG NGHỆ PHÁT HIỆN DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG THỦY SẢN - PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH ************************** I TÌNH HÌNH NHIỄM KHÁNG SINH TRONG THỦY SẢN XUẤT KHẨU CỦA VIỆT NAM TRONG NHỮNG NĂM GẦN ĐÂY Thành tựu xuất thủy sản năm gần đây: Ngày 1/4/1959, Chủ tịch Hồ Chí Minh thăm làng cá Cát Bà (TP Hải Phòng) Để ghi nhớ kiện này, ngày 18/3/1995, Thủ tướng Chính phủ định lấy ngày 1/4 năm Ngày truyền thống Ngành Thủy sản Việt Nam 55 năm xây dựng phát triển, nghề cá Việt Nam có bước tiến vượt bậc, góp phần quan trọng phát triển kinh tế - xã hội đất nước, với quy mô ngày sâu rộng, chiếm vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Diện tích ni thủy sản tăng qua năm, từ gần 500.000 (1990) đến triệu ha; sản lượng nuôi trồng tăng từ 23% (1990) lên 54% (2013), với hai sản phẩm chủ lực tôm cá tra Việt Nam có 567 nhà máy chế biến thủy sản quy mô công nghiệp đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm HACCP, GMP, SSOP; 400 nhà máy đơng lạnh có cơng suất 7.500 tấn; 415 nhà máy đủ tiêu chuẩn xuất sang EU, tăng 398 nhà máy so với năm 1999; nhiều nhà máy, vùng nuôi đạt chứng nhận tự nguyện GlobalGAP, ASC, BAP, BRC Đến nay, sản phẩm thủy sản Việt Nam vươn tới 170 thị trường, thị trường EU, Mỹ, Nhật, Úc; kim ngạch xuất năm 2013 đạt 6,7 tỷ USD, gấp 32 lần so năm 1990, trở thành nước xuất thủy sản lớn giới  10 thị trƣờng nhập thủy sản lớn Việt Nam năm 2013: Mỹ: Với giá trị nhập thủy sản 11 tháng năm 2013 đạt 1.382,865 triệu USD, tăng 23,8% so với kỳ 2012, Mỹ chiếm 22,2% tổng giá trị xuất thủy sản Việt Nam Là thị trường đứng đầu tôm (đạt 748,571 triệu USD, tăng 75,7%), cá tra (đạt 351,313 triệu USD, tăng 4,6%), cá ngừ (đạt 177,623 triệu USD, giảm 23,5%)… Việt Nam Tuy nhiên, năm 2013, Mỹ thị trường có nhiều "rắc rối" với tơm cá tra Việt Nam -4- EU: Năm 2013, giá trị nhập thủy sản Việt Nam vào thị trường tăng 2,88% so kỳ, với 1.074,458 triệu USD Hiện nay, EU chiếm 17,2% tổng giá trị xuất thủy sản Việt Nam Các sản phẩm như: tơm (369,566 triệu USD, tăng 28,9%), cá tra (353,657 triệu USD, giảm 9,7%), cá ngừ (126,252 triệu USD, tăng 24,8%)… Đặc biệt, EU thị trường nhập nhuyễn thể hai mảnh vỏ lớn Việt Nam, chiếm 69,4% tổng giá trị xuất khẩu, với 11 tháng đầu năm đạt 46,185 triệu USD, giảm 2,1% so với kỳ Nhật Bản: Với giá trị nhập đạt 1.048,563 triệu USD, tăng 3,4% so với kỳ, thị trường Nhật Bản chiếm 16,8% tổng giá trị xuất thủy sản Việt Nam Là thị trường tiêu thụ tôm (645,938 triệu USD, tăng 12,9%), mực, bạch tuộc (110,498 triệu USD, giảm 17,5%) lớn thứ hai cá ngừ (40,219 triệu USD, giảm 20,1%), mực, bạch tuộc (110,498 triệu USD, giảm 17,5%), nhuyễn thể hai mảnh vỏ (7,323 triệu USD, tăng 4,7%) lớn thứ ba Việt Nam… Tuy nhiên, rào cản Ethoxyquin mặt hàng tôm khiến cho xuất tôm sang thị trường không khởi sắc Trung Quốc Hồng Kông: Giá trị nhập đạt 518,851 triệu USD, tăng 39,1% so với kỳ, chiếm 8,3% tổng giá trị xuất thủy sản Việt Nam Trung Quốc thị trường tiềm thủy sản Việt Nam với số lượng lớn đa dạng: tôm (349,290 triệu USD, tăng 53,6%), cá tra (82,764 triệu USD, tăng 25,6%) Đây thị trường có tốc độ tăng nhập mạnh từ Việt Nam, liên tục với tỷ lệ số Năm 2013, trung bình tháng xuất thủy sản Việt Nam sang Trung Quốc đạt gần 45 triệu USD, riêng mặt hàng tôm đạt tới gần 28 triệu USD/tháng, chiếm tới 68% tổng giá trị xuất thủy sản Việt Nam Hàn Quốc: 11 tháng, giá trị nhập thủy sản Việt Nam đạt 454,871 triệu USD, giảm 1,8% so với kỳ Hàn Quốc thị trường tiêu thụ mặt hàng mực, bạch tuộc, chả cá surimi lớn Việt Nam Tuy nhiên năm nay, mặt hàng có xu hướng chững lại sụt giảm 11 tháng năm 2013, giá trị xuất mực, bạch tuộc đạt 123,339 triệu USD, giảm 8,1%; chả surimi đạt 81,557 triệu tấn, giảm 20,2% so với kỳ Tháng 12/2012, Hàn Quốc thông báo kiểm tra Ethoxyquin tôm nhập từ Việt Nam giới hạn 0,01 ppm Tuy nhiên, xuất tôm Việt Nam sang thị trường đạt 189,158 triệu USD, tăng 22,6% -5- ASEAN: 11 tháng năm 2013, giá trị nhập thủy sản Việt Nam nước ASEAN đạt 355,792 triệu USD, tăng 12,4% so với kỳ, chiếm 5,7% tổng giá trị xuất thủy sản Việt Nam Với sản phẩm như: tơm (369,566 triệu USD, tăng 38,0%), cá tra (114,206 triệu USD, tăng 12,9%), cá ngừ (33,194 triệu USD, giảm 4,6%)… Thái Lan, Singapore thị trường lớn khối nhập thủy sản (đặc biệt sản phẩm surimi) Australia: Hàng năm, Australia nhập 200.000 thủy sản, trị giá khoảng tỷ USD, Việt Nam nhà cung cấp lớn thứ ba sau New Zealand Trung Quốc Theo Hiệp hội Nhập Thủy sản Australia (SIAA), tôm mặt hàng thủy sản Việt Nam nhập nhiều vào Australia 11 tháng năm 2013, giá trị nhập thủy sản Việt Nam đạt 188,212 triệu USD, tăng 7,9% so với kỳ; đó, tơm chủ yếu, đạt 117,533 triệu USD, tăng 20,5% Brazil: 11 tháng năm 2013, giá trị nhập thủy sản Việt Nam Brazil đạt 107,185 triệu USD, tăng 57,2% so với kỳ Trong đó, cá tra mặt hàng với 106,042 triệu USD, tăng 56,0% Brazil thị trường nhập cá tra lớn thứ tư Việt Nam, sau Mỹ, EU ASEAN Tuy nhiên, theo doanh nghiệp, giá xuất cá tra sang thị trường năm 2013 khoảng 1,9 - 2,2 USD/kg, thấp 0,3 USD/kg so với năm 2012 Mexico: Giá trị nhập thủy sản Việt Nam đạt 95,651 triệu USD, giảm 3,0% so với kỳ Cá tra sản phẩm thủy sản Việt Nam thị trường này, 11 tháng năm 2013 đạt 87,056 triệu USD, giảm 3,6% Nhập cá tra Mexico thời gian gần sụt giảm sản lượng cá rô phi sản xuất nước dồi dào, giá ổn định nên người dân chuyển sang tiêu thụ sản phẩm nhiều Trong có, nhập cá ngừ nước lại tăng 3,3%, đạt 6,641 triệu USD Nga: 11 tháng đầu năm 2013, giá trị nhập thủy sản Việt Nam Nga đạt 86,246 triệu USD, giảm 2,9% so với kỳ Con số chưa thật gây ấn tượng lại mở hội nỗ lực chinh phục thị trường Nga, thị trường tiềm châu Âu Về sản phẩm xuất vào Nga, cá tra basa mặt hàng -6- chủ yếu, đó, sản phẩm chế biến từ cá tra basa fillet tươi ướp lạnh fillet khác chiếm tỷ trọng cao Tuy đạt thành tựu định, xuất Việt Nam gặp khơng khó khăn Từ việc cạnh tranh nước xuất thuỷ sản khác đến vấn đề an toàn thực phẩm xuất thuỷ sản Trong đó, việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, kiểm sốt khâu ni trồng làm uy tín trầm trọng thuỷ sản Việt Nam thị trường giới Theo kết báo cáo Tổ chức Phát triển Công nghiệp Liên Hợp Quốc (UNIDO) thị trường lớn EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Úc ệ ớc đứng đầu số vụ bị từ chối nhập sản phẩm thủy sản giai đoạn 2006-2010 cao so với nước nhập khác Tính trung bình từ 2006-2010, Mỗi năm Việt Nam thiệt hại 14 triệu USD hàng xuất thuỷ sản bị trả lại ( Chiếm 0.39% doanh thu trung bình từ 2006-2010 3.2 tỉ USD) Sau tóm tắt sơ lược tình hình nhiễm kháng sinh thuỷ sản xuất từ 2011-2013 -7- Tình hình nhiễm kháng sinh xuất thuỷ sản giai đoạn từ 20112014 Năm 2011: Mức độ số lượng lơ hàng bị nước ngồi cảnh báo năm 2011 khơng có dấu hiệu giảm bối cảnh Cục NAFIQAD áp dụng biện pháp kiểm soát tăng cường nhằm vào thành phẩm trước xuất khẩu, đặc biệt nửa số cảnh báo lây nhiễm kháng sinh cấm có nguồn gốc từ khâu nuôi trồng, tôm Điều đáng lưu ý cảnh báo nhiễm kháng sinh nước ngồi có loại kháng sinh bị cấm sử dụng ni trồng từ trước Chloramphenicol, Trifluralin Việc cho phép sử dụng số loại kháng sinh NTTS, kiểm sốt khơng tốt việc sản xuất, -8- lưu thơng chất bị cấm thiếu kiểm sốt đồng Nhà nước “chuỗi sản xuất”, doanh nghiệp lại chủ thể phải chịu trừng phạt (xử lý vi phạm) bị phát cảnh báo bối cảnh tuân thủ đầy đủ theo yêu cầu lấy mẫu kiểm nghiệm & cấp Chứng thư Cục NAFIQAD Điều không công bằng, mà đặt câu hỏi lớn tính hiệu biện pháp kiểm soát ATTP kháng sinh cần phải xem lại Nhìn vào thực tế lô hàng thủy sản xuất sang Nhật Trong năm 2011, có 140 lơ hàng thủy sản xuất Nhật bị quan có thẩm quyền Nhật cảnh báo, có đến 106 lơ hàng (tương đương 75,7 %) phát nhiễm kháng sinh (bao gồm trifluralin) 26 lô hàng bị cảnh báo tiêu khác vi sinh, tạp chất (tương đương 24,3%) Trong thực tế nay, nhà máy không sử dụng kháng sinh trifluralin trình chế biến mà nguyên nhân gây nhiễm tiêu đến từ khâu trước chế biến (nuôi trồng, khai thác, thu gom nguyên liệu) Như vậy, 1/4 lô hàng thủy sản xuất sang Nhật bị cảnh báo có nguy xuất phát từ nhà máy đến 3/4 lô hàng bị cảnh báo nguyên nhân nằm tầm kiểm soát doanh nghiệp Các doanh nghiệp chế biến kiểm sốt ngun liệu đầu vào cách lấy mẫu ngẫu nhiên để kiểm nghiệm hồn tồn khơng thể kiểm tra kháng sinh 100% ngun liệu Và doanh nghiệp dù có muốn khơng thể kiểm tra tồn q trình ni kiểm sốt việc sử dụng kháng sinh, hóa chất sở cung ứng nguyên liệu trước nhập nguyên liệu chế biến Năm 2012 Theo Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản Thủy sản (NAFIQAD), năm 2012, nhiều lô hàng thủy sản xuất Việt Nam liên tục bị quan thẩm quyền nhiều nước nhập cảnh báo không bảo đảm an toàn thực phẩm Số liệu thống kê thị trường có yêu cầu kiểm tra, chứng nhận Cục cho thấy tỷ lệ lô hàng bị cảnh báo vi phạm quy định an toàn thực phẩm năm 2012 0,48%, tăng 0,02% so với năm 2011 Trong đó, thị trường khơng u cầu kiểm tra, chứng nhận Cục, tình hình cảnh báo nghiêm trọng, cụ thể: Cục nhận văn Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada (CFIA) Bộ Nông lâm ngư nghiệp Australia (DAFF) thơng báo tình hình phát dư lượng Fluoroquinolones lô hàng thủy sản Việt Nam tăng cao, cụ thể sau: - Thị trƣờng Canada: CFIA thông báo tình hình vi phạm phát dư lượng Fluoroquinolones lô hàng thủy sản nuôi Việt Nam từ năm 2009 đến khơng có cải thiện Theo đó, kết kiểm tra dư lượng Fluoroquinolones lô -9- hàng thủy sản nhập CFIA thực 03 năm qua cho thấy tỉ lệ đáp ứng yêu cầu Việt Nam mức thấp so với nước khác (tỉ lệ đáp ứng Việt Nam năm 2009-2010, 2010-2011, 2011-2012 72.88%, 59.68%, 64.04%, thấp nhiều so với số 95%, 96.3%, 95.7% nước khác xuất thủy sản vào Canada) Riêng năm 2011-2012, Việt Nam có 103 lơ hàng thủy sản bị từ chối nhập vào Canada phát dư lượng Fluoroquinolones - Thị trƣờng Australia: DAFF thông báo phát 39 lô hàng thủy sản Việt Nam nhiễm dư lượng Fluoroquinolones thời gian vừa qua (chủ yếu enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin cá fillet) - Thị trƣờng Nhật Bản: năm 2012, số lô hàng tôm xuất từ Việt Nam nhiễm enrofloxacin 19 (thấp số lô hàng bi nhiễm năm 2011 57 lô) Năm 2013 Theo báo cáo tổng kết công tác quản lý chất lượng an tồn thực phẩm nơng lâm thuỷ sản 2013 NAFIQAD, Số lượng lô hàng thuỷ sản Việt Nam xuất năm 2013 bị thị trường nước ngồi cảnh báo 185 lơ, chiếm 0.29% tổng số lô hàng xuất khẩu, tăng so với năm 2012 (0.26%).Trong có 85 lơ bị cảnh báo dư lượng hoá chất, kháng sinh cấm/hạn chế sử dụng (46%) Những tháng đầu năm 2014 Trong thời gian qua, Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản Thủy sản (NAFIQAD) liên tiếp nhận cảnh báo Cơ quan thẩm quyền EU Nhật Bản việc phát dư lượng Oxytetracycline vượt mức giới hạn cho phép lô hàng tôm nuôi Việt Nam xuất sang thị trường -10- Ƣu nhƣợc điểm phƣơng pháp xét nghiệm dựa miễn dịch 4.1 Ưu điểm: So với phương pháp phân tích thơng thường phòng thí nghiệm phương pháp dựa miễn dịch có nhiều ưu điểm Các phương pháp nhanh, động, sử dụng đơn giản, tương đối rẻ tiền có độ nhạy cao Các phương pháp dựa miễn dịch không giới hạn cho phân tích loại chất cụ thể mà phát triển cho nhiều loại chất Tuỳ theo yêu cầu mà người ta phát triển phương pháp cho chất chuyên biệt hay nhóm chất Đối với mẫu nước phương pháp đặc biệt hữu ích đơn giản độ nhạy cao Tất hố chất cần cho thí nghiệm thường nhỏ gọn, thuận tiện chuyên chở xa Các thí nghiệm tiến hành khơng đòi hỏi khơng gian rộng lớn Ngồi máy photometer, phương pháp khơng cần dùng máy móc khác, thực trường khơng cần phải phòng thí nghiệm Một người học thực hành phương pháp vòng ngày hơn, việc phân tích 30-50 mẫu ngày hồn tồn Cơng việc chuẩn bị làm mẫu thường đơn giản không bắt buộc Chi phí cho mẫu thường thấp rẻ phân tích lúc lượng mẫu lớn 4.2 Nhược điểm: Tuy có nhiều ưu điểm phương pháp phân tích dựa miễn dịch có điểm hạn chế Người sử dụng cần hiểu rõ điều để lựa chọn phương pháp phù hợp với u cầu cơng việc Thường hố chất dùng phương pháp cần bảo quản lạnh, có số nhạy cảm với ánh sáng, việc bảo quản cần ý để tránh làm hoạt tính Độ xác phương pháp dựa miễn dịch khơng cao nên thích hợp cho phân tích sàng lọc mà khơng thích hợp cho phân tích định lượng Một số trường hợp, phương pháp xét nghiệm nhận diện nhóm gồm nhiều chất có cấu tạo giống mà khơng thể xác định chất nồng độ chất riêng lẻ -46- V QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ENROFLOXACIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA CẠNH TRANH TRỰC TIẾP Khái niệm ELISA: Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có nhiều dạng mà đặc điểm chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme Khi cho thêm chất thích hợp (thường nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên thông qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát Phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptides, protein, antibodies, hormone,… Đơi gọi tên gọi khác EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) kĩ thuật rẻ tiền an tồn mà đảm bảo độ xác ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể chất tạo màu; thực qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Là kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng hóa học: Thơng qua hoạt tính xúc tác enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn hợp dung dịch thí nghiệm 1.1 Phân loại ELISA 1.1.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Direct ELISA: Đây dạng đơn giản phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) -47- Sơ đồ: Tiến trình thực phản ứng ELISA trực tiếp  Ưu điểm: Đơn giản  Nhược điểm:  Độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng ngun có epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitope  Phải đánh dấu cho kháng thể chuyên biệt với đối tượng 1.1.2 ELISA gián tiếp Indirect ELISA: Phương pháp khác Direct ELISA chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không gắn enzyme mà mục tiêu gắn đặc hiệu kháng thể khác (kháng thể kháng thể gắn với enzyme) -48- Sơ đồ: Tiến trình thực phản ứng ELISA gián tiếp  Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa  Nhược điểm: Độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng 1.1.3 Sandwich ELISA Đây dạng ELISA sử dụng phổ biến thực tiễn cho phản ứng mạnh nhạy Được gọi “sandwich” kết thí nghiệm đánh giá thơng qua kết hợp hai loại kháng thể kháng thể bắt (capture antibodies) kháng thể phát (detection antibodies) Kỹ thuật phân làm hai dạng Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich) DAS ELISA gồm dính thụ động kháng thể vào pha rắn (đáy giếng) Những kháng thể sau kết hợp với kháng nguyên thêm vào Những kháng nguyên pha lỗng blocking buffer nhằm ngăn dính khơng chuyên biệt chúng vào pha rắn Ở đây, phần blocking buffer không nên chứa kháng nguyên mà kết hợp với kháng thể bắt Sau ủ rửa, phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn -49- Kháng thể bắt sau thêm vào Do vậy, kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích kháng thể bắt Kháng thể thứ hai giống kháng thể khác nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể Sau ủ, rửa, thêm chất vào đọc máy đo quang phổ Vì sử dụng kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn tính chuyên biệt thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt Điều giới hạn linh hoạt phương pháp, ví dụ kháng thể sử dụng phải đánh dấu riêng (cho kháng nguyên khác nhau) Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn chuẩn bị kháng thể Hệ thống bị giới hạn chỗ kháng nguyên phải có hai epitope hai kháng thể bắt phát kết hợp trực tiếp với kháng nguyên Kháng thể bắt pha rắn kháng thể phát chống lại epitope khác phức hợp kháng nguyên Do đó, thuận lợi khảo sát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể phát kháng thể bắt khác Việc sử dụng kháng thể bắt phát dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí gắn kết sẵn có cho phát Kích thước mối quan hệ không gian epitope kháng ngun đích quan trọng ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm Sandwich ELISA chia làm hai hệ thống: a Sandwich ELISA trực tiếp: Sơ đồ: Tiến trình thực ELISA Sandwich trực tiếp -50-  Ưu điểm: Có thể phát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát khác  Chú ý: sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát giống dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát Mối quan hệ kích thước vị trí khơng gian epitope có ảnh hưởng đến thử nghiệm b Sandwich ELISA gián tiếp: Sơ đồ: Tiến trình thực phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp Chuyên biệt Direct sanwich ELISA antispecies kháng thể gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên 1.1.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai chất tham gia phản ứng lực bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng cạnh tranh đắn hai chất cạnh tranh phải đưa vào đồng thời Sự khác biệt ức chế cạnh tranh Cả hai phản ứng có tham gia hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên Nếu kháng thể ủ trước phản ứng gọi ức chế (blocking/ inhibition assays) Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai kháng thể thêm vào đồng thời với -51- Hình: Sự khác biệt ức chế cạnh tranh a Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên bề mặt đĩa lượng kháng thể gắn enzyme chuẩn độ để tối ưu Kháng nguyên kháng thể gắn enzyme thêm vào đĩa lúc để tạo ưu cạnh tranh Nếu kháng nguyên tương tự kháng nguyên gắn đĩa kháng thể gắn enzyme gắn lên kháng nguyên Khi nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao ngăn cản kết hợp kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%) Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ : pha lỗng) cạnh tranh giảm Như nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao độ hấp thu màu giảm Kháng nguyên cạnh tranh thêm trực tiếp vào đĩa pha lỗng blocking buffer trước thêm kháng thể gắn enzyme Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan nồng độ phân tử cần kiểm tra kháng nguyên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng kháng nguyên) Sau ủ rửa, lượng kháng thể đánh dấu định lượng sau thêm chất khơng có kháng ngun mẫu kiểm tra hay khơng có tương đồng -52- kháng ngun khơng có gắn kết với kháng ngun đánh dấu khơng có cạnh tranh với kháng nguyên Kết mẫu có chứa kháng nguyên cạnh tranh làm giảm cường độ màu đối chứng âm khơng Sơ đồ: Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên b Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Sự cạnh tranh kháng thể mẫu kháng thể đánh dấu với vị trí kháng nguyên đĩa Mẫu kháng thể đánh dấu trộn với trước thêm vào đĩa -53- Sơ đồ Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể 1.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy phản ứng ELISA  Số lượng kháng thể thứ gắn vào đáy giếng  Ái lực kháng thể thứ kháng nguyên  Ái lực kháng thể thứ hai kháng nguyên 1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết ELISA  Nếu đối chứng âm cho kết dương tính nhiễm từ chất tạo màu từ kháng thể đánh dấu đối chứng bị nhiễm -54-  Nếu màu không xuất đối chứng dương mẫu phải kiểm tra lại tất hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản  Nếu màu xuất thấp đối chứng dương mẫu kiểm tra phải kiểm tra lại kháng thể gắn enzyme nồng độ chất tạo màu  Nếu có tạo màu mẫu khơng tạo màu với đối chứng dương kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng điều kiện bảo quản  Khi chạy lại thử nghiệm điều kiện gặp cố nên thay đổi yếu tố thí nghiệm Quy trình phân tích Enrofloxacin phƣơng pháp ELISA cạnh tranh trực tiếp 2.1 Nguyên lý: Kháng thể đặt hiệu kháng Enrofloxacin gắn lên giếng Cho mẫu vào, enrofloxacin có mẫu phân tích bị kháng thể bắt giữ, tạp chất bị rửa trôi Cho thêm cộng hợp enrofloxacin v enzyme mu vo giếng, khng thể cịn tự bắt giữ cộng hợp enzyme Cộng hợp tác động lên chất tạo màu xanh, có enrofloxacin, cộng hợp khơng gắn lên kháng thể, giếng khơng có màu Thành phần kit bao gồm:  Các giếng phủ kháng thể  Chứng dương, chứng âm, cộng hợp, chất, dung dịch hãm màu -55- 2.2 Các bƣớc tiến hành: Bƣớc 1: Xử lý mẫu  Cách 1: Hệ số pha loãng lần  Cho 2g mẫu vào ống ly tâm, sau cho thêm 4ml dung dịch methanol 70% vào  Lắc mẫu 20 phút  Ly tâm 10000 vòng/phút 15 phút  Lấy 2ml dịch trong, thổi khơ, sau hòa cặn lại dung dịch methanol 35% Độ pha loãng: lần  Cách 2: Hệ số pha loãng lần  Cho 2g mẫu vào ống ly tâm, sau cho thêm 4ml dung dịch methanol 70% vào  Lắc mẫu 20 phút  Ly tâm 10000 vòng/phút 15 phút  Rút ml dịch pha loãng với ml dung dịch pha loãng kèm Bƣớc 2: Làm phản ứng ELISA  Cho 50µl dung dịch chuẩn enrofloxacin dung dịch mẫu vào giếng  Cho 50µl cộng hợp enzyme vào giếng cho chuẩn mẫu  Ủ nhiệt độ phòng 30 phút  Rửa giếng dung dịch rửa lần  Cho 100µl chất màu vào tất giếng, ủ 30 phút  Để đọc mật độ quang máy so màu cho vào giếng 50l dịch hãm, hỗn hợp chuyển sang màu vàng, sau đọc bước sóng 450nm Cách đọc nhƣ sau:  Đối chứng dương: Màu rõ ràng, độ hấp thu ánh sáng (A) phải  0.6  Đối chứng âm: không màu màu nhạt, độ hấp thu A phải < 0.1  Mẫu dương tính: Có màu rõ ràng, độ hấp thu A phải  0.3  Chú ý:  Thuốc thử phải bảo quản lạnh (4-80C) -56-  Khi tiến hành thí nghiệm phải đưa tồn thuốc thử nhiệt độ phòng Khơng để thuốc thử tiếp xúc ánh nắng Đƣờng chuẩn ELISA phát Enrofloxacin 80 Mức độ ức chế màu (%(  70 60 50 y = 15.33ln(x) + 2.010 R² = 0.99 40 30 20 10 10 100 Nồng độ enrofloxacin (µg/kg) Khảo sát độ thu hồi Enrofloxacin Nồng độ gây nhiễm (ppb) Nồng độ phát (ppb) Độ thu hồi (%) 100 102 102 50 68 136 30 38 127 20 19 95 10 11 110 Kiểm tra mẫu thật Mẫu Nồng độ Enrofloxacin (ppb) 13.20 24.10 13.20 -57- 9.49 16.07 10 Mức độ ức chế màu (%) Đƣờng chuẩn ELISA phát Chloramphenicol 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0.10 y = 14.79ln(x) + 46.64 R² = 0.998 1.00 10.00 Nồng độ Chloramphenicol (µg/kg)  Các sản phẩm có: Bộ kit ELISA Kit ELISA cho biết dư lượng độ tố có mẫu dựa -58-trên thay đổi mật độ quang  Công dụng: Xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin, độc tố melamine thủy sản sữa phù hợp với qui định lượng tồn dư tối đa enrofloxacin melamine thực phẩm  Thông số kỹ thuật: Kit ELISA Enrofloxacin Kit ELISA Chloramphenicol 0.3 0.03 IC 50 (µg.L ) 10.0 1.0 Khoảng định lượng - 100 0.1 - 10 -1 Ngưỡng phát (µg.L ) -1 -1 (µg.L )  Ƣu – nhƣợc điểm kit ELISA:  Ƣu điểm:  Nhanh  Thao tác đơn giản, dễ thực  Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền  Khơng cần nhân viên chun mơn cao  Chi phí kiểm mẫu thấp kiểm đồng thời số lượng mẫu lớn  Một kit phân tích 50-80 mẫu  Nhƣợc điểm:  Là sinh phẩm nên số hố chất phải bảo quản lạnh có hạn sử dụng định  Có độ xác khơng cao phương pháp hố lý phương pháp sắc ký  Do thích hợp với phân tính sàng lọc phân tích định lượng -59- TÀI LIỆU THAM KHẢO TS.Phan Văn Tiến; Tình hình nhiễm kháng sinh thủy sản xuất Việt Nam năm gần đây; 2014 GS.TS.Chu Phạm Ngọc Sơn; Phân tích thuốc thú y thủy sản kỹ thuật LCMS/MS - Thuận lợi khó khăn; 2014 Trung tâm Thông tin Khoa học & Cơng nghệ; Xu hướng cơng nghệ phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản thực phẩm sở số liệu sáng chế quốc tế; 2014 ThS Bùi Quốc Anh; Một số phương pháp xét nghiệm dựa miễn dịch; 2014 ThS Bùi Quốc Anh; Quy trình phân tích Enrofloxacin thực phẩm phương pháp Elisa cạnh tranh trực tiếp; 2014 CN101458253 A - Phương pháp miễn dịch phát dư lượng enrofloxacin sản phẩm thủy sản CN103389378 - Bộ kit để phát dư lượng kháng sinh Chloramphenicol CN103018450 - Kit Elisa huỳnh quang phát dư lượng kháng sinh Chloramphenicol CN101639466 - Phương pháp phân tích dư lượng thuốc kháng sinh sulfanilamide sản phẩm thủy sản 10 CN10264550 - Phương pháp để phát dư lượng chloramphenicol, thiamphenicol, metronidazole tôm 11 Trang web: vasep.com.vn 12 Trang web: thuysanvietnam.com.vn 13 Trang web: vbs.ac.vn -60- ... thuộc hướng nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản thực phẩm phương pháp sử dụng Enzyme Vi sinh vật c Hướng nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản thực phẩm phương pháp hấp... LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG THỦY SẢN - PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH ************************** I TÌNH HÌNH NHIỄM KHÁNG SINH TRONG THỦY SẢN XU T KHẨU CỦA VIỆT NAM TRONG NHỮNG NĂM GẦN ĐÂY Thành tựu xu t thủy. .. thuộc hướng nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản thực phẩm phương pháp hấp phụ, trao đổi ion -17- d Hướng nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh thủy sản thực phẩm phương pháp quang