PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài Nước mắm sản phẩm truyền thống người dân Việt Nam từ bao đời Đây thực phẩm thiếu bữa ăn gia đình Bên cạnh việc mang lại giá trị dinh dưỡng cao, nước mắm tạo hương vị hấp dẫn, làm bữa ăn trở nên đậm đà, tiếng nước mà biết đến nhiều nước giới Trong năm gần đây, nhờ việc cải tiến quy trình công nghệ chủ động nguồn nguyên liệu sản xuất mà sản lượng nước mắm trì ổn định số lượng chất lượng Tuy nhiên, bên cạnh mục đích nâng cao hàm lượng chất dinh dưỡng, nhiều xí nghiệp có biểu gian lận thương mại Những biểu tiêu cực pha loãng nước mắm, dùng hoá chất độc hại urê để bảo quản cá hay tăng độ đạm cách giả tạo Trước đây, việc kiểm tra chất lượng nước mắm tiêu thụ nội địa bị lãng quên nên đảm bảo chất lượng sản phẩm Hiện nay, việc kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm nước mắm kiểm tra chặt chẽ Nhưng kết giám sát chất lượng nước mắm quan chức gần khiến người dân Việt Nam không yên tâm sử dụng sản phẩm hàm lượng urê cao mức cho phép theo tiêu chuẩn Bộ Y tế Việt Nam nhiều lần [9] Bên cạnh đó, việc xử lý, thu hồi sản phẩm có hàm lượng urê chưa chặt chẽ dẫn đến nhiều lô hàng trôi thị trường kiểm soát Trong đó, phương pháp xét nghiệm urê nước mắm Việt Nam xác định đâu urê hình thành trình thủy phân đạm để sản xuất nước mắm đâu urê cho thêm vào Đồng thời chưa có nghiên cứu khoa học hàm lượng urê cao thấp sinh trình chế biến nước mắm Trong thời gian qua, quan chức hết xử phạt lại rút lại định xử phạt (Trung tâm Kỹ thuật Đo lường Chất lượng thu hồi lại kết kiểm nghiệm urê chưa xác) Điều ảnh hưởng lớn đến uy tín nhà sản xuất nhạy cảm người tiêu dùng đồng thời làm cho quan lúng túng việc xử lý sản phẩm nước mắm có hàm lượng urê cao chưa có khung tiêu chuẩn rõ ràng Hiện nay, giới Việt Nam có nhiều phương pháp phân tích dư lượng urê máu, rượu, sữa, thức ăn chăn nuôi, sản phẩm thủy sản [1], [2], giới người ta sử dụng sản phẩm nước mắm phương pháp phân tích chất lượng nước mắm nói chung tiêu urê nói riêng chưa quan tâm mức Mỗi phương pháp phân tích mẫu cho kết khác nhau, vậy, nhiều vấn đề đáng tranh luận kết phân tích hàm lượng urê nước mắm Xuất phát từ thực tế nêu trên, mục đích đề tài nghiên cứu số phương pháp phân tích hoá lý hàm lượng urê nước mắm Từ tìm phương pháp tối ưu việc phân tích đánh giá kết số loại nước mắm có mặt thị trường Việt Nam cần thiết 1.2 Mục đích đề tài Nghiên cứu số phương pháp phân tích hoá học hàm lượng urê nước mắm đánh giá kết phương pháp số loại nước mắm có mặt thị trường Việt Nam 1.3 Yêu cầu đề tài Xây dựng, hoàn thiện phương pháp phân tích hàm lượng urê sản phẩm nước mắm khác Tiến hành phân tích đồng thời phương pháp số sản phẩm nước mắm Việt Nam so sánh kết thu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ nước mắm Việt Nam Việt Nam nước sản xuất nước mắm với sản lượng lớn ổn định, khoảng 170-180 triệu lít/năm Các xí nghiệp sản xuất nước mắm phân bố chủ yếu tỉnh miền Trung miền Nam như: Nha Trang, Phan Thiết, Phú Quốc, Thanh Hóa, Nghệ An Ở miền Bắc chủ yếu Hải Phòng có vài xí nghiệp lớn với công suất 2-4 triệu lít nước mắm/năm lại sản xuất với quy mô hộ gia đình Xét mặt cấu mặt hàng thủy sản nước mắm loại sản phẩm thủy sản chế biến có khả cạnh tranh với nhiều sản phẩm khác tôm, nhuyễn thể Hiện nay, nước mắm tiêu thụ gồm nhiều nguồn khác Tất tỉnh ven biển có sở sản xuất nước mắm tiêu thụ thị trường nước Ở miền Bắc, luồng nước mắm chủ yếu đưa từ Phan Thiết, Phú Quốc, Thành phố Hồ Chí Minh, Nha Trang Qua số liệu điều tra Bộ Thủy sản cho thấy tổng sản lượng nước mắm tiêu thụ toàn quốc năm 1992 100 triệu lít, đến năm 1996 100 triệu lít, lượng nước mắm tiêu thụ miền Bắc khoảng 50 triệu lít đưa từ miền Nam [1] Sản lượng nước mắm sản xuất vào năm 2004 [1]: Miền Bắc: 10-15 triệu lít (Hải Phòng 5-8 triệu lít, Quảng Ninh triệu lít) Miền Trung: Đà Nẵng đến Khánh Hòa 47 triệu lít, Ninh Thuận Bình Thuận 20-30 triệu lít Miền Nam: 60-70 triệu lít Kiên Giang 22 triệu lít, Thành phố Hồ Chí Minh 30 triệu lít Tổng sản lượng nước vào thời điểm 168 triệu lít với tổng doanh thu khoảng 1008 tỷ đồng Về mặt giá cả, nước mắm có chất lượng tốt giá khoảng 10000 - 20000 đồng/lít Bên cạnh thị trường lưu hành loại nước mắm rẻ tiền với giá từ 4000 - 5000 đồng/lít chất lượng thấp, sản xuất cách pha đấu, chủ yếu tiêu thụ cho quán ăn bình dân Trong tất sở sản xuất nước mắm, riêng hãng nước mắm Phú Quốc chiếm lĩnh thị trường nước đặc biệt thị trường châu Âu Hiện nay, mức sống người dân ngày cải thiện, nhu cầu mặt thực phẩm nói chung nước mắm nói riêng ngày lớn Chất lượng nước mắm không dừng lại thông tin thành phần dinh dưỡng mà quan trọng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Trong thời gian qua, vấn đề nước tương có chất 3-Monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) vừa tạm lắng xuống dư luận lần lại xôn xao thông tin nhiều loại nước mắm bày bán thị trường có chứa urê gây hoang mang cho người tiêu dùng Vấn đề chỗ chưa có tài liệu công bố tác hại urê nước mắm thể người để yên tâm sử dụng mà không lo ngại đến sức khỏe Và số 0,05 g/l mà tiêu chuẩn cho phép diện thực phẩm mang tính chất tham khảo Lý phương pháp phân tích urê nước mắm phân biệt đâu urê nội sinh urê bổ sung từ bên vào 2.2 Tình hình nghiên cứu nước mắm Xét mặt hàng nước chấm có từ lâu từ năm 1914 nghiên cứu nước mắm bắt đầu thức Nghiên cứu nhà khoa học người Pháp như: Tiến sĩ khoa học Rose, bác sĩ Mesnard điều tra phương pháp chế biến khác địa phương Việt Nam bán đảo Đông Dương Năm 1924 đến năm 1927, nhà bác học Krempf phát sản phẩm sản xuất cá điều kiện vô trùng thiếu hẳn hương vị nước mắm Năm 1930, hai nhà bác học Pháp Boez Guillerm nghiên cứu vai trò số vi sinh vật trình sản xuất nước mắm Clostridium, loại vi khuẩn kị khí, có nha bào, có khả tạo protease cao, sinh trưởng thích hợp nhiệt độ 28oC - 45oC Năm 1939 đến 1944, Antret Vialardgoudon nghiên cứu thành phần acid amin có mặt nước mắm tìm thấy Histamin chất gây độc nước mắm Tiền dẫn xuất amin acid amin Histidin hình thành trình thủy phân protein cá Năm 1959, bác sĩ dược phẩm Laurescu (Rumani) nghiên cứu thấy phân giải protein thịt cá protease có sẵn cá Ngoài ra, có tác động loại enzyme lấy từ ruột cá loại cá ăn thịt, tạng lợn, nhớt ruột non lợn, chượp chín tốt, papain nhựa đu đủ khô đu đủ Các chế phẩm hoạt động mạnh tỉ lệ muối thấp Do vậy, tác giả giảm độ muối ban đầu xuống 20% thêm 150g KNO3 (diêm tiêu)/100 kg cá để giảm thối, sau cho đủ muối Như vậy, rút ngắn thời gian chế biến chượp từ nguồn chế phẩm enzyme bổ sung Theo nghiên cứu tác giả Amano, Beddows.C.G.(1997), Meinkew.W.(1959) Vanven.A.G.(1953), Sanpano (1965) cho thấy việc cấy thêm vi khuẩn Baccillus mensentenricus với tỉ lệ 10 lít/100kg cá tác dụng rõ rệt việc cải thiện trình thủy phân protein cá Ở Việt Nam, Lương Hữu Đồng tập thể nhiều nhà nghiên cứu đề cập tới giải pháp công nghệ nhằm tác động vào hệ vi sinh vật trình chượp cá Như vậy, mục đích nhà nghiên cứu tìm cách rút ngắn thời gian cải tiến phương pháp chế biến, bên cạnh có công trình hợp lý hóa sản xuất, cải tiến trang thiết bị bước đầu dùng nước vào công đoạn sản xuất nước mắm 3.3 Thành phần hóa học nước mắm 3.3.1 Thành phần acid amin Acid amin có vai trò quan trọng thể người Trong nước mắm hàm lượng chiếm tỷ lệ cao, đặc biệt nước mắm cao đạm Mỗi loại cá có thành phần hóa học khác nhau, nước mắm loại cá ngon cách khác Trong nước mắm người ta tìm thấy 17 acid amin: Lysine, Valine, Methionine, Isoleucine, Glycine, Alanine, Proline, Glutamic acid, Phenylalanine, Triptophan, Xistin, Arginine, Aspatic, Serine, Threonine, Leucine, Lysine Trong cá nước mắm có đầy đủ loại acid amin không thay thế: Valine, Leucine, Isoleucine, Threonine, Methionine, Lysine, Phenylalanine, Triptophan Bảng 2.1 Hàm lượng số acid amin cá Acid amin Loại cá Cá nục Glycine Aspastic acid Glutamic acid 4,5 8,7 13 Cá thu 7,5 8,7 12 Cá trích lớn 7,5 9,0 13 Khi phân tích mẫu nước mắm khác cho thấy thành phần acid amin sau: Bảng 2.2 Thành phần acid amin có nước mắm [14] Stt Acid amin Lysine Mẫu số 1(g/100g) 0,191 Mẫu số (g/100g) Mẫu số (g/100g) 0,451 0,269 Threonine 0,049 0,049 0,050 Valine 0,253 0,290 0,157 Methionine 0,222 0,096 0,046 Isoleucine 0,125 0,189 0,121 Phenylalanine 0,270 0,222 0,273 Leucine 0,125 0,163 0,138 Triptophan Rất 0,085 0,051 Cisteine 0,351 0,397 0,260 10 Arginine 0,722 0,672 0,130 11 Aspactic 0,482 0,496 0,168 12 Serine 0,099 0,100 0,051 13 Glycine 0,078 0,099 0,052 14 Alanine 0,272 0,2 0,165 15 Tyrosine Rất 0,098 0,094 16 Proline Rất Rất Rất 17 Glutamic acid 0,602 0,927 0,502 2.3.2 Thành phần nitơ nước mắm Khi phân tích mẫu nước mắm từ loại cá phương pháp chế biến khác nhau, hàm lượng có khác rõ rệt Nitơ toàn phần đạm hữu cao cho nước mắm ngon [14] Bảng 2.3 Thành phần nitơ nước mắm Nitơ toàn phần g/l Nước mắm cá biển thủ công dài ngày 30 Nitơ hữu g/l 23,76 19,0 23,21 Nitơ foocmon g/l 22,50 18,3 18,48 Nitơ ammonia g/l 6,24 7,6 6,05 Nitơ amin g/l 16,26 10,7 12,43 Nitơ hữu cơ/nitơ toàn phần % 79 71,4 79,3 Nitơ ammonia/nitơ toàn phần % 20,8 28,57 20,6 Nitơ foocmon/nitơ toàn phần % 75 68,7 63,6 Các loại nitơ Đơn vị Nước mắm cá Nước mắm cá nước biển xí nghiệp dài 26,6 29,28 3.3.3 Thành phần chất bay nước mắm [5] Chất bay nước mắm chất có trọng lượng phân tử nhỏ, dễ bay có mùi thơm Thành phần chất nước mắm phức tạp định hương vị nước mắm Theo nghiên cứu Nonaka cộng cho thấy hàm lượng chất bay trung tính 12 loại, acid bay loại, cacbonyl bay loại amin loại Hàm lượng chất bay xác định sau (mg/100ml nước mắm): Các chất cacbonyl bay 407 - 512 Các acid bay (tính theo acid acetic) 404 - 533 Các amin bay 9,5 - 11,3 Các chất trung tính bay hơi: 5,1 - 13,2 Theo nghiên cứu Teruo, nước mắm tồn nhiều loại acid, acid bay hàm lượng chúng giảm dần theo thứ tự: acid butyric, iso-butyric, propyonic, fumaric, succinic, lactic, pyroglutamic Trong loại acid acid iso-butyric butyric chiếm 30% tổng lượng acid hữu nước mắm 3.3.4 Thành phần Vitamin Người ta tìm thấy cá có nhiều loại Vitamin khác (B1, B2, B12, PP, ) nhiên nước mắm chủ yếu Vitamin tan nước Thành phần hàm lượng thay đổi tùy thuộc vào loại cá phương pháp chế biến nước mắm 3.3.5 Các chất vô Trong nước mắm có chứa nhiều thành phần chất vô khác Muối NaCl thành phần chủ yếu, có Kali, Phospho, Canxi, Magie, lưu huỳnh Canxi Magie tồn dạng vô (anhydride phosphoric) vừa dạng hữu (Cistine) Hàm lượng chất vô lít nước mắm trung bình/1 lít nước mắm là: Phospho (0,266-0,556g), lưu huỳnh (0,546-1,165g), canci (0,439-0,541g), (magie 2,208-2,320g), bromua (68,8-97,5mg) 2.4 Các phương pháp nghiên cứu phân tích urê nước mắm 2.4.1 Thông tin chung urê Danh pháp quốc tế (IUPAC): Diaminomethanal Công thức phân tử: (NH2)2CO Công thức cấu tạo: Điều chế: NH3 + CO2 ↔ H2N-COONH4 (ammonium carbamate) H2N-COONH4 ↔ (NH2)2CO + H2O Phân tử gam: 60,7 g/mol Tính chất lý học: Urê (Tên quốc tế Urea hay Cacbamide) chất rắn không mùi màu trắng, dạng tinh thể hình kim lăng trụ Tỷ lệ %N cao (46%) Tỷ trọng pha: 1,33 g/cm, rắn Độ hòa tan nước: 108 g/100 ml 20oC 167 g/100 ml 40oC 251 g/100 ml 60oC 400 g/100 ml 80oC 400 g/100 ml 100oC Điểm nóng chảy: 132,7oC (406oK) - bị phân hủy Urê dễ bị chảy nước, bị ẩm urê biến đổi dần thành amoni cacbonate theo phương trình phản ứng: (NH2)2CO + 2H2O = (NH4)2CO3 Urê Hilaire Rouelle phát năm 1773 Nó hợp chất hữu tổng hợp lần từ chất vô Friedrich Woehler thực vào năm 1828 cách cho xyanate kali phản ứng với sulfat ammonia Như urê hợp chất hữu cacbon, nitơ, oxy hidro với công thức CON2H4 hay (NH2)2CO Trong số động vật, phân tử urê tạo từ cacbon dioxide, nước, muối aspartat ammonia trình trao đổi chất biết đến chu trình urê (chu trình ocmithine) - chu trình đồng hóa Sự tiêu hao lượng cần thiết ammonia, chất thải phổ biến trình trao đổi chất, chất độc cần trung hòa Việc sản xuất urê diễn gan điều chỉnh N-acethylglutamate Urê có nhiều ứng dụng ngành công nghiệp khác y học Trong công nghiệp sử dụng với nhiều mục đích khác nhau, nông nghiệp urê dùng làm phân bón nhằm nâng cao suất trồng bổ sung vào thức ăn gia súc với tỷ lệ 3% so với ngũ cốc 1% tổng số khối lượng; sản phẩm tiêu dùng urê sử dụng sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, mỹ phẩm kem, dầu gội đầu, thuốc nhuộm tóc với tỷ lệ 1% Urê dùng thay cho muối NaCl việc loại bỏ băng hay sương muối lòng đường hay đường băng sân bay, không gây tượng ăn mòn kim loại muối Trong thực phẩm urê xếp vào danh mục phụ gia thực phẩm theo Codex (CAC/GL, 26-1989, soát xét 2005) với số INS 972b, chưa quy định Tiêu chuẩn thức phụ gia thực phẩm Urê sử dụng kẹo cao su nhằm ổn định cấu trúc, thành phần bổ sung thuốc lá, thêm vào để tăng hương vị sử dụng chất tạo màu nâu vàng sản xuất kẹo bích quy Bản thân urê chất biến tính protein mạnh, thuộc tính khai thác làm tăng độ hòa tan số protein Urê hòa tan protein đặc tới 10M thường áp dụng quy mô phòng thí nghiệm Trong y học, urê sử dụng sản phẩm da liễu cục để giúp cho trình tái hydrate hóa da Đối với chuẩn đoán sinh lý học, urê sản xuất tiết khỏi thể với tốc độ gần không đổi, nồng độ urê cao máu vấn đề với tiết số trường hợp sản xuất nhiều urê thể Nguyên nhân phổ biến bệnh uremia vấn đề hệ tiết niệu Nó lấy thông số với creatinine để vấn đề trực tiếp liên quan tới thận (ví dụ: hư thận mãn tính) hay vấn đề thứ cấp chứng giảm hoạt động tuyến giáp Trong chuẩn đoán khác, loại urê chứa cacbon 14 - đồng vị phóng xạ, hay cacbon 13 - đồng vị ổn định) sử dụng xét nghiệm thở urê, sử dụng để phát tồn Helicobacter pylori (H pylori, loại vi khuẩn) dày tá tràng người Xét nghiệm phát enzym urease đặc trưng, H pylori sản xuất theo phản ứng để tạo ammonia từ urê để làm giảm độ pH môi trường dày xung quanh vi khuẩn [20] 2.4.2 Các nguy độc hại từ nguyên liệu cá chế biến nước mắm [15] Con người sinh vật dị dưỡng nên nhu cầu dinh dưỡng thường thỏa mãn thực phẩm có nguồn gốc động thực vật Tiêu chuẩn để lựa chọn thực phẩm giá trị chất lượng dinh dưỡng, khả cung cấp bảo quản vắng mặt độc tính yếu tố định Những 10 Bảng 4.20 So sánh phương trình đường chuẩn phương pháp Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan R2 DMAB y = 2,0965x + 0,016 0,9994 DAM y = 2,0207x + 0,0058 0,9987 HPLC y = 2,28155e-005x 0,9996 Phương pháp Ở phương pháp DMAB, phương pháp DAM đo máy quang phổ UV-VIS nên nồng độ tính theo độ hấp thụ Abs Đối với phương pháp HPLC, nồng độ tính dựa vào diện tích peak urê Hệ số tương quan phương pháp cao, đó, nồng độ urê tuyến tính với độ hấp thụ Abs (đối với phương pháp DMAB, DAM) diện tích peak (đối với phương pháp HPLC) 4.4.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp Bảng 4.21 So sánh giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Độ lệch chuẩn (SD) Giới hạn phát (LOD) Giới hạn định lượng (LOQ) DMAB 0,003 0,010 g/l 0,030 g/l DAM 0,004 0,013 g/l 0,040 g/l HPLC 0,074 0,224 mg/l 0,740 mg/l Phương pháp Giới hạn phát tính 3,3 lần độ lệch chuẩn, giới hạn định lượng tính 10 lần độ lệch chuẩn [23], [26] Qua kết bảng 4.21, so sánh giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp cho thấy, có phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao có khả ứng dụng để phân tích hàm lượng urê nồng độ 0,74 mg/l, chứng tỏ độ nhạy phương pháp cao so với phương pháp lại 50 4.4.3 Độ phương pháp Bảng 4.22 So sánh độ phương pháp Phương pháp DMAB DAM HPLC SD 1,12 1,34 0,285 R (%) 87,4 85,4 102,5 CV (%) 3,96 4,8 1,53 Qua kết bảng 4.22 cho thấy phương pháp xác định hàm lượng urê sắc ký lỏng hiệu cao sau tạo dẫn xuất với xanthydrol đo detector huỳnh quang có độ cao phương pháp phản ứng với chất tạo phức DMAB, DAM đo máy quang phổ UV-VIS 4.4.4 Kết phân tích hàm lượng urê nước mắm Bảng 4.23 So sánh kết phân tích hàm lượng urê nước mắm Mẫu nước mắm Nồng độ (g/l) M1 M2 M3 M4 M5 Phương pháp DMAB (g/l) 9,74 26,98 9,48 11,03 17,93 DAM (g/l) 9,71 27,02 9,52 10,96 17,98 HPLC (g/l) 9,76 27,3 9,6 11,2 18,1 DMAB (g/l) 30 DAM (g/l) 25 HPLC (g/l) 20 15 10 M1 M2 M3 M4 M5 Loại mẫu Hình 4.6 Đồ thị so sánh kết phân tích hàm lượng urê nước mắm 51 Sau thực đánh giá, so sánh thông số độ nhạy độ xác phương pháp phân tích hàm lượng urê mẫu nước mắm, tiến hành xác định hàm lượng nồng độ mẫu thực Kết so sánh nồng độ urê mẫu nước mắm phương pháp phân tích khác thể qua bảng 4.23 hình 4.5 Qua kết phân tích cho thấy, mẫu nước mắm hàm lượng urê xác định phương pháp so màu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao không nhiều Hàm lượng urê mẫu nước mắm phân tích phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao cao phương pháp so màu độ thu hồi lớn hơn, độ biến thiên nhỏ không bị ảnh hưởng mẫu Tuy nhiên chênh lệch không đáng kể, điều thể mẫu nước mắm Mặt khác, kết phân tích hàm lượng urê cao nhiều so với quy định Bộ Y tế Việt Nam Tiêu chuẩn Codex 4.5 Các quy trình phân tích hàm lượng urê nước mắm * Phương pháp DMAB ml nước mắm + 1g than hoạt tính + 100 ml H2O + ml K4Fe(CN)6 + ml Zn(CH3COO)2 Định mức 200 ml Lắng 10 phút Lọc Hút ml + ml DMAB Lắc 10 phút Đo bước sóng 420nm Hình 4.7 Quy trình phân tích urê phương pháp DMAB 52 * Phương pháp DAM Hút ml nước mắm Định mức 200 ml + g than hoạt tính Lọc Lắng 10 phút Hút 0,5 ml + 2,5 ml nước cất + 1,5 ml DAM-TSC + 0,5 ml sắt III kiểm nghệm Đun sôi 100o/10 phút Đo bước sóng 540 nm * Phương pháp HPLC Hút ml nước mắm Định mức 2000 ml Hút ml + ml Ethanol Lọc qua giấy Whatman No1 Tạo dẫn xuất, ổn định phút + ml xanthydrol 0,02M 1-propanol + ml HCl 1,5M Phân tích HPLC Hình 4.8 Quy trình phân tích urê phương pháp DAM HPLC 53 4.6 Nhận xét kết thu Từ việc phân tích hàm lượng urê nước mắm phương pháp phản ứng với chất tạo phức p-Dimethylaminobenzaldehyde, Diacetthylmonoxime đo máy quang phổ UV-VIS, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sau tạo dẫn xuất với xanthydrol đo detector huỳnh quang, ta thấy: Phương pháp xác định urê nước mắm sắc ký lỏng hiệu cao cho độ nhạy độ cao Điều thể qua giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ thu hồi, độ biến thiên tính ổn định phương pháp thông qua độ lệch chuẩn thời gian lưu Việc xác định hàm lượng urê nước mắm áp dụng phương pháp Tuy nhiên, phương pháp quang phổ UV-VIS, cho phản ứng với chất tạo phức DMAB áp dụng cho mẫu nước mắm có nồng độ urê lớn 0,030 g/l độ thu hồi lớn 87,4%, cho phản ứng với chất tạo phức DAM áp dụng cho mẫu nước mắm có nồng độ urê lớn 0,040 g/l Hai phương pháp phân tích đơn giản, nhanh, tốn Khi so sánh thông số đánh giá hai phương pháp, chênh lệch không đáng kể Đối với phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ta thấy phương pháp nhạy, phân tích urê nồng độ nhỏ với giới hạn phát 0,224 mg/l giới hạn định lượng 0,74 mg/l Tuy nhiên, phương pháp phức tạp, tốn nhiều thời gian phân tích phương pháp Bên cạnh đó, chi phí cho việc phân tích đắt nhiều Theo Tiêu chuẩn Codex Bộ Y tế Việt Nam, cho phép mức độ diện hàm lượng urê nước mắm 0,05 g/l (tương ứng 0,05 g/l), giới hạn phát phương pháp so màu nhỏ 0,05 g/l Đối tượng phân tích sản phẩm nước mắm, không phân tích công đoạn sản xuất, kết hàm lượng urê cao (cao nhiều so với mức cho phép) Mặt khác, xét mặt đầu tư thiết bị, thời gian, hoá chất, trình 54 độ cán phân tích, việc xác định hàm lượng urê nước mắm cần áp dụng phương pháp so màu đủ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao nhạy, xác định hàm lượng urê dạng vết, nhiên đầu tư phương pháp phân tích phức tạp phương pháp không cần thiết áp dụng để phân tích hàm lượng sản phẩm nước mắm theo tiêu chuẩn Bộ Y tế Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao áp dụng xác định hàm lượng urê giai đoạn sản xuất yêu cầu nghiêm ngặt hàm lượng sản phẩm xuất 55 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã xác định phương pháp phân tích urê với độ đúng, độ xác sau: + Phương pháp phân tích hàm lượng urê phản ứng với chất tạo phức p-Dimethylaminobenzaldehyde đo máy quang phổ UV-VIS với phương trình đường chuẩn y = 2,0965x + 0,016 (R2=0,9994), LOD = 0,010 g/l; LOQ = 0,030 g/l; SD = 1,12; R = 87,4%; CV = 3,96% + Phương pháp phân tích hàm lượng urê phản ứng với chất tạo phức Diacetthylmonoxime đo máy quang phổ UV-VIS với phương trình đường chuẩn y = 2,0207x + 0,0058 (R2=0,9987), LOD = 0,013 g/l; LOQ = 0,040 g/l; SD = 1,34; R = 85,4%; CV = 4,8% + Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sau tạo dẫn xuất với xanthydrol đo detector huỳnh quang cho độ xác độ cao với phương trình đường chuẩn y = 2,28155e-005x (R2=0,9996), LOD = 0,224 mg/l; LOQ = 0,074 mg/l; SD = 0,285; R = 102,5%; CV = 1,53% - Với thông số trên, xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng urê nước mắm (thể mục 4.5, phần kết thảo luận), đồng thời tiến hành phân tích hàm lượng mẫu, kết cho chênh lệch không đáng kể, áp dụng phương pháp phân tích tùy thuộc điều kiện phòng thí nghiệm - Phương pháp so màu áp dụng với điều kiện phòng thí nghiệm thông thường, chi phí thấp, hàm lượng urê cho phép diện mức 0,05 g/l Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao phát hàm lượng urê dạng vết, nhiên yêu cầu cao mặt kỹ thuật, hóa chất, thiết bị, chi phí phân tích lớn, thường áp dụng phân tích công đoạn sản xuất, mặt hàng xuất 56 5.2 Đề nghị Trong trình thực đề tài, điều kiện thời gian có hạn, không đủ điều kiện nghiên cứu xác định hàm lượng urê nước mắm phương pháp enzyme urease Việc nghiên cứu nhằm đánh giá phương pháp nhiều vấn đề chưa đề cập hết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng ammonia, arginine thường có mặt nước mắm loại thuốc thử Vì chất có gốc tương tự urê nên phản ứng với loại thuốc thử nêu Dựa kết nghiên cứu trên, có số kiến nghị sau: Do nước mắm sản phẩm truyền thống nên cần khảo sát kỹ hàm lượng urê công đoạn sản xuất, từ khâu nguyên liệu đầu vào sản phẩm cuối Đồng thời chuẩn hóa phương pháp phân tích cho công đoạn Do quy định mức cho phép hàm lượng urê diện nước mắm 0,05 g/l giá trị tham khảo nên từ số liệu thống kê để tiến tới xây dựng giới hạn cho phép hàm lượng urê nước mắm 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Bộ Thủy sản, Tạp chí Thủy sản (2004), Thủy sản Việt Nam đường đổi hội nhập, NXB Lao Động Bộ Thủy sản (1996), Trung tâm kiểm tra chất lượng vệ sinh thủy sản - Các tiêu chuẩn chất lượng an toàn vệ sinh thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Bộ Thủy sản (2008), Tuyển tập số tiêu chuẩn phương pháp thử sản phẩm thủy sản tiêu thụ nội địa, Hà Nội Phan Thị Thanh Quế (2005), Công nghệ chế biến thủy hải sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trần Thu Trang (2006), Nghiên cứu chế độ cô đặc nước mắm phương pháp kết tinh dung môi ứng dụng sản xuất nước mắm dạng kem, Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại Học Bách Khoa Hà Nội Lê Ngọc Tú cộng (2006), Độc tố học an toàn thực phẩm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tổng cục thống kê (2009), Niên giám thống kê, NXB Thống kê, Hà Nội II Tài liệu tiếng anh AOAC Official Method 967.07(2006), “Urea in Animal Feed”, Colorimetric method, pp.200 Butis CA, Ashwood ER, editors, Text book of Clinical Chemistry, 3rd ed Philadelphia W.B Saurders Company; 1999.p.1838 10 Beale R.N and Croft.D A sensitive method for the determination of urea The Institute of Climinal Pathology and Medical Research, Department of Rublic Health, Syney, Australia, J.Clin Path (2007), 14.418 58 11 Collier P.D; Cromie D.D.O; Davies A.P (1991), “Mechanism of Formation of Chloropropanols Present in Protein Hydrolysates”, J Am Oil Chem Soc.,68, pp.785-790 12 Dyson,N (1992), Choromatographic Intergration Methods The Royal Society of Chemistry, Carmbridge, United Kingdom 1-67, 87-165 13 Brownlee, K.A (1995), Statistical theory and methodology in science and engineering J Wiley & Sons, New York 14 Nguyễn Thị Du, Nguyễn Thị Mùi, Reduction of Fish Sauce Fermentation time by Using Protease, Food Industries Research 15 Herbert.P., Santos.L., Bastos.M., Barros.A., A.Alves, J.Food Sci 67(2002) 1616 16 Hans-Joachim Kuss, Weighted Least - Squares Regression in Practice: Selection of The Weighting Exponent, Neurochemical Dept, LudwigMaximilians University, Munish, Germany 17 Horwitz.W (Ed.) (2000), Official Methods of Analysis of AOAC International 17th., Association of Official Analytical Chemists (AOAC) Intergration, Gaithersburg, MD, p.46 ch.16 18 IRPTC Data Profile, Identifiers (2006), Physical and Chemical Properties 19 Miller, J.C., and J.N Miller 1984 Statistics for Analytical Chemistry, Wiley, New York 90-98 20 Olsen.P (2006), “Urea”, Institute of Toxicology, National Food Agency of Denmark 21 Shona Clark, Paul S Francis, Xavier Colan, Neil W Barnett (2007), Determination chromatography of urea with using fluorescene high - performance detection after liquid automated derivatisation with xanthydrol, School of life and Enviromental Siences, Deakin University, Geelong, Victoria, 3217, Australia, pp.207-213 59 22 Smith, J.S 1994 Evaluation of analytical data In: Nielsen, S.S 1994 Introduction to the chemical analysis of food Jones & Bartlett Publ., London pp 53-59 23 Dr Shulamit Levin, Medtechnica, Detection in high - performance liquid chromatography - Qualification 24 Thomas.L Clinical Laboratory Diagnostics 1st ed Frankfust TH-Books Verlagsgellschaft: 1998.p.374-7 25 M.J Veiga, P Herbert, T.Simoes, A.Oliverira, A.Alves, Presented at the 4th Internaional Conference on Intrumental Methods of Analysis: Medern Trends and Applications, Iraklion, Greece, Octorber 2005, Poster P-III-16 26 Wisconsin Department of Natural Resources Laboratory Certification Program (1996), Analytical Detection Limit Guidance & Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits, PUBL-TS-056-96 27 Xiao Yun ZHU, Hong Tao YAN (2000), Determination of Kinetic Parameters and Metal Ions in Urea-Urease System Based on the Biochemical Reaction Heat Induced Laser Beam Deflection, Chinese Chemical Letters Vol 11, No 2, pp 157-160 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI XÁC NHẬN CỦA THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ ThS Vũ Thị Hạnh 60 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Hàm lượng số acid amin cá Bảng 2.2 Thành phần acid amin có nước mắm [14] Bảng 2.3 Thành phần nitơ nước mắm Bảng 3.1 Sơ đồ tiến hành kiểm nghiệm mẫu 27 Bảng 4.1 Mối quan hệ nồng độ độ hấp thụ dãy chuẩn làm việc 33 Bảng 4.2 Giá trị độ lệch chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng 34 Bảng 4.3 Xác định độ thu hồi phương pháp phản ứng với DMAB 35 Bảng 4.4 Xác định hệ số biến thiêncủa phương pháp phản ứng với DMAB 36 Bảng 4.5 Tổng hợp kết đánh giá phương pháp phản ứng với DMAB 37 Bảng 4.6 Kết phân tích hàm lượng urê nước mắm 37 Bảng 4.7 Mối quan hệ độ hấp thụ nồng độ dãy chuẩn 38 Bảng 4.8 Độ lêch chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng 39 Bảng 4.9 Xác định độ thu hồi phương pháp phản ứng với DAM 40 Bảng 4.10 Xác định độ biến thiên phương pháp phản ứng DAM 41 Bảng 4.11 Tổng hợp kết đánh giá phương pháp 41 Bảng 3.12 Kết phân tích hàm lượng urê nước mắm 42 Bảng 4.13 Thời gian lưu urê số liệu đường chuẩn 43 Bảng 4.14 Độ lệch thời gian lưu urê vào ngày khác 45 Bảng 4.15 Độ lệch chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng 46 Bảng 4.16 Xác định độ thu hồicủa phương pháp HPLC 47 Bảng 4.17 Xác định độ biến thiên phương pháp HPLC 48 Bảng 4.18 Tổng hợp kết đánh giá phương pháp 48 Bảng 4.19 Kết phân tích mẫu nước mắm phương pháp HPLC 49 Bảng 4.20 So sánh phương trình đường chuẩn phương pháp 50 Bảng 4.21 So sánh giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 50 Bảng 4.22 So sánh độ phương pháp 51 Bảng 4.23 So sánh kết phân tích hàm lượng urê nước mắm 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Đồ thị đường chuẩn urê phương pháp DMAB 33 Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn urê phương pháp DAM 38 Hình 4.3 Đồ thị đường chuẩn urê phương pháp HPLC 43 Hình 4.4 Sắc ký đồ chuẩn urê mg/l 43 Hình 4.5 Sắc ký đồ chuẩn urê với nồng độ 5; 10; 15 mg/l tương ứng 44 Hình 4.6 Đồ thị so sánh kết phân tích hàm lượng urê nước mắm 51 Hình 4.7 Quy trình phân tích urê phương pháp DMAB 52 Hình 4.8 Quy trình phân tích urê phương pháp DAM HPLC 53 MỤC LỤC Trang PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ nước mắm Việt Nam 2.2 Tình hình nghiên cứu nước mắm 3.3 Thành phần hóa học nước mắm 3.3.1 Thành phần acid amin 2.3.2 Thành phần nitơ nước mắm 3.3.3 Thành phần chất bay nước mắm 3.3.4 Thành phần Vitamin 3.3.5 Các chất vô 2.4 Các phương pháp nghiên cứu phân tích urê nước mắm 2.4.1 Thông tin chung urê 2.4.2 Các nguy độc hại từ nguyên liệu cá chế biến nước mắm 10 2.4.3 Đánh giá nguy độc hại urê 12 2.4.4 Nguyên nhân mức độ diện urê nước mắm 14 2.4.5 Các phương pháp phân tích urê 15 PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu 18 3.2 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 18 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 18 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Xác định hàm lượng urê phản ứng với chất tạo phức PDimethylaminobenzaldehyde 33 4.1.1 Xác định khoảng tuyến tính 33 4.1.2 Xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 34 4.1.3 Xác định độ thu hồi 35 4.1.4 Xác định độ biến thiên 36 4.1.5 Kết phân tích mẫu nước mắm 37 4.2 Xác định urê phản ứng tạo phức với Diacethylmonoxime đo máy quang phổ UV-VIS 38 4.2.1 Xác định khoảng tuyến tính 38 4.2.2 Xác định độ lệch chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng 39 4.2.3 Xác định độ thu hồi 39 4.2.4 Xác định độ biến thiên 40 4.2.5 Kết phân tích mẫu nước mắm 42 4.3 Xác định urê sắc ký lỏng hiệu cao đo detector huỳnh quang sau tạo dẫn xuất với xanthydrol 42 4.3.1 Xác định khoảng tuyến tính 42 4.3.2 Tính ổn định phương pháp 45 4.3.3 Độ lệch chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 45 4.3.4 Xác định độ phương pháp 46 4.3.5 Kết phân tích mẫu nước mắm phương pháp HPLC 49 4.4 Tổng hợp đánh giá phương pháp 49 4.4.1 Phương trình đường chuẩn phương pháp 49 4.4.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp 50 4.4.3 Độ phương pháp 51 4.4.4 Kết phân tích hàm lượng urê nước mắm 51 4.5 Các quy trình phân tích hàm lượng urê nước mắm 52 4.6 Nhận xét kết thu 54 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 5.1 Kết luận 56 5.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 ... urê nước mắm nội sinh nhỏ không đáng lo ngại sức khỏe người tiêu dùng Trong đó, phương pháp xét nghiệm urê nước mắm Việt Nam xác định đâu urê hình thành trình thủy phân đạm để sản xuất nước mắm. .. biệt đâu urê nội sinh urê bổ sung từ bên vào 2.2 Tình hình nghiên cứu nước mắm Xét mặt hàng nước chấm có từ lâu từ năm 1914 nghiên cứu nước mắm bắt đầu thức Nghiên cứu nhà khoa học người Pháp như:... nước mắm có mặt thị trường Việt Nam cần thiết 1.2 Mục đích đề tài Nghiên cứu số phương pháp phân tích hoá học hàm lượng urê nước mắm đánh giá kết phương pháp số loại nước mắm có mặt thị trường Việt