BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG -o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa) Giảng viên hướng dẫn : TS PHẠM THỊ MINH THU Sinh viên thực : NGUYỄN VĂN TIẾN Mã số sinh viên : 55131960 Lớp : 55SH1 Khánh Hòa: 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa) GVHD: TS Phạm Thị Minh Thu SVTH: Nguyễn Văn Tiến MSSV: 55131960 Khánh Hòa, tháng 6/2017 i ============================================================== LỜI CẢM ƠN Là sinh viên thuộc viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến toàn thể Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo thầy cô văn phòng khoa tạo điều kiện cho em nói riêng tập thể lớp 55 CNSH nói chung suốt trình, thời gian học tập trường có nhiều hôi học tập, thực hành kỹ rèn luyện bản thân Và em tự hào sinh viên trường Đồng thời em xin cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường chỉ bảo, giúp đỡ truyền đạt kiến thức kỹ cho em suốt thời gian học tập thực hành trường Em chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Minh Thu cô Khúc Thị An tạo điều kiện cho em thực tập trường ĐH Nha Trang, cảm ơn cô dành nhiều thời gian công sức để hướng dẫn, chỉ bảo em suốt thời gian làm hoàn thiện đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn tất cả anh, chị phòng thí nghiệm công nghệ cao tạo điều kiện giúp đỡ đồng thời bỏ qua cho sai sót, phiền phức mà chúng em gây Em xin chúc anh chị luôn mạnh khỏe vui vẻ Tôi đặc biệt cảm ơn người bạn lớp hai em Giang, Kiều làm việc với Tuy có tranh luận bất đồng với nhờ vậy mà thân thiết hơn, hiểu sau tháng làm việc với giúp đỡ tận tình Cảm ơn bạn em trao cho khoảng thời gian quý giá tự hào mà có hội lăp lại lần hay không Cảm ơn người yêu thương gia đình Con xin cảm ơn ba mẹ cố gắng làm việc cực khổ để tạo điều kiện cho việc học tập nơi xa nhà tốt Cảm ơn anh chị giúp đỡ động viên em suốt thời gian học tập xa nhà Cảm ơn toàn thể gia đình cho gia đình thật gọi hạnh phúc ấm áp vô Cảm ơn tất cả người chúc toàn thể hạnh phúc vui vẻ mạnh khỏe! ii ============================================================== TÓM TẮT Hoa chuông (Sinningia speciosa) có nguồn gốc nhiệt đới (thuộc khu vực rừng nhiệt đới Brazil Nam Mỹ) người châu Âu chọn tạo nhiều giống hoa mới ngày loài hoa nhập nội có giá trị về kinh tế đáp ứng xu hướng ưa thích loài hoa mới lạ người chơi hoa quan tâm người trồng hoa Cây hoa chuông tự nhiên nhân giống hạt, đoạn thân, củ Phương pháp nhân giống truyền thống cho hệ số nhân thấp, cần số lượng lớn bố mẹ, tốn thời gian, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết … Ngày nay, phương pháp nhân giống vô tính kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trở thành phương pháp nhân giống có hiệu quả với hệ số nhân giống cao, giống tạo hoàn toàn bệnh, đồng về kiểu hình, ổn định về tính di truyền sản xuất quy mô lớn Nghiên cứu này, nhằm với mục đích đưa phương pháp, qui trình để nhân rộng, nhanh chóng thông qua hình thành chồi ngẫu nhiên từ phận khác (lá, đoạn thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh) Giai đoan đầu tiên việc tạo vật liệu in vitro từ mẫu tự nhiên Các mẫu cấy sau sử lý sơ khử trùng cồn 70% (2 phút), NaOCl 2% (10 phút) cho kết quả tốt đối với đoạn thân mang mắt ngủ với tỷ lệ tái sính mẫu đạt 36,36% môi trường MS bổ sung 0,50 mg/l BAP Môi trường nuôi cấy tối ưu giúp cho hệ số nhân chồi, chất lượng chồi tốt MS bản có chứa 1,00 mg/l BAP + 0,10 mg/l NAA với mẫu cấy đoạn thân mang mắt ngủ cho hệ số nhân chồi đạt 6,60 (lần) Môi trường khoáng MS thích hợp cho phát triển chồi giai đoạn cấy chuyền Quá trình tạo rễ môi trường MS bổ sung 0,20 mg/l NAA cho kết quả tốt sau tuần nuôi cấy để tạo giống in vitro hoàn chỉnh Giá thể đất - trấu - xơ dừa tỷ lệ (1: 1: 1) giúp tăng tỷ lệ sống lên đến 91,67%, đồng thời giúp phát triển tốt nhất, cho hoa sau 50 ngày chăm sóc Với việc áp dụng qui trình từ bình môi trường nuôi cấy chứa mẫu đoạn thân mang mắt ngủ sau tuần nuôi cấy có hệ số nhân chồi 6,60 (lần) số lượng in vitro hoàn chỉnh Số thương phẩm đạt gấp 6,05 (lần) so với số lượng mẫu cấy ban đầu iii ============================================================== MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH .v DANH MỤC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu .4 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh hoa chuông .6 1.1.4 Tình hình sản xuất giá trị thương mại .7 1.2 Các phương pháp nhân giống truyền thống hoa chuông 1.2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính .9 1.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính .10 1.3 Phương pháp nhân giống in vitro 10 1.3.1 Sơ lược về nhân giống in vitro 10 1.3.2 Ưu nhược điểm nhân giống in vitro 11 1.3.3 Các giai đoạn qui trình nhân giống in vitro .14 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống in vitro 17 1.3.5 Vai trò, tác dụng chất ĐHTTTV 21 1.4 Các nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro Hoa chuông (Singningia speciosa) nước 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 2.1.1 Thời gian 27 2.1.2 Địa điểm 27 2.2 Đối tượng nghiên cứu 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 iv ============================================================== 2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát qui trình nhân giống in vitro hoa chuông.27 2.4.2 Nội dung 2: Chăm sóc vườn ươm 35 2.5 Các chỉ tiêu theo dõi phương pháp xác định 37 2.5.1 Các chỉ tiêu nuôi cấy in vitro 37 2.5.2 Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển 38 2.5.3 Phương pháp đánh giá chất lượng chồi in vitro giống in vitro ……………………… 38 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Khảo sát qui trình nhân giống in vitro hoa chuông 39 3.1.1 Khảo sát thời gian khử trùng phận khác (lá, đoạn thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh) 39 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng chất ĐHTTTV (BAP, NAA, IAA) lên phát sinh chồi bất định từ phận khác (lá, đoạn thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh) 43 3.1.3 Khảo sát môi trường khoáng lên sinh trưởng phát triển chồi… 52 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng than hoạt tính auxin (NAA, IAA) lên phát sinh rễ 54 3.2 Chăm sóc vườn ươm 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .62 4.1 Kết luận 62 4.1.1 Xác định qui trình nhân giống hoa chuông in vitro 62 4.1.2 Xác định giá thể phù hợp cho ươm in vitro giai đoạn vườn ươm … .62 4.2 Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC .67 v ============================================================== DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh hoa chuông Hình 1.2 Sự phong phú về màu sắc hoa chuông Hình 1.3 Công thức hóa học số chất ĐHTTTV 24 Hình 2.1 Nguyên liệu vào mẫu .28 Hình 2.2 Mẫu tái sinh từ thí nghiệm 30 Hình 2.3 Mô chồi tái sinh từ thí nghiệm 32 Hình 2.4 Mẫu sau cấy chuyền thí nghiệm 34 Hình 2.5 Khảo sát ảnh hưởng loại giá thể khác lên tỷ lệ sống .36 Hình 3.1 Sự tái sinh mẫu (đoạn thân mang mắt ngủ) sau tuần (a), tuần (b) nuôi cấy 41 Hình 3.2 Mẫu nhiễm nấm sau tuần cấy mẫu .42 Hình 3.3 Mẫu chết hóa đen sau tuần cấy mẫu .42 Hình 3.4 Sự phát sinh chồi sau tuần nồng độ BAP khác 45 Hình 3.5 Sự phát triển chồi sau tuần nuôi cấy nồng độ BAP khác 46 Hình 3.6 Một số mẫu chồi đạt chất lượng tốt nồng độ khác .48 Hình 3.7 Một số mẫu đạt chất lượng tốt nồng độ khác .51 Hình 3.8 Kết quả cấy chuyển môi trường khoáng MS MS 1B sau tuần 53 Hình 3.9 Kết quả ảnh hưởng MS0 than hoạt tính lên phát triển rễ sau tuần 55 Hình 3.10 Kết quả ảnh hưởng NAA lên phát triển rễ sau tuần .57 Hình 3.11 Kết quả ảnh hưởng IAA lên phát triển rễ sau tuần 56 Hình 3.12 Kết quả ảnh hưởng giá thể lên tỷ lệ sống phát triển theo thứ tự loại giá thể từ – sau tuần 60 Hình 3.13 Sơ đồ qui trình kỹ thuật nhân giống in vitro hoa chuông nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ 61 vi ============================================================== DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Nồng độ thời gian xử lý nấm khuần bề mặt mẫu .18 Bảng 2.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng quan nuôi cấy đến tạo nguồn vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro hoa chuông 29 Bảng 2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi bất định từ phận (lá, thân, chồi đỉnh) .30 Bảng 2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp BAP NAA đến phát sinh chồi bất định từ phận (lá, thân, chồi đỉnh) 31 Bảng 2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp BAP IAA đến phát sinh chồi bất định từ phận (lá, thân, chồi đỉnh) 32 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng quan nuôi cấy đến tạo nguồn vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro hoa chuông 40 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP lên phát sinh chồi bất định từ đoạn thân mang mắt ngủ kích thước hình thái chồi sau phát sinh 44 Bảng 3.3 Ảnh hưởng (BAP NAA) lên phát sinh chồi bất định từ đoạn thân mang mắt ngủ kích thước hình thái chồi sau phát sinh 47 Bảng 3.4 Ảnh hưởng (BAP IAA) lên phát sinh chồi bất định từ đoạn thân mang mắt ngủ kích thước hình thái chồi sau phát sinh 49 Bảng 3.5 Ảnh hưởng chất ĐHTTTV (BAP, NAA, IAA) lên phát sinh chồi bất định từ đoạn thân mang mắt ngủ cho kết quả tốt khảo sát giai đoạn nhân nhanh chồi 52 Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường khoáng lên phát triển chồi .52 Bảng 3.7 Ảnh hưởng MS0, than hoạt tính (NAA IAA) lên hình thành phát triển rễ 54 Bảng 3.8 Ảnh hưởng loại giá thể cách phối trộn lên tỉ lệ sống phát triển vườn ươm 59 vii ============================================================== DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐHTTTV – Điều hòa tăng trưởng thực vật ATP - Adenosin triphotphat BAP - 6-benzyl adenine phosphat ABA - Axit abscicic BVTV - Bảo vệ thực vật cs – Cộng đ/c - Đối chứng GA3 - Gibberellic axít GA - Giberrellin IAA - Axit indolylacetic IBA - Axit indolyl butyric lux - đơn vị đo cường độ ánh sáng MS - môi trường Murashige Skoog NAA- naphthylacetic acid 2, - D - Axit diclorophenoxy acetic TPHCM – Thành phố Hồ Chí Minh ============================================================== LỜI MỞ ĐẦU Nhân giống trồng có ý nghĩa tầm quan trọng vô to lớn với mục đích cao tạo số lượng lớn cá thể giống từ lượng mẫu giống hạn chế ban đầu Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật công nghệ sinh học kỹ thuật nuối cấy mô Đã tạo nhiều nguyên liệu hóa chất tạo điều kiện nuôi cấy lý tưởng nhất, giúp cho hệ số nhân chồi không chỉ dừng lại số hạt, cành lên mà tăng đến số 100, 1000, 2000… tăng cao Với mức độ tăng số lượng theo lũy thừa đáp ứng đầy đủ việc cung cầu giống cần thiết Từ trước đến nay, hoa cảnh xem loại cảnh có nhu cầu sử dụng lớn cho người loại cảnh loại Thay vào đó, nhu cầu người ngày thay đổi theo nhiều chiều hướng khác Trong có sở thích làm đẹp trang trí hoa cảnh Hoa chuông (Sinningia speciosa) giống hoa thuộc họ Tai voi (Gesneriaceae), hoa môi (Lamiales), có nguồn gốc nhiệt đới (thuộc khu vực rừng nhiệt đới Brazil Nam Mỹ) Là loại hoa nhập về Việt Nam ưa thích thời gian gần Hoa có thời gian sinh trưởng ngắn, hoa vòng tháng gieo hạt Đặc biệt, cố nguồn gốc nhiệt đới nên hoa phù hợp với điều kiện khí hậu nhiều vùng Việt Nam như: Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Thành phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang Tại Việt Nam, hoa chuông loại hoa mới nhập nội với nhiều ưu điểm: màu sắc, hình dáng hoa đa dạng, hương thơm dịu, độ bền tự nhiên hoa dài sử dụng với nhiều mục đích khác như: trang trí làm đẹp nhà cửa, văn phòng hay kể cả công viên Chính nhiều ưu điểm đó, hoa chuông nhanh chóng trở thành loại hoa thương phẩm về kinh tế tinh thần, đáp ứng nhiều nhu cầu ưa thích loài hoa mới lạ người chơi hoa nỗ lực tạo giống hoa tốt người trồng hoa Hoa chuông tự nhiên trồng hạt, đoạn thân, củ Những phương pháp nhân giống truyền thống vừa cho hệ số nhân thấp đồng thời lượng giống có chất lượng không đồng đều, kèm theo nhiều mối nguy về nhiễm bệnh, tốn thời 55 ============================================================== Ghi chú: Các chữ a, b, c, d khác cột thể sai khác theo chiều giảm dần, có ý nghĩa thống kê với p = 0,05 phép thử Duncan +++: Rễ đồng đều, mập; ++: Rễ không đống đều; +: Rễ không đồng đều, nhỏ Hình 3.9 Kết ảnh hưởng MS than hoạt tính lên phát triển rễ sau tuần Nhận xét: Từ số liệu Bảng 3.7 cho thấy, mẫu chồi môi trường đối chứng vẫn có khả rễ thời gian phải lên đến tuần để đạt tỷ lệ rễ 100% có số lượng rễ 3,50 ± 0,58 rễ/chồi, kèm theo rễ không đồng đều, nhỏ Đối với chồi cấy MS0 có bổ sung 2,00 g/l than hoạt tính tỷ lệ rễ đạt 100 sau tuần nuôi cho kết quả rễ 7,33 ± 0,98 rễ/chồi, chồi có rễ đồng đều, to khỏe có kích thước ngắn 1,75 ± 0,21 (cm) sau tuần nuôi cấy Sự phát sinh rễ mẫu môi trường MS MS + 2g than hoạt tính thể Hình 3.9 Từ kết quả Bảng 3.8 cho thấy, bổ sung NAA vào môi trường nuối cấy mức nồng độ khác nhau, trình rễ chồi in vitro môi trường có nồng độ khác khác có thay đổi rõ ràng, mức nồng độ đều phát sinh rễ 100% sau tuần NAA có nồng độ 0,40 chồi in vitro phải tuần mới đạt tỷ lệ 100% Ở mức nồng độ (0,10 – 0,20 mg/l NAA) trình rễ chồi in vitro tỷ lệ thuận với nồng độ NAA bổ sung đạt hiệu quả tốt nồng độ NAA 0,20 mg/l, có số lượng rễ đạt 7,67 ± 0,58 (rễ/chồi), chồi có rễ đồng đều, to khỏe, kích thước từ 4,59 ± 0,52 (cm) Khi nồng độ NAA (0,30 – 0,40 mg/l) số lượng rễ phát sinh chồi bắt đầu giảm xuống chỉ số lượng rễ 5,50 ± 0,87 (rễ/chồi) nồng 56 ============================================================== độ 0,40 mg/l NAA, rễ có chất lượng rễ thấp, không đồng đều, nhỏ ngắn Sự phát sinh rễ mẫu môi trường MS – NAA thể Hình 3.10 Điều không tốt cho phát triển đưa môi trường tự nhiên Hình 3.10 Kết ảnh hưởng NAA lên phát triển rễ sau tuần Đối với môi trường có bổ sung IAA rễ có thay đổi theo tăng nồng độ IAA bổ sung Tỷ lệ rễ đạt 100% nồng độ (0,10 – 0,30 mg/l IAA) sau tuần nuôi cấy đạt tỷ lệ 100% sau tuần nuôi cấy đối với nồng độ IAA 0,40 mg/l Quá trình rễ, số lượng rễ tăng tỷ lệ thuận đối với nồng độ IAA bổ sung (0,10 – 0,30 mg/l) đạt hiệu quả tốt nồng độ 0,30 mg/l IAA Sau tuần nuối cấy, tỷ lệ rễ đạt 100%, có số lượng rễ 5,55 ± 0,51 (rễ/chồi), chồi có rễ đồng đều, to khỏe, kích thước đạt 2,04 ± 2,12 (cm) Khi tăng nồng độ IAA lên 0,40 mg/l sinh trưởng in vitro giảm: rễ có chất lượng rễ thấp, không đồng đều, nhỏ ngắn với số lượng rễ 4,67 ± 0,57 (rễ/chồi) kèm theo thân ngắn Sự phát sinh rễ mẫu môi trường MS – NAA thể Hình 3.11 Đây đặc điểm lợi cho in vitro đưa tự nhiên 57 ============================================================== Hình 3.11 Kết ảnh hưởng IAA lên phát triển rễ sau tuần Kết luận: Từ kết quả thí nghiệm ta thấy, than hoạt tính auxin (NAA, IAA) nồng độ định đều có ảnh hưởng tốt đến hình thành phát triển rễ chồi in vitro hoa chuông Kết quả Bảng 3.6 3.7 cho thấy NAA nồng độ 0,20 mg/l có tác dụng tốt so với than hoạt tính cả IAA nồng độ, NAA lại có giá rẻ IAA Tóm lại, để tạo hoàn chỉnh nhân giống in vitro hoa chuông cần bổ sung 0,20 mg/l NAA vào môi trường nuôi cấy cho hiệu quả rễ phát triển tốt trước sau tự nhiên  Tóm tắt kết quả nghiên cứu nhân giống hoa chuông in vitro - Để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho trình nhân giống in vitro hoa chuông, sử dụng đoạn thân mang măt ngủ khử trùng mẫu NaOCl 2% với thời gian khử trùng 10 phút cho kết quả tốt nhât, tỷ lệ mẫu sống đạt 54,55% - Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc tái sinh chồi là: MS + 0,50 mg/l BAP + 30 g saccharose/l + g agar/l - Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi là: MS + 1,00 mg/l BAP + 0,10 mg/l NAA + 30 g saccharose/l + g agar/l Hệ số nhân chồi đạt 6,60 ± 1,11 lần, chiều cao chồi 3,17 ± 0,69 cm - Môi trường dĩnh dưỡng khoáng thích hợp cho cấy chuyển giúp sinh trưởng phát triển tốt là: MS + 30 g saccharose/l + g agar/l đạt chiều cao 3,65 ± 0,47 cm, số lượng 12,6 ± 1,82 - Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc tạo rễ cho hao chuông in vitro có hiệu quả là: MS + 0,20 mg/l NAA + 30 g saccharose/l + g agar/l Tỷ lệ rễ đạt 58 ============================================================== 100%, giống in vitro khỏe, rễ đồng đều nhiều lông tơ có chiều dài 4,59 ± 0,52 cm, số lượng rễ đạt 7,67 ± 0,58 Chăm sóc vườn ươm 3.2 Giá thể trồng nơi mà sau nuôi cấy in vitro tiếp xúc đầu tiên làm quen với môi trường tự nhiên Giá thể giúp đứng vững cung cấp nước, chất dinh dưỡng cho phát triển tốt Đối với sau đưa vườn ươm giá thể có vai trò quan trọng việc ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sống, phát triển Chính vậy, việc lựa chọn giá thể phù hợp cho cần thiết, có ý nghĩa quan trọng đến thành công qui trình nhân giống in vitro kèm theo vấn đề về kinh tế khác Nghiên cứu thực in vitro hoàn chỉnh có kích thước đồng đều khỏe mạnh (cây cao – cm, – lá, rễ khỏe mạnh có từ – rễ) trồng loại giá thể khác nhau, kết quả theo dõi liên tục thể Bảng 3.9 Bảng 3.8 Ảnh hưởng loại giá thể cách phối trộn lên tỉ lệ sống phát triển vườn ươm sau tuần chăm sóc STT Giá thể trồng Tỷ lệ sống Chiều cao (%) (cm) Số / Đường kính tán (cm) Đất 54,17b 5,35 ± 0,81b 4,75 ± 0,65b 8,5 ± 0,58b Cát 87,50a 6,15 ± 0,87b 6,25 ± 0,65ab 9,38 ± 0,48b 79,17ab 7,18 ± 0,36ab 7,20 ± 0,91ab 10,1 ± 0,84ab 85,42a 7,45 ± 0,81a 9,20 ± 0,81a 91,67a 7,82 ± 0,56a 10,4 ± 0,49a Đất + Xơ dừa (1:1) Xơ dừa + Trấu hun (1:1) 15,25 ± 0,50ab Đất + Xơ dừa + Trấu hun (1:1:1) 16,78 ± 0,52a 59 ============================================================== Ghi chú: Các chữ a, b khác cột thể sai khác theo chiều giảm dần, có ý nghĩa thống kê với p = 0,05 phép thử Duncan Từ kết quả Bảng 3.9 ta thấy, loại giá thể khác sử dụng để trồng đều có ý nghĩa quan trọng gây ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống, khả sinh trưởng phát triển in vitro giai đoạn vườn ươm Các loại giá thể trồng sử dụng riêng thành phần phối trộn thành phần khác theo tỷ lệ 1:1 Trong loại giá thể Bảng 3.9 cho thấy, giá thể đất + xơ dừa + trấu hun với tỷ lệ phối trộn (1:1:1) có khả thoát nước giữ ẩm tốt, dinh dưỡng cao phải cần xử lý trước trồng cây, tránh mầm bệnh sâu hại, giá thể cho tỷ lệ sống sinh trưởng phát triển hoa chuông in vitro tốt so với loại giá thể khảo sát Cây có tỷ lệ sống cao đạt 91,67%, sau khoảng thời gian từ – ngày bắt đầu phát sinh rễ hình thành mới để thích nghi với điều kiện tự nhiên Kết quả sau tuần nuôi, đạt chiều cao 7,82 ± 0,56 (cm), số lá/cây 10,4 ± 0,49 (cái), đường kính tán 16,78 ± 0,52 (cm), chất lượng giống tốt, dày, to đều, có màu xanh đậm Các loại giá thể: cát, đất + xơ dừa (1:1), xơ dừa + trấu hun (1:1), đều có khả thoát nước, giữ ẩm tốt có tỷ lệ sống cao từ 79,17 - 87,5% hàm lượng dinh dưỡng không cao nên khả sinh trưởng phát triển tỷ lệ thuận với mức dinh dưỡng loại giá thể Riêng đối với giá thể đất thường bị dính, khả thoát nước kém… sử dụng để ươm hoa chuông in vitro cho kết quả thấp: tỷ lệ sống chỉ đạt 54,17%, thời gian rễ mới chậm lên đến 10 – 12 ngày sau trồng, không phù hợp cho giai đoạn vườn ươm qui trình nhân giống in vitro hao chuông: thấp, không đồng đều, kích thước nhỏ…(Hình 3.13) Hoa chuông phù hợp cho việc trồng chậu có đường kính, độ cao từ 15 – 20 cm giá thể có đặc tính thoát nước giữ ẩm tốt giúp tăng tỷ lệ sống Kèm theo đó, giá thể có mức độ dinh dưỡng cao giúp sinh trưởng phát triển tốt làm tăng xuất cho qui trình nuôi trồng Kết luận: Trong loại giá thể nghiên cứu Bảng 3.8, giá thể phù hợp giúp cho có tỷ lệ sống sinh trưởng phát triển tốt đất + xơ dừa + trấu hun với tỷ lệ (1:1:1) 60 ============================================================== Hình 3.12 Kết ảnh hưởng giá thể lên tỷ lệ sống phát triển theo thứ tự loại giá thể từ – sau tuần Tóm lại: Từ kết qủa thí nghiệm thu được, đề xuất qui trình kỹ thuật nhân giống in vitro hoa chuông nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ theo sơ đồ hình 3.12 61 ============================================================== Hình 3.13 Sơ đồ qui trình kỹ thuật nhân giống in vitro hoa chuông nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ 62 ============================================================== CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết quả thu thí nghiệm, rút kết luận sau: 4.1.1 Xác định qui trình nhân giống hoa chuông in vitro - Mẫu đưa vào nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ, phương pháp khử trùng dùng NaOCl 2% với thời gian khử trùng 10 phút cho kết quả tốt nhât, tỷ lệ mẫu sống đạt 54,55% - Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc tái sinh chồi là: MS + 0,50 mg/l BAP + 30 g saccharose/l + g agar/l - Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi là: MS + 1,00 mg/l BAP + 0,10 mg/l NAA + 30 g saccharose/l + g agar/l Hệ số nhân chồi đạt 6,60 ± 2,14 lần, chiều cao chồi 3,17 ± 0,69 cm - Môi trường dinh dưỡng khoáng thích hợp cho cấy chuyển giúp sinh trưởng phát triển tốt là: MS + 30 g saccharose/l + g agar/l đạt chiều cao 3,65 ± 0,47 cm, số lượng 12,6 ± 1,82 - Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc tạo rễ cho hoa chuông in vitro có hiệu quả là: MS + 0,20 mg/l NAA + 30 g saccharose/l + g agar/l Tỷ lệ rễ đạt 100%, giống in vitro khỏe, rễ đồng đều nhiều lông tơ có chiều dài 4,59 ± 0,52 cm, số lượng rễ đạt 7,67 ± 0,58 4.1.2 Xác định giá thể phù hợp cho ươm in vitro giai đoạn vườn ươm - Tiêu chuẩn giống hoa chuông in vitro đưa vườn ươm: đạt – lá/cây, rễ nhiều đông đều, chiều dài rễ: 0,5 – cm, có chiều cao – cm, khỏe mạnh dấu hiệu mầm bệnh hay nấm ký sinh - Giá thể phù hợp cho giai đoạn ươm thích hợp đất + xơ dừa + trấu hun (1:1:1) Tỷ lệ sống đạt 91,67%, chỉ tiêu đánh giá khác về sinh trưởng phát triển đạt chất lượng tốt 4.2 Kiến nghị Trong thời gian nghiên cứu có số kiến nghị nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống in vitro hoa chuông 63 ============================================================== - Tiếp tục nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hiệu quả với hóa chất khử trùng khác HgCl2, H2O2… phận khác hoa chuông - Nghiên cứu trình sinh trưởng phát triển hoa chuông in vitro giai đoạn vườn ươm nhiều tổ hợp giá thể khác nhau, đưa thời vụ trồng cây, thành phần phân bón bổ sung cho phát triển tốt mang lại suất cao - Tích cực phổ biến rộng rãi kỹ thuật nhân giống biện pháp kỹ thuật ươm trồng giống hao chuông vào sản xuất, mỡ rộng diện tích trồng hoa chuông trường Đại học Nha Trang nói riêng địa bàn tỉnh Khánh Hòa nói chung - Sử dụng phương pháp gây đột biến nhằm tạo giống hoa chuông có màu sắc hoa mới lạ, có khả sinh trưởng tốt hơn, chống chịu với mầm bệnh khí hậu tốt 64 ============================================================== TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Ngô Xuân Bình (2010), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 296 tr Lê Văn Chi (1992), Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng vi lượng đạt hiệu cao, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 132 tr Lê Hữu Cần Nguyễn Thị Hồng Minh (2005), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ in vitro nhân nhanh hoa chuông Thanh Hóa, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, kỳ – tháng 12/2005, trang 39 – 41 Lã Thị Thu Hằng, Nguyễn Tiến Long, Trần Thị Triêu Hà, Trần Văn Minh (2012), Đánh giá khả sinh trưởng, phát triển sâu bệnh giống hoa chuông giá thể khác Thừa Thiên Huế vụ Đông Xuân năm 2009 – 2010, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, tr 158 – 163 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Xuân Nguyên, Phan Xuân Huyên (2005), Nhân nhanh in vitro hoa chuông phương pháp nuôi cấy đốt xử lý rễ in vitro, Tạp chí Sinh học, 27, tr 66 – 69 Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Nhẫn, Mai Thị Tân, Nguyễn Thị Kim Thanh (2007), Giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 162 tr Nguyễn Quang Thạch, Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Xuân Tường, Nguyễn Công Hoan, Nguyễn Thị Lý Anh (2004), Nghiên cứu nhân nhanh hoa chuông (Sinningia speciosa), Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, 4, tr 239 – 244 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Quang Minh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2009), Cơ sở công nghệ sinh học - Tập 3- Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục Việt Nam, 551 tr Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr 336 – 342 Lê Nguyễn Lan Thanh, Nguyễn Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Hương Lan Nguyễn Văn Sơn (2014), khảo sát khả sinh trưởng phát triển giống hoa chuông (Sinningia speciosa) từ nguồn gen in vitro Tiền Giang, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 4, tr 162 – 167 Hoàng Minh Tấn, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Quang Thạch (2006), Giáo trình sinh lý thực vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 392 tr 65 ============================================================== Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 349 tr Tài liệu tiếng anh Abbasi, Pervaiz T, Hafiz IA, Yaseen M and Hessain A (2013), Assessing the response of indigenous loquat cutivar Mardan to phytohormone for in vitro shoot proliferation and rooting, Afican Journal of Biotechnology, 14, pp 774-784 George NK, and Eichert T (2008), Uptake of hydrophilic solutes through plant leaves: current state of knowledge and perspectives of foliar fertilization, Critical Reviews in Plant Sciences, 28, pp 36-68 Husen and Pal M (2007), Metabolic changes during adventinous root primordium development in Tectona grandis Linn.f (teak) cuttings as affected by age of donor plants and auxin (IBA and NAA) treatment, New Forest, 33, pp 309-323 Ioja-Boldura F and Ciulca S (2013), Assessment of “in vitro” propagation potential for some gloxinia (Sinningia speciosa) genotypes, Journal of Horticulture, Forestry and Biotechnology, 17, pp – 11 Karim, Amin MN, Azad MAK, Begum F, Islam MM and Alam R (2003), Effects of Different Plant Growth Regulator on in vitro shoot multiplication of Chrysanthemum morifolium, Online Journal of Biological Sciences, 3, pp 553-569 Murashige T and Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures, Physiol Plant, 15, pp 473-497 Mantell SH, Mathews JA and McKee RA (1985), Principles of Plant Biotechnology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 22, pp 335 – 347 Naz S, Ali A, Siddiqui FA and Iqbal J (2001), In vitro propagation of gloxinia (Sinningia speciosa), Pakistan Juornal of Botanny, 33, pp 125 – 129 Nhut DT, Nguyet NA, Phuc HT, Huy NP, Uyen PN, Vi TK, Hai NT and Thien NQ (2005), Primary designs of tube-shaped nylon film culture system in shoot regeneration of Sinningia spp Leaf explants, Proceedings of international Workshop on Biotechnology in Agriculture, Nong lam university Ho Chi Minh City, pp 131-133 Sharma S and Sharma M (2013), Improved protocol for in vitro propagation of gloxinia (Sinningia sp.), Journal of Cell and Tissue Research, 13, pp 3545-3548 Scaramuzzi F, Apollonio G and D’Emerico S (1999), Adventitious shoot regeneration from Sinningia speciosa leaf discs in vitro and stability of ploidy level in 66 ============================================================== subcultures, In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, Springer Berlin/Heidelberg, 35, pp 217-221 Vince - Pure D (1994), Photomorphogenesis and plant development In: Lumsden PJ, Nicholas JR and Davies WJ [eds.], Physiology, growth and development of plants in culture, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 33, pp 19-30 Waseem, Jilani MS and Khan MS (2009), Rapid plant regeneration of chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium L.) through shoot tip culture, Afican Journal of Biotechnology, 8, pp 1871-1877 Tài liệu internet http://nongnghiep.vn/trong-hoa-chuong-post121242.html http://ongbachau.vn/lam-vuon/ky-thuat-tu-trong-va-cham-soc-hoa-chuongc943a20150711064230897.htm http://tiepthinongnghiep.com/cay-an-trai-va-hoa-cay-canh/huong-dan-cachtrong-va-cham-soc-giong-hoa-chuong-moi-2902/huong-dan-cach-trong-va-cham-socgiong-hoa-chuong-moi-2902.html http://baogialai.com.vn/channel/744/201004/truong-dai-hoc-nl-hue-nhan-giong thanh-cong-giong-hoa-chuong-1939894/ http://bio-env.edu.vn/services/view/1457 http://khoahoc.tv/cach-trong-va-cham-soc-giong-hoa-chuong-moi-12292 http://www.hatgiongcaytrong.com/2013/07/ky-thuat-trong-va-cham-soc-hoachuong.html 67 ============================================================== PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Khoáng đa lượng MS (mg/ l) MS 1B (mg/l) NH4NO3 1650 825 KNO3 1900 950 CaCl2.2H2O 440 220 Mg2SO4.7H2O 370 185 KH2PO4 170 85 mg/ l mg/ l KI 0,83 0,83 H3BO3 6,2 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 Na2.EDTA 37,3 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 mg/ l mg/ l Myo-Inositol 100 100 Nicotinic acid 0,5 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 0,5 Thiamine HCl 0,1 0,1 Glycine 2,0 2,0 Khoáng vi lượng Vitamin chất hữu 68 ============================================================== Phụ lục 2: Ảnh hưởng (BAP NAA) lên phát sinh chồi bất định từ kích thước hình thái chồi sau phát sinh BAP (mg/l) NAA Hệ số nhân Chiều cao chồi (mg/l) chồi (lần) (cm) 0,05 1,40 ± 0,05 1,79 ± 0,57 6,50 ± 0,58 +++ 0,10 1,68 ± 0,11 1,94 ± 0,05 6,50 ± 1,71 +++ 0,15 1,60 ± 0,00 2,67 ± 0,12 4,50 ± 0,58 ++ 0,20 1,71 ± 0,12 2,67 ± 0,16 5,50 ± 0,58 +++ 0,05 2,11 ± 0,11 2,98 ± 0,17 6,50 ± 1,41 +++ 0,10 2,45 ± 0,52 2,17 ± 0,69 5,00 ± 1,15 ++ 0,15 2,67 ± 0,46 2,78 ± 0,76 5,50 ± 0,58 +++ 0,20 3,25 ± 0,52 2,87 ± 0,12 6,50 ± 0,58 +++ 0,05 3,43 ± 0,57 3,12 ± 0,21 6,50 ± 0,58 +++ 0,10 3,55 ± 0,97 2,24 ± 0,21 6,50 ± 1,29 +++ 0,15 3,22 ± 0,77 2,00 ± 0,23 6,50 ± 0,58 +++ 0,20 3,11 ± 1,11 2,74 ± 0,34 6,50 ± 1,73 +++ 0,05 3,33 ± 1,11 2,10 ± 0,18 5,50 ± 0,58 ++ 0,10 3,60 ± 1,52 2,30 ± 0,32 5,50 ± 0,58 ++ 0,15 1,83 ± 1,06 2,54 ± 0,48 5,50 ± 1,41 + 0,20 1,50 ±0,80 1,87 ± 0,53 3,00 ± 1,1 + 0,05 1,17 ± 0,78 1,60 ± 0,48 3,50 ± 0,58 + 0,10 1,00 ± 0,39 1,43 ± 0,45 3,50 ± 0,58 + 0,15 0,83 ± 0,76 0,60 ± 0,22 3,00 ± 0,58 + 0,20 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,05 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,10 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,15 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,20 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 Số /chồi Chất lượng chồi 69 ============================================================== Phụ lục 3: Ảnh hưởng (BAP NAA) lên phát sinh chồi bất định từ chồi đỉnh kích thước hình thái chồi sau phát sinh BAP NAA Hệ số nhân chồi Chiều cao (mg/l) (mg/l) (lần) chồi (cm) 0,05 2,30 ± 0,50 2,96 ± 0,10 7,67 ± 1,15 +++ 0,10 2,50 ± 0,52 2,60 ± 0,53 6,50 ± 1,41 ++ 0,15 2,33 ± 0,50 2,78 ± 0,38 5,00 ± 1,15 +++ 0,20 3,07 ± 0,95 2,87 ± 0,23 7,00 ± 1,00 +++ 0,05 3,22 ± 0,83 2,97 ± 0,05 6,67 ± 1,53 +++ 0,10 3,00 ± 0,52 2,78 ± 0,48 7,33 ± 0,58 +++ 0,15 3,91 ± 0,54 2,36 ± 0,56 5,50 ± 0,58 ++ 0,20 4,12 ± 0,83 2,27 ± 0,47 5,00 ± 1,15 +++ 0,05 4,16 ± 0,77 2,24 ± 0,42 5,50 ± 0,58 ++ 0,10 4,45 ± 1,11 2,00 ± 1,00 6,50 ± 0,58 +++ 0,15 4,18 ± 0,83 2,98 ± 0,03 6,50 ± 0,58 +++ 0,20 4,14 ± 1,00 2,54 ± 0,50 6,50 ± 1,29 +++ 0,05 5,21 ± 1,11 1,90 ± 0,17 7,00 ± 1,00 ++ 0,10 5,11 ± 0,83 2,30 ± 0,52 6,67 ± 2,08 +++ 0,15 4,11 ± 1,11 2,36 ± 0,56 6,67 ± 1,53 +++ 0,20 3,80 ± 1,13 1,79 ± 0,36 7,00 ± 1,00 ++ 0,05 2,86 ± 0,50 1,74 ± 0,45 5,00 ± 1,73 ++ 0,10 2,70 ± 0,52 1,43 ± 0,51 5,67 ± 1,15 ++ 0,15 2,55 ± 0,93 0,55 ± 0,13 5,33 ± 1,53 + 0,20 2,19 ± 0,52 0,60 ± 0,10 5,50 ± 1,73 + 0,05 1,40 ± 0,50 0,83 ± 0,29 6,00 ± 1,15 + 0,10 1,45 ± 0,33 0,35 ± 0,26 5,50 ± 1,73 + 0,15 0,80 ± 0,11 0,40 ± 0,10 4,50 ± 2,08 + 0,20 0,60 ± 0,10 0,35 ± 0,26 4,50 ± 2,08 + Số /chồi Chất lượng chồi 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 ... Hình 1.2 Sự phong phú màu sắc hoa chuông 1.2 Các phương pháp nhân giống truyền thống hoa chuông Hoa chuông loại hoa dễ chịu về vi c nhân giống Trong tự nhiên hoa nhân giống cả hai phương pháp hữu... NHA TRANG VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa). .. ĐHTTTV  Phương pháp nhân giống in vitro trì nhân nhanh kiểu gen quý: Nhân giống in vitro trì nhân nhanh kiểu gen quý nhân nhanh hoa, dược liệu… khó trồng hạt hay biện pháp nhân giống truyền thống,