i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG - - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM PHÂN LẬP TỪ VÙNG BIỂN NHA TRANG Cán hướng dẫn : ThS LÊ NHÃ UYÊN ThS PHAN THỊ HOÀI TRINH Sinh viên thực : PHẠM THỊ THANH Mã số sinh viên : 55132666 Lớp : 55SH2 Nha Trang, tháng năm 2017 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG - - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM PHÂN LẬP TỪ VÙNG BIỂN NHA TRANG Cán hướng dẫn : ThS LÊ NHÃ UYÊN ThS PHAN THỊ HOÀI TRINH Sinh viên thực : PHẠM THỊ THANH Mã số sinh viên : 55132666 Lớp : 55SH2 Nha Trang, tháng năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Lê Nhã Uyên (Giảng viên Viện Công nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại Học Nha Trang) ThS Phan Thị Hoài Trinh (Cán phòng Công nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang), người tận tình dìu dắt, hưỡng dẫn suốt trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, toàn thể thầy cô giáo tận tình dạy cho nhiều kiến thức quý báu suốt bốn năm học qua Tôi chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, anh chị phòng Công nghệ sinh học biển, đặc biệt chị Ngô Thị Duy Ngọc giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho thực đồ án Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè quan tâm, động viên, cổ vũ, giúp đỡ trình học tập hoàn thiện đồ án Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng năm 2017 Sinh viên Phạm Thị Thanh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vùng nghiên cứu 1.2 Đặc điểm nấm sợi 1.2.1 Hình thái, cấu tạo 1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 1.2.3 Phương thức sinh sản 1.2.4 Vai trò nấm sợi 1.2.5 Phân loại nấm sợi 1.3 Khả hình thành chất kháng sinh từ nấm sợi 11 1.3.1 Những đặc điểm chất kháng sinh 11 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh kháng sinh 11 1.3.3 Khả sinh kháng sinh vi nấm 12 1.3.4 Cơ chế tác dụng chất kháng sinh 15 1.3.5 Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh từ vi nấm biển 17 1.4 Ứng dụng chất kháng sinh từ vi nấm biển thực tiễn 19 1.4.1 Điều trị tượng lờn thuốc vi nấm 19 1.4.2 Phòng chống bệnh hại trồng 20 1.4.3 Phòng chống côn trùng hại trồng 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 22 2.2.1 Vật liệu 22 2.2.1.1 Vi nấm biển 22 2.2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 22 2.2.2 Hoá chất 22 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 23 iii 2.2.4 Các môi trường sử dụng nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Quy trình phân lập vi nấm từ vùng biển Nha Trang 24 2.3.2 Quy trình sàng lọc chủng vi nấm biển có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn 26 2.3.3 Phương pháp định danh vi nấm biển quan sát vi thể nấm sợi 28 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện lên men lên hoạt tính kháng khuẩn vi nấm biển tuyển chọn 28 2.3.4.1 Ảnh hưởng thời gian lên men 28 2.3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ muối môi trường lên men 29 2.3.4.3 Ảnh hưởng pH môi trường lên men 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết phân lập vi nấm từ mẫu biển thu thập vùng biển Nha Trang 30 3.2 Sàng lọc khả sinh chất kháng khuẩn chủng vi nấm biển tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao 36 3.3 Kết xác định đặc điểm hình thái định danh chủng vi nấm biển 40 3.3.1 Đặc điểm hình thái 40 3.3.2 Định danh chủng vi nấm biển 41 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng điều kiện lên men đến hoạt tính kháng khuẩn chủng vi nấm biển tuyển chọn 42 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian lên men 42 3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ muối môi trường lên men 43 3.4.3 Ảnh hưởng pH môi trường lên men 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 Kết luận 47 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 57 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh KS : Kháng sinh NS : Nấm sợi VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định MT : Môi trường EA : Ethyl acetate KL : Khuẩn lạc VK : Vi khuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách mẫu sinh vật biển thu nhận Nha Trang 30 Bảng 3.2 Danh sách đặc điểm hình thái chủng vi nấm biển phân lập từ bọt biển 32 Bảng 3.3 Danh sách đặc điểm hình thái chủng vi nấm biển phân lập từ rong biển 34 Bảng 3.4 Danh sách đặc điểm hình thái chủng vi nấm biển phân lập từ trầm tích 35 Bảng 3.5 Danh sách đặc điểm hình thái chủng vi nấm biển phân lập từ san hô mềm 36 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn chủng vi nấm biển phân lập từ Nha Trang 37 Bảng 3.7 Thành phần hóa học thành tế bào vi khuẩn Gram (+) Gram (-) 39 Bảng 3.8 Đặc điểm phân loại chủng nấm sợi 01NT.1.1.5 41 v DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Vị trí lấy mẫu vi sinh vật biển Đầm Bấy Nha Trang, Khánh Hòa Hình 1.2 Các loại sợi nấm Hình 1.3 Cấu trúc sợi nấm Hình 1.4 Sinh sản hữu tính nấm sợi Hình 1.5 Khuẩn lạc Penicillium kháng tụ cầu vàng S aureus năm 1928 13 Hình 1.6 Cơ chế tác dụng chất kháng sinh 17 Hình 2.1 Sơ đồ trình phân lập vi nấm biển 24 Hình 2.2 Sơ đồ trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn vi nấm biển 26 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng vi nấm biển 01NT.1.1.5 môi trường CYA 40 Hình 3.2 Cuống sinh bào tử chủng nấm biển 01NT.1.1.5 40 Hình 3.3 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh hợp chất kháng khuẩn chủng 01NT.1.1.5 42 Hình 3.4 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sinh hợp chất kháng khuẩn chủng 01NT.1.1.5 44 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH lên khả sinh hợp chất kháng khuẩn chủng 01NT.1.1.5 45 MỞ ĐẦU Biển nguồn cung cấp phong phú đa dạng chất có hoạt tính sinh học thu hút quan tâm đặc biệt nhà khoa học giới Đã có nhiều hợp chất phát từ sinh vật biển sinh sống nơi có điều kiện khắc nghiệt độ mặn, áp suất cao hơn, nhiệt độ thay đổi, pH [25] Chính thế, hợp chất có đặc tính vô quý báu, nguồn tiềm cung cấp dược liệu chữa bệnh cho người [23],[ 75] Các hợp chất thu có hoạt tính sinh học vô đa dạng bao gồm: tính kháng khuẩn [18],[ 34],[ 38],[ 92]; chống viêm [69]; gây độc tế bào [51],[ 78]; kháng nấm [44]; kháng virus kháng u [63],[ 65],[ 68] Trong số vi sinh vật biển vi nấm nhóm nghiên cứu nhiều giới [18],[ 70],[ 85] Cụ thể, nhà khoa học phát 272 hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ vi nấm biển [41] Theo tác Pietra (1997) [73], Rodrigues et al (2000) [83] Raghukumar et al (1994) [76], vi nấm biển nguồn sinh vật có tiềm việc sinh hợp chất thứ cấp, chứa lượng lớn enzyme, đặc biệt lượng lớn chất kháng sinh [66],[ 83] Theo Ebel R (2010) [50] điều mở hướng nghiên cứu ứng dụng y học, phát triển thuốc [53],[ 62] ngành công nghiệp thực phẩm [91] Ở Việt Nam nước phát triển, việc lạm dụng thuốc kháng sinh gây nên xuất nhiều chủng vi sinh vật kháng thuốc nên việc điều trị kháng sinh trở nên khó khăn Vấn đề tìm kiếm chất kháng sinh mới, có nguồn gốc từ thiên nhiên vi sinh vật tiết chống lại vi sinh vật gây bệnh lờn thuốc thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học, việc làm vô cấp thiết quan trọng [26] Trong có số lượng lớn chất kháng sinh tìm thấy từ nấm biển chứng minh Rateb et al (2011) [79] Blunt et al (2015) [39] Việt Nam quốc gia có chiều dài bờ biển 3.200 km, sở hữu nguồn tài nguyên biển vô phong phú, đa dạng Tuy nhiên, việc nghiên cứu khai thác lợi ích từ vi nấm biển tương đối chưa thực quan tâm, đặc biệt vùng biển Nha Trang Do vậy, khuôn khổ luận văn tốt nghiệp này, thực đề tài: “Khảo sát khả kháng khuẩn vi nấm phân lập từ vùng biển Nha Trang”  Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng vi nấm, xác định khả kháng khuẩn điều kiện lên men tối ưu chủng vi nấm tuyển chọn  Nội dung nghiên cứu - Phân lập vi nấm từ số mẫu bọt biển, san hô mềm, rong biển trầm tích thu vùng biển Nha Trang - Sàng lọc khả kháng khuẩn chủng vi nấm phân lập số chủng vi sinh vật kiểm định tuyển chọn chủng có khả kháng khuẩn cao - Định danh phương pháp giải trình tự xác định đặc điểm hình thái chủng vi nấm tuyển chọn môi trường đặc trưng - Xác định điều kiện lên men tối ưu chủng vi nấm biển tuyển chọn qua thông số: Thời gian, nồng độ muối pH môi trường  Ý nghĩa khoa học - Thu nhận thêm thông tin khoa học số chủng vi nấm biển thu thập vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa  Ý nghĩa thực tiễn - Xây dựng quy trình phân lập, xác định khả kháng khuẩn thu nhận hợp chất kháng khuẩn thô từ vi nấm biển, từ định hướng nghiên cứu việc tách chiết hợp chất kháng khuẩn để ứng dụng thực tế CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vùng nghiên cứu Vị trí địa lý thủy văn Đầm Bấy - Nha Trang, Khánh Hòa Khánh Hòa tỉnh ven biển miền Trung nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, khoảng 11o41’53” - 12o52’12’’ vĩ độ Bắc 108o40’12’’ - 109o30’00’ kinh Đông Độ dài bờ biển xấp xỉ 200 km Khánh Hòa có khoảng 200 đảo với tổng diện tích khoảng 600 km2 Các vịnh đầm phá phân bố liên tục dọc theo đường bờ biển Khánh Hòa: Vũng Rô - Đại Lãnh, Vũng Bến Gỏi - Vịnh Vân Phong, Vịnh Bình Cang, Đàm Nha Phu Đầm Thủy Triều - Vịnh Cam Ranh Hệ thống Vịnh góp phần vào đặc trưng địa mạo, trầm tích yếu tố thủy động lực làm cho vùng biển Nha Trang phức tạp, đa dạng phong phú nguồn lợi vi sinh vật (VSV) [4] Đầm Bấy thủy vực nhỏ nằm phía Đông Nam đảo Hòn Tre vịnh Nha Trang Đầm Bấy có diện tích 132,5 ha, với tổng thể tích nước mực nước triều trung bình khoảng 12.649.842 m3; độ rộng cửa 853 m, độ dài dọc theo trục đầm 2.368 m, chỗ hẹp 334 m, nơi rộng 1.060 m Đây vùng nước đẹp, yên tĩnh, nước sạch, có bãi cát mịn, sinh thái học đa dạng độc đáo, nơi phù hợp để triển khai nghiên cứu thí nghiệm sinh học, sinh thái môi trường biển [19] Hình 1.1.Vị trí lấy mẫu vi sinh vật biển Đầm Bấy Nha Trang, Khánh Hòa 51 Tiếng Anh 34 Arasu V et al (2008), "Antimicrobial activity of Streptomyces spp ERI-26 recovered from Western Ghats of Tamil Nadu", Mycmed 18, tr 147-153 35 Atalla M Mabrouk et al (2011), "Physiological Studies on Some Biologically Active Secondary Metabolites from Marine-Derived Fungus Penicillium brevicompactum", Gate2Biotech 1(1), tr 1‐15 36 Battley EH Bartlett EJ (1966), "A convenient pH gradient method for the determination of the maximum and minimum pH for microbial growth", Antonie Van Leeuwenhoek 32, tr 245-255 37 Bauer AW et al (1966), "Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method", Am J Clin Pathol 36, tr 493-496 38 Bhadury P, Mohammad B.T Wright P.C (2006), "The current status of natural products from marine fungi and their potential as anti-infective agents", J Ind Microbiol Biotechnol 33, tr 325-337 39 Blunt J.W et al (2015), "Marinenaturalproducts", Nat Prod Rep 32, tr 116211 40 Brakhage A A Scheper T (2004), "Molecular Biotechnology of Fungal Lactam Antibiotics and Related Peptide Synthetases - Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology", Springer Berlin Heidelberg New York 88, tr 4749 41 Bugni T S Ireland C M (2004), "Marine derived fungi: a chemically and biologically diverse group of microorganisms", Nat Prod Rep 21, tr 143-163 42 Cantrell S A, Casillas-Martinez L Molina M (2006), "Characterization of fungi from hypersaline environments of solar salterns using morphological and molecular techniques", Mycol Res 110, tr 962-970 43 Carsten Christophersen et al (1999), "Antibacterial activity of marine-derived fungi", Mycopathologia 143(3), tr 135-138 44 Clark R.J, Garson M.J Hooper J.N (2001), "Antifungal alkyl amino alcohols from the tropical marine sponge Haliclona sp.", J Nat Prod 64, tr 1568-1571 45 Cooke RC Whipps JM (1993), "Ecophysiology of fungi", Blackwell, Oxford 52 46 Cuomo V et al (1995), "Antimicrobial activities from marine fungi Journal of Marine Biotechnology", 4, tr 199-204 47 Dela Cruz T E, Wagner S Schulz B (2006), " Physiological responses of marine Dendryphiella species from different geographical locations", Mycol Progress 5, tr 108-119 48 Devi P et al (2009), " Batch culture fermentation of Penicillium chrysogenum and a report on the isolation, purification, identification and antibiotic activity of cinitrin", Indian J Mar Sci 38(1), tr 38-44 49 Didha Andini Putria, Ocky Karna Radjasab Delianis Pringgeniesc (2015), "Effectiveness of marine fungal symbiont isolated from soft coral Sinularia sp from Panjang Island as antifungal", Procedia Environmental Sciences 23, tr 351 - 357 50 Ebel R (2010), "Terpenes from Marine-Derived Fungi", Marine Drugs 8(8), tr 2340 2368 51 Erickson K.L et al (1997), "Salicyliha- lamides A and B, novel cytotoxic macrolides from the marine sponge Haliclona sp.", J Org Chem 62, tr 81888192 52 Falkowski PG, Barber RT Smetacek V (1998), "Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production", Science 281, tr 200-206 53 Fenical W (1993), "Chemical studies of marine bacteria: Modular developing a new resource", Chem Rev 93, tr 1673-1683 54 Field CB et al (1998), "Primary production of the biosphere: integrating terrestrial and oceanic components", Science 281, tr 237-240 55 Gareth Jones E B (2011), "Fifty years of marine mycology", Fungal Diversity 50, tr 73-112 56 Gogoi D K et al (2008), "Optimization of process parameters for improved production of bioactive metabolite by a novel endophytic fungus Fusarium sp DF2 isolated from Taxus wallichiana of North East India", World J Microbiol Biotechnol 24, tr 79-87 53 57 Hayes A et al (1997), "Environmental signals triggering methylenomycin production by Streptomyces coelicolor A3", J Bacteriol 179, tr 5511-5515 58 Huang et al (2011), "Effect of salinity on the growth, biological activity and secondary metabolites of some marine fungi Acta Oceanol", Sin 30(3), tr 118123 59 Iqbal Ahmad, Farah Ahmad John Pichtel (2011), "Microbes and Microbial Technology - Agricultural and Environmental Applications", Springer Berlin Heidelberg New York, tr 447-453 60 Jain P Pundir R K (2011), "Effect of fermentation medium, pH and temperature variations on antibacterial soil fungal metabolite production", J Agric Technol 7, tr 247-269 61 Jinkai Zheng et al (2013), "Antimicrobial ergosteroids and pyrrole derivatives from halotolerant Aspergillus flocculosus PT05-1 cultured in a hypersaline medium", Extremophiles 17, tr 963-971 62 Kobayashi J Ishibashi M (1993), "Bioactive metaboclic lites of symbiotic marine microorganisms", Chem Rev 93, tr 1753-1769 63 M.H.G Munro et al (1987), The search for antiviral and anticancer compounds from marine organisms, Bioorganic Marine Chemistry (Scheuer P.J, Ed), Springer Verlag, Heidelberg, 93-176 64 Masuma R et al (2001), "Effect of sea water concentration on hyphal growth and antimicrobial metabolite production in marine fungi", Mycoscience 42(455-459) 65 Mayer A.M Gustafson K.R (2008), "Marine pharmacology in 2005-2006: Antitumour and cytotoxic compounds", Eur J Cancer 44, tr 2357-2387 66 Mayer A.M V.K.B Lehmann (1998), "Marine pharmacology: marine compounds with antibacterial, anticoagulant, antifungal antiinflammatory, anthelmintic, antiplatelet, antiprotozoal, and antiviral activities; with actions on the cardiovascular, endocrine, immune, and nervous systems; and other miscellaneous mechanisms of Action", The Pharmacologist 42, tr 62-69 54 67 Miao L, Kwong TFN Qian PY (2006), "Effect of culture conditions on mycelial growth, antibacterial activity, and metabolite profiles of the marinederived fungus Arthrinium c.f saccharicola", Appl Microbiol Biotechnol 72, tr 1063-1073 68 Nastrucci C, Cesario A Russo P (2012), "Anticancer drug discovery from the marine environment", Recent Pat Anti Cancer Drug Discov 7, tr 218-232 69 Newman D.J Hill R.T (2006), "New drugs from marine microbes: the tide is turning", J Ind Microbiol Biotechnol 33, tr 539-544 70 Overya D.P et al (2014), "An assessment of natural product discovery from marine (sensu strictu) and marine-derived fungi", Mycology 3, tr 145-167 71 P N Bhattacharyya D K Jha (2011), "Optimization of cultural conditions affecting growth and improved bioactive metabolite production by a subsurface Aspergillus strain TSF 146", International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 2(4), tr 133-143 72 Philippe Petit et al (2009), "Novel antimicrobial secondary metabolites from a Penicillium sp isolated from Brazilian cerrado soil", Electronic Journal of Biotechnology 12(4), tr 1-9 73 Pietra F (1997), "Secondary metabolites from marine microorganisms: bacteria protozoa, algae and fungi.Achievements and prospects", Natural Product Report 14, tr 453-464 74 Prabha Devi et al (2011), "Screening marine organisms for antimicrobial activity against clinical pathogens", Indian Journal of Geo-Marine Sciences 40(3), tr 338-346 75 Proksch P, Edrada-ebel R Ebel R (2003), Mar Drugs 1(1), tr 5-17 76 Raghukumar C et al (1994), "Laccase and other lignocellulose modifying enzymes of marine fungi isolated from the coast of India", Botanica Marina 37, tr 515-523 77 Rajasekar T et al (2012), "Isolation and characterization of Marine fungal metabolites against clinical pathogens", Asian Pacific Journal of Tropical Disease, tr S387-S392 55 78 Rashid M.A et al (2000), "Haligra- mides A and B, two new cytotoxic hexapeptides from the marine sponge Haliclona nigra", J Nat Prod 63, tr 956959 79 Rateb M.E Ebel R (2011), "Secondary metabolites of fungi from marine habitats", Nat Prod Rep 28, tr 290-344 80 Recca J Mrak EM (1952), "Yeast occurring in citrus products", Food Technol 6, tr 450-454 81 Ritchie F, Bain R A McQuilken M P (2009), "Effects of nutrient status, temperature and pH on mycelial growth, sclerotial production and germination of Rhizoctonia solani from potato", J Plant Pathol 91, tr 589-596 82 Robert A Samson, Cobus M Visagie Jos Houbraken (2014), Species diversity in Aspergillus, Penicillium and Talaromyces, Tập 78, Studies in Mycology, tr.35-36 83 Rodrigues K.F, Hesse M Werner C (2000), "Antimicrobial activities of secondary metabolites produced by endophytic fungi from Spondias mombin", Journal of Basic Microbiology 40, tr 261 267 84 Shamil Sh Afiyatullov et al (2015), "New eudesmane sesquiterpenes from the marine-derived fungus Penicillium thomii", Phytochemistry Letters 14, tr 209214 85 Silber J et al (2016), "From Discovery to Production: Biotechnology of Marine Fungi for the Production of New Antibiotics", Mar Drugs 14(137), tr 1-20 86 Singh CJ (2002), "Optimization of an extracellular protease of Chrysosporium keratinophilum and its potential in bioremediation of keratinic wastes", Mycopathologia 156, tr 151-156 87 Tan L T (2007), "Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery", Phytochemistry 68, tr 954-979 88 Thakur D et al (2009), "Influence of nutrition and culturing conditions for optimum growth and antimicrobial metabolite production by Streptomyces sp 201", J Med Mycol 19, tr 161-167 56 89 Thongwai N Kunopakarn J (2007), "Growth inhibition of Ralstonia solanacearum PT1J by antagonistic bacteria isolated from soils in the Northern part of Thailand", Chiang Mai J Sci 34, tr 345-354 90 Vahidi H, Kobarfard F Namjoyan F (2004), "Effect of cultivation conditions on growth and antifungal activity of Mycena leptocephala", Afr J Biotechnol 3, tr 606-609 91 Vande B.D.A A.J Vlietlinck (1991), Methods in plant Biochemistry: Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants, Academic Press, London, In: Dey P.Mp Harbone J.B ,(Eds), tr.47-69 92 Xu L et al (2015), "Antibacterial and Antifungal Compounds from Marine Fungi", Mar Drugs 13, tr 3479-3513 93 Yakoby N et al (2000), "pH regulation of pectate lyase secretion modulates the attack of Colletotrichum gloeosporioides on avocado fruits", Appl Environ Microbiol 66, tr 1026-1030 94 Yang BK et al (2000), "Production of Exo-polymers by submerged mycelial cultures of Cordyceps militaris and its hypolipidemic effect", J Microbiol Biotechnol 10, tr 784-788 95 Yang FC Liau CB (1998), "Effects of cultivating conditions on the mycelial growth of Ganoderma lucidum in submerged flask cultures", Bioprocess Eng 19, tr 233-236 96 Yang Laihuang et al (2007), "Effect of culture conditions on antifouling compound production of a sponge-associated fungus", Appl Microbiol Biotechnol 74(1221-1231) Tài liệu Internet 97 http://www.vast.ac.vn/component/detai/?view=detai&id=968 98 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/cautructebaovk.htm 57 PHỤ LỤC Phụ lục A phụ lục bảng biểu Bảng PL1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh hợp chất kháng khuẩn chủng 01NT.1.1.5 Đường kính vòng ức chế phát triển vi khuẩn (mm) Thời Khối gian lượng chất ( ngày) (g) 10 0.1374 15 - 12 0.1685 14 14 0.1842 16 B P S S coli faecalis 16 20 15 14 - - 17 19 16 17 - 16 - 18 21 16 19 - 0.2116 18 - 22 22 20 20 - 18 0.2269 19 - 25 22 22 25 - 20 0.2745 22 - 30 26 25 34 - 22 0.2359 17 - 24 24 18 20 - 24 0.2175 14 - 21 22 16 20 - 26 0.1691 13 - 20 21 15 17 - cereus aeruginosa aureus L С E mono albicans Bảng PL2 Ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sinh hợp chất kháng khuẩn chủng 01NT.1.1.5 Nồng Khối độ muối lượng chất Đường kính vòng ức chế phát triển vi khuẩn (mm) B P S E S coli faecalis L С (g/l) (g) cereus 10 0.1884 12 - 10 14 15 - 15 0.1972 13 - 11 13 13 10 - 20 0.2133 12 - 13 14 14 10 - 25 0.2471 13 - 20 17 17 15 - 30 0.2865 15 - 28 21 20 20 35 0.3578 20 - 32 22 24 28 11 40 0.3409 15 - 22 20 18 20 - 45 0.174 10 - 16 16 17 11 - aeruginosa aureus mono albicans 58 Bảng PL3 Ảnh hưởng pH lên khả sinh hợp chất kháng khuẩn chủng 01NT.1.1.5 Khối lượng Đường kính vòng ức chế phát triển vi khuẩn (mm) chất B (g) cereus 0.2154 19 - 0.3023 34 0.3867 pH P S S coli faecalis 20 10 10 25 - 34 31 28 35 12 36 - 33 32 30 33 19 0.3172 24 - 24 23 24 20 0.2963 14 - 15 17 11 15 0.201 12 - 14 10 11 15 - aeruginosa aureus Phụ lục B phụ lục hình Môi trường Sabouraud Glucose 40g Peptone 10g Agar 18-20g Sea water 1000ml pH 6-7 Hình PL1 Môi trường nuôi cấy vi nấm biển Môi trường MHA (Mueller-Hinton Agar) Cao Thịt bò 2g Acid Hydrolysate of Casein 17.50g Tinh bột 1.5g Agar 17g Nước cất vô trùng 100ml pH 7.3 Hình PL2 Môi trường nuôi cấy VSVKĐ L С E mono albicans 59 Môi trường Cz (Czapek Agar) Saccarose 30g NaNO3 3g KCl 0.5g K2HPO4.3H2O 1.3g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g CuSO4.5H2O 0.005g ZnSO4.7H2O 0.01g Agar 15g Nước biển: 1000ml Hình PL3 Môi trường xác định hình thái chủng vi nấm Gạo 20g Yeast Extract 20g KH2PO4 10g KNT 10g Sea Water 40ml pH 6-7 Hình PL4 Môi trường lên men gạo cho vi nấm Hình PL5 Các chủng vi nấm biển sau 14 ngày nuôi cấy môi trường Sabouraud thạch nghiêng 60 Hình PL6 Các chủng vi nấm biển sau ngày chiết EA Hình PL7 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chủng vi nấm biển 61 Hình PL8 Chủng vi nấm 01NT.1.1.5 chiết EA mốc thời gian 20 ngày (bên trái) Sản phẩm trao đổi chất sau chiết EA (bên phải) Hình PL9 Khoanh giấy tẩm chất kháng khuẩn mốc thời gian từ chủng vi nấm 01NT.1.1.5 62 Hình PL10 Chủng vi nấm 01NT.1.1.5 nồng độ muối sau 20 ngày môi trường gạo Hình PL11 Sản phẩm trao đổi chất chủng 01NT.1.1.5 nồng độ muối Hình PL12 Chủng vi nấm 01NT.1.1.5 mốc pH môi trường gạo 63 Hình PL13 Hoạt tính kháng khuẩn chủng 01NT.1 1.5 chủng S faecalis qua mốc thời gian khảo sát Hình PL14 Hoạt tính kháng khuẩn chủng 01NT.1 1.5 chủng B.cereus qua nồng độ muối gian khảo sát Hình PL15 Hoạt tính kháng khuẩn chủng 01NT.1 1.5 chủng C albicans qua mốc pH khảo sát 64 Hình PL16 Kết giải trình tự chủng vi nấm 01NT.1.1.5 65 Hình PL17 Kết so sánh trình tự chủng vi nấm 01NT.1.1.5 NCBI Hoạt tính kháng sinh (mm) (D-d) ≥ 25 (D-d) ≥ 20 (D-d) ≥ 10 – 19,5 (D-d) ≤ 10 Kết luận Rất mạnh Mạnh Trung bình Yếu Hình PL18 Hoạt tính kháng khuẩn = (D- d), mm với D = đường kính vòng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch) ... biệt vùng biển Nha Trang 2 Do vậy, khuôn khổ luận văn tốt nghiệp này, thực đề tài: Khảo sát khả kháng khuẩn vi nấm phân lập từ vùng biển Nha Trang  Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng vi. .. ĐẠI HỌC NHA TRANG VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG - - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành Công nghệ sinh học KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM PHÂN LẬP TỪ VÙNG BIỂN NHA TRANG Cán... trình phân lập vi nấm từ vùng biển Nha Trang 24 2.3.2 Quy trình sàng lọc chủng vi nấm biển có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn 26 2.3.3 Phương pháp định danh vi nấm biển quan sát