BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP - Lê Thị Xuân NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS THU THẬP VÀ SƯU TẦM TỪ VIỆT NAM, TRUNG QUỐC VÀ NHẬT BẢN Chuyên ngành: Quản lý bảo vệ tài nguyên rừng Mã số: 60.62.68 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PSG TS PHẠM QUANG THU Hà Nội, 2010 ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành chương trình đào tạo cao học trường Đại học Lâm nghiệp, nhằm vận dụng kiến thức học vào thực tiễn, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học khả tổng hợp phân tích vấn đề tác giả tiến hành thực Luận văn tốt nghiệp cao học Trong trình thực hoàn thiện luận văn, tác giả nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ đóng góp cán Phòng nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Khoa đào tạo sau Đại học – Trường Đại học Lâm nghiệp, từ gia đình bạn bè đồng nghiệp Tác giả xin chân thành cảm ơn ủng hộ, giúp đỡ Đặc biệt tác giả muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Quang Thu, người thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học tận tình quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi truyền đạt kiến thức quý báu suốt trình thực Luận văn hoàn thiện sở tham khảo nhiều tài liệu có liên quan ý kiến đóng góp nhiều nhà chun mơn nỗ lực tác giả Tuy nhiên khả năng, điều kiện thời gian hạn chế, chủ đề nghiên cứu hồn tồn nên luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót Tác giả mong nhận ý kiến đóng góp, xây dựng nhà khoa học bạn bè đồng nghiệp để Luận văn hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2010 Tác giả iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa……………………………………………………………………… i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vii Danh mục hình vii Đặt vấn đề Chương Tổng quan nghiên cứu .3 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2 Tình hình nghiên cứu nước 15 1.3 Nhận xét đánh giá từ cơng trình nghiên cứu ngồi nước 19 Chương Mục tiêu, đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu .21 2.2 Đối tượng nghiên cứu .21 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.3.1 Sưu tập, phân lập lưu trữ nguồn gen chủng nấm Cordyceps militaris 21 2.3.2 Đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết .21 2.3.3 Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng nấm 21 2.3.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi môi trường dịch thể 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Dụng cụ, thiết bị môi trường dinh dưỡng 22 2.4.2 Phương pháp sưu tập, phân lập lưu trữ nguồn gen chủng nấm Cordyceps militaris 22 2.4.2.1 Sưu tập nguồn gen 22 2.4.2.2 Phân lập chủng nấm từ mẫu Cordyceps militaris thu thập Việt Nam 22 2.4.2.3 Tốc độ sinh trưởng chủng nấm Cordyceps militaris .23 iv 2.4.2.4 Lưu trữ bảo quản nguồn giống 23 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết 24 2.4.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 24 2.4.3.2 Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng nhiệt độ không khí đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 24 2.4.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm khơng khí đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 25 2.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng độ pH môi trường đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 25 2.4.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chủng nấm 25 2.4.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chủng nấm thu 25 2.4.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm chủng nấm thu 26 2.4.5 Phương pháp nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi môi trường dịch thể 26 2.4.5.1 Phương pháp xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể .26 2.4.5.2 Phương pháp xác định tốc độ lắc q trình ni cấy 27 2.4.5.3 Phương pháp xác định thời gian thu hoạch 27 2.4.5.4 Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy .28 2.4.5.5 Phương pháp sản xuất bột nấm Cordyceps militaris 28 Chương Kết nghiên cứu 29 3.1 Sưu tập, phân lập lưu trữ nguồn gen chủng nấm Cordyceps militaris 29 3.1.1 Sưu tập chủng nấm từ Trung Quốc Nhật Bản 29 3.1.2 Kết phân lập mẫu nấm Cordyceps militaris thu thập Việt Nam 30 v 3.1.2.1 Đặc điểm hình thái giải phẫu mẫu nấm thu thập Việt Nam 30 3.1.2.2 Kết phân lập chủng nấm thu thập Việt Nam 34 3.1.2.3 Đặc điểm hình thái hệ sợi chủng nấm thu thập Việt Nam 35 3.1.3 Tốc độ sinh trưởng chủng nấm nuôi cấy khiết .36 3.1.4 Lưu trữ bảo quản nguồn giống 38 3.2 Đặc điểm sinh học hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy khiết 40 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 40 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ khơng khí đến sinh trưởng nấm 43 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm khơng khí đến sinh trưởng nấm 44 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng hệ sợi 46 3.2.5 Tổng hợp nhân tố sinh thái tối ưu cho sinh trưởng nấm 47 3.3 Nghiên cứu hoạt tính chủng nấm thu .48 3.3.1 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chủng nấm Cordyceps militaris 48 3.3.2 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng nấm chủng nấm thu 51 3.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi môi trường dịch thể 54 3.4.1 Xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể thu sinh khối hệ sợi 54 3.4.2 Xác định tốc độ lắc q trình ni cấy 58 3.4.3 Xác định thời gian thu hoạch 61 3.4.4 Thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy 63 3.4.5 Quy trình sản xuất bột nấm Cordyceps militaris .65 Kết luận 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi Danh mục bảng Bảng 3.1: Tổng hợp chủng nấm Cordyceps militaris thu thập Việt Nam .35 Bảng 3.2: Tốc độ sinh trưởng chủng nấm Cordyceps militaris môi trường nhân tạo .38 Bảng 3.3: Sinh trưởng chủng nấm sau thời gian lưu trữ bảo quản 38 Bảng 3.4: Kết xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm 41 Bảng 3.5: Kết xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm 43 Bảng 3.6: Kết xác định độ ẩm tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm 45 Bảng 3.7: Kết xác định pH môi trường tối ưu cho sinh trưởng nấm 46 Bảng 3.8: Tổng hợp nhân tố sinh thái tối ưu cho sinh trưởng nấm 48 Bảng 3.9: Kết so sánh khả kháng khuẩn nấm Cordyceps militaris 49 Bảng 3.10: Kết so sánh khả kháng nấm Fusarium oxysporum 52 Bảng 3.11: Kết xác định môi trường dịch thể nhân sinh khối hệ sợi tối ưu 55 Bảng 3.12: Kết xác định tốc độ lắc tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm .58 Bảng 3.13: Sinh khối hệ sợi nấm sau khoảng thời gian nuôi khác .61 Bảng 3.14: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác 63 vii Danh mục hình Hình 1.1: Nấm C militaris ni trồng thử nghiệm Viện KHLNVN………… 19 Hình 3.1: Hệ sợi Cordyceps militaris CM 30 Hình 3.2: Hệ sợi Cordyceps militaris F1010 30 Hình 3.3: Hệ sợi Cordyceps militaris F1012 30 Hình 3.4: Hệ sợi Cordyceps militaris F1080 30 Hình 3.5: Nấm Cordyceps militaris HL1 32 Hình 3.6: Nấm Cordyceps militaris HL2 32 Hình 3.7: Nấm Cordyceps militaris HL22 32 Hình 3.8: Nấm Cordyceps militaris HL34 33 Hình 3.9: Bào tử vơ tính Cordyceps militaris HL34 33 Hình 3.11: Bào tử hữu tính C militaris HL34 .33 Hình 3.12: Nấm C.militaris HL35 34 Hình 3.13: BT hữu tính C.militaris HL35 .34 Hình 3.14: BT hữu tính C.militaris HL35 34 Hình 3.15: Hệ sợi Cordyceps militaris HL2 36 Hình 3.16: Hệ sợi Cordyceps militaris HL22 36 Hình 3.17: Hệ sợi Cordyceps militaris HL34 36 Hình 3.18: Hệ sợi Cordyceps militaris HL35 36 Hình 3.19: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm chủng Cordyceps militaris .37 Hình 3.20: Sinh trưởng hệ sợi sau thời gian lưu trữ bảo quản 39 Hình 3.21: C.militaris HL2 sau 06 tháng cất giống 40 Hình 3.22: C.militaris CM sau 21 tháng cất giống 40 Hình 3.23: Sinh trưởng hệ sợi nấm mơi trường dinh dưỡng khác 42 Hình 3.24: Sinh trưởng hệ sợi nấm thang nhiệt độ khơng khí khác .44 Hình 3.25: Sinh trưởng nấm thang độ ẩm khơng khí khác .46 Hình 3.26: Sinh trưởng nấm pH mơi trường khác 47 Hình 3.27: Khả kháng khuẩn chủng nấm Cordyceps militaris 50 Hình 3.28: Khả kháng khuẩn chủng Cordyceps militaris 51 viii Hình 3.29: Khả kháng nấm F oxysporum nấm Cordyceps militaris 53 Hình 3.30: Khả kháng nấm F oxysporum nấm Cordyceps militaris 54 Hình 3.31: Chủng CM nuôi cấy môi trường dịch thể 56 Hình 3.32: Sinh khối hệ sợi nấm mơi trường dịch thể khác .57 Hình 3.33: Chủng Cordyceps militaris Việt Nam 57 Hình 3.34: Chủng Cordyceps militaris Sưu tầm 57 Hình 3.35: Sinh khối hệ sợi nấm tốc độ lắc khác 59 Hình 3.36: Thời gian lắc liên tục .61 Hình 3.37: Thời gian lắc cách nhật 61 Hình 3.38: Sinh khối khơ hệ sợi thời gian thu hoạch khác .62 Hình 3.39: Hệ sợi nấm trước thu hoạch 63 Hình 3.40: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác 64 Hình 3.41: Hệ sợi nấm C militaris sấy khô 65 Hình 3.42: Bột nấm C militaris 65 ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Đơng trùng hạ thảo (cịn gọi Đơng trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) loài nấm ký sinh sâu non nhộng sâu trưởng thành số loại côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành số lồi trùng nằm đất mặt đất bị nấm ký sinh Sợi nấm xâm nhiễm hút chất dinh dưỡng thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn nhiệt độ ẩm độ khơng khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao, nấm hình thành thể nhú lên khỏi mặt đất gốc dính liền vào thân sâu Người ta thường đào lấy xác sâu nấm để làm thuốc Vì mùa đông nấm ký sinh sâu, mùa hạ mọc thành nấm nên có tên đơng trùng hạ thảo (ĐTHT) Loài nấm Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link đối tượng nghiên cứu đề tài, nấm ký sinh giai đoạn nhộng côn trùng, mùa hạ mọc thành nấm số tác giả gọi Nhộng trùng thảo Nấm Cordyceps militaris loài nấm đánh giá cao giá trị dược liệu, nhờ có hợp chất cordycepin thành phần hố học thể nấm Đây hợp chất có khả ức chế hoạt động trình sinh tổng hợp tế bào ung thư Tác dụng kìm hãm tế bào ung thư vú, ung thư phổi, ung thư máu nhiều nhà khoa học như: Yoo H.S et al., 2004 [33]; Ahn Y.J et al., 2000 [16]; Kim G.Y đồng tác giả (2006) [22] nghiên cứu phát Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo dùng để điều trị chứng rối loạn nhịp lipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm thận mạn tính, cao huyết áp, ung thư phổi, thiểu sinh dục viêm gan B mạn tính Nấm Cordyceps militaris Nan J.X đồng tác giả (2001) chứng minh có hiệu chữa trị bệnh rối loạn chức gan Ngồi nấm cịn có tác dụng chống viêm kìm hãm oxy hố lipit lipoprotein Khơng lồi nấm Cordyceps militaris cịn phát có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1, có hàm lượng protein cao (40,69%), nhiều nguyên tố khoáng Zn, Se, Cu Như giá trị lồi nấm Cordyceps militaris vơ q giá Hiện loài nấm Cordyceps militaris phát nước Trung Quốc, Nhật Bản Hàn Quốc Việt Nam nước có nhiều nét tương đồng với khu hệ nấm Qua điều tra sơ Phòng nghiên cứu Bảo vệ thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam phát lồi nấm có mặt vùng núi cao Việt Nam Nấm Cordyceps militaris tự nhiên khó tìm, xuất theo mùa, mặt khác giá trị Đông trùng hạ thảo nhiều người biết đến tâm nhu cầu khai thác lồi lớn Vì vậy, việc nhân ni gây trồng nhân tạo thành cơng lồi nấm có ý nghĩa vơ to lớn việc bảo tồn phát triển loài Đây loài nấm không dễ phân lập nhân nuôi môi trường nhân tạo, nhân nuôi thành công đặc điểm sinh học chúng Nghiên cứu đặc điểm sinh học loài nấm Cordyceps militaris sở khoa học quan trọng xem yếu tố định đến thành bại việc nuôi trồng thể nấm nhân tạo Chính lý đề tài tiến hành “Nghiên cứư đặc điểm sinh học chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link thu thập sưu tầm từ Việt Nam, Trung Quốc Nhật Bản ” nhằm góp phần bảo tồn, nghiên cứu ứng dụng phát triển bền vững lồi Đơng trùng hạ thảo quý Thành công đề tài có ý nghĩa lớn nghiên cứu khoa học y học nước nhà, đặc biệt sở để tiếp tục nghiên cứu quy trình ni trồng nhân tạo loại nấm thần dược 60 Hình 3.35 mô rõ sinh trưởng hệ sợi chủng nấm cho trọng lương lượng khô cao công thức CT2, nghĩa điều kiện lắc 120 vòng/phút cho sinh khối hệ sợi nấm lớn Các chủng nấm HL22, HL34, HL35 có xuất xứ Việt Nam cho sinh khối thấp so với chủng cịn lại thí nghiệm thời gian nuôi cấy Lắc khâu quan trọng trình ni nấm mơi trường dịch thể ni tĩnh hồn tồn nấm có khả sinh trưởng bề mặt dịch thể, hệ sợi nấm có bề mặt phía đóng băng kín bề mặt khơng có dịch, dùng dịch để làm giống hút dịch đưa sang mơi trường nấm khó mọc khơng có sợi Việc lắc nhằm cắt đứt sợi nấm non trộn lẫn môi trường dịch thể thứ làm cho hệ sợi sinh trưởng khắp thể tích bình khơng bề mặt, thứ hai hút dịch thể đảm bảo lượng hệ sợi để mọc môi trường mới, thứ ba không tạo hội cho nấm mọc che kín bề mặt dịch thể Lý ta không lắc liên tục 24/24giờ, mà nên lắc cách nhật kinh nghiệm cho thấy sau cấy sợi nấm vào môi trường dịch thể nên để 5- ngày tuỳ theo chủng mọc nhanh hay chậm cho hệ sợi nấm bắt đầu mọc môi trường dịch thể sau tiến hành lắc cấy nấm sợi nấm chưa mọc môi trường mới, đem lắc làm sợi nấm ngập nước chìm hẳn vào dịch thể, nấm bị ướt mọc khó chậm Q trình lắc cần phải có thời gian để tĩnh cho sợi nấm bị cắt đứt mọc môi trường dịch thể Như nhân sinh khối nấm môi trường dịch thể để sinh khối hệ sợi nấm đạt hiệu cao nên lắc với tốc độ 120vòng/phút điều kiện 25 oC, với thời gian ngày lắc ngày để tĩnh Dưới hình ảnh minh hoạ thí nghiệm lắc liên tục (24/24 giờ) lắc cách nhật (lắc tốc độ 120vòng/phút với ngày để tĩnh ngày lắc) chủng nấm Cordyceps militaris Việt Nam (Hình 3.36, Hình 3.37) 61 Hình 3.36: Thời gian lắc liên tục Hình 3.37: Thời gian lắc cách nhật 3.4.3 Xác định thời gian thu hoạch Trọng lượng khô hệ sợi sau thu hoạch khoảng thời gian nuôi cấy môi trường dịch thể sau 12 ngày, 16 ngày, 20 ngày, 24 ngày 28 ngày trình bày Bảng 3.13 mơ qua Hình 3.38 Bảng 3.13: Sinh khối hệ sợi nấm sau khoảng thời gian nuôi khác Sinh khối hệ sợi (gram) Chủng /thời gian HL2 HL22 HL34 HL35 CM 12 ngày 0.453 0.178 0.226 0.209 16 ngày 0.638 0.291 0.397 20 ngày 1.065 0.417 24 ngày 1.132 28 ngày 1.144 F1010 F1012 F1080 0.685 0.595 0.480 0.480 0.391 0.887 0.812 0.598 0.708 0.453 0.611 1.091 1.005 0.880 0.988 0.517 0.553 0.781 1.142 1.039 0.918 1.062 0.523 0.577 0.802 1.153 1.064 0.938 1.086 Kết bảng cho thấy chủng nấm Cordyceps militaris sinh trưởng môi trường dịch thể PD với thời gian 28 ngày nuôi cấy Tuy nhiên thời gian đầu 12, 16 , 20 ngày tốc độ sinh trưởng nấm nhanh thể sinh khối hệ sợi nấm tăng nhanh chóng điều thấy rõ Hình 3.38 62 Trọng lượng khô hệ sợi (gram) 12ngày 16ngày 20ngày 24ngày 28ngày 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 HL2 HL22 HL34 HL35 CM F1010 F1012 F1080 Chủng nấm Hình 3.38: Sinh khối khô hệ sợi thời gian thu hoạch khác Ngồi Hình 3.38 cho ta thấy rõ sinh khối hệ sợi nấm chia làm loại rõ rệt loại sinh trưởng nhanh chủng HL2, CM, F1010, F1012, F1080 loại sinh trưởng chậm chủng HL22, HL34, HL35 Đối với chủng nấm sinh trưởng nhanh ngày đầu 16 – 20 ngày nấm tăng nhanh rõ rệt, sau 24 ngày sinh khối hệ sợi tăng tăng khơng đáng kể Hình 3.38 cho thấy sinh khối hệ sợi nấm sau 20 ngày, 24 ngày 28 ngày sinh khối hệ sợi chủng gần xấp xỉ Mặt khác hệ sợi nấm sau 20 ngày trắng khoẻ sau 24 ngày hệ sợi dần chuyển sang màu ngà vàng da cam dấu hiệu già hệ sợi nấm Những chủng nấm sinh trưởng chậm sau 20 ngày hệ sợi nấm tăng nhanh 24 ngày, từ 24 – 28 ngày sợi nấm sinh trưởng chững lại hệ sợi chuyển từ màu trắng sang màu ngà đến vàng da cam Như xác định thời gian thu hoạch hệ sợi nấm phù hợp cho chủng nấm sau: chủng mọc nhanh chủng HL2, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012, chủng F1080 thời gian thu hoạch hệ sợi nấm tốt 20 ngày kể từ ngày cấy nấm Chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 cịn lại mọc chậm thời gian thu hoạch tốt 24 ngày 63 Nghiên cứu xác định thời gian thu hoạch hệ sợi nấm vào thời gian phù hợp tốt cho suất cao điều quan trọng Vì sinh trưởng nấm nói riêng sinh vật nói chung có thời gian định Sợi nấm sinh trưởng đến chừng mực bị già yếu, sinh trưởng chậm, khả đề kháng để lâu làm thời gian mà suất hệ sợi không tăng, dẫn đến hiệu kinh tế thấp tăng thêm chi phí sản xuất Nếu lúc thu hoạch hệ sợi sử dụng hệ sợi làm giống sợi nấm khơng đạt u cầu cho sinh trưởng chậm, sợi nấm bị vàng dễ bị thoái hoá giống Thời điểm thu hoạch hệ sợi làm giống tốt lúc hệ sợi nấm cịn trắng, bơng khoẻ (Hình 39) Hình 3.39: Hệ sợi nấm trước thu hoạch 3.4.4 Thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy Hệ sợi nấm sau thu hoạch sấy khô nhiệt độ thấp 300C, 350C, 400C có quạt gió đến độ ẩm tương đối sản phẩm sấy đạt 10 – 12%, thời gian sấy khô hệ sợi nấm chủng trình bày Bảng 3.14 Bảng 3.14: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác Chủng /NĐ sấy 30oC 35 oC 40 oC Thời gian sấy khô hệ sợi (giờ) HL2 HL22 HL34 HL35 CM 96 56 50 72 48 40 72 48 40 72 48 40 96 60 52 F1010 96 56 48 F1012 80 48 40 F1080 96 56 48 64 Từ kết Bảng 3.14 cho thấy thời gian để sấy nấm thang nhiệt độ sấy khác khác rõ rệt Kết cho thấy nhiệt độ 30oC thời gian làm khô hệ sợi lâu nhiều (từ 72 -96 giờ) so với sấy nhiệt độ 35 (48 – 60 giờ) 40 oC (40 – 52 giờ) Ở thang nhiệt độ 400C sợi nấm khô nhanh so với nhiệt độ 350C khơng đáng kể, điều thấy rõ Hình 3.40 Trong chủng nấm thí nghiệm thời gian sấy kết cho thấy rõ thời gian sấy nhóm chủng nấm sinh trưởng nhanh chủng HL2, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012 chủng F1080 nhiều thời gian so với nhóm chủng sinh trưởng chậm chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 Điều lý giải hệ sợi nấm chủng sinh trưởng nhanh thường có hệ sợi dầy so với nhóm chủng sinh trưởng chậm 30 độ C 35 độ C 40 độ C Thời gian sấy (giờ) 120 100 80 60 40 20 HL2 HL22 HL34 HL35 CM F1010 F1012 F1080 Chủng nấm Hình 3.40: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác Sợi nấm sau thu hoạch rửa qua nước sấy khô điều kiện 300C thời gian 72 – 96 khơng đảm bảo chất lượng sợi nấm đơi có xuất hiện tượng nấm tạp xâm nhiễm Để đảm bảo an tồn cho nấm khơng nên sấy nhiệt độ cao, sợi nấm tươi mà đem sấy nhiệt độ cao khơng đảm bảo lượng nước bay hồn tồn thường dẫn đến hệ sợi nấm giịn dễ vỡ vụn Mặt khác đối 65 tượng sấy hệ sợi nấm, có chứa nhiều thành phần hố học q ví dụ vitamin, axit amin nhiều thành phần khác có cấu trúc cácbon… sấy nhiệt độ cao phá vỡ cấu trúc thành phần làm ảnh hưởng đến tính chất thành phần dễ dẫn đến làm hỏng tác dụng quý báu vốn có nấm Với kết thời gian sấy nấm hợp lý 35 oC - 40 oC tốt 35oC lý sau: thời gian sấy đảm bảo sợi nấm không bị nhiễm tạp, thời gian sấy không lâu nhiệt độ không cao đảm bảo độ an toàn chất lượng sợi nấm 4.4.5 Quy trình sản xuất bột nấm Cordyceps militaris Nguyên liệu: Giống nấm, môi trường dinh dưỡng PDA, mơi trường dịch PD Quy trình: Từ nguồn giống nấm lưu trữ bảo quản, cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng cho nấm sinh trưởng, sau 10 - 15 ngày cấy, sợi nấm mọc bông, trắng khoẻ, cấy truyền sang môi trường dịch PD hấp khử trùng, nuôi nhiệt độ 25oC với tốc độ lắc 120 vịng/phút Sau 20 – 24 ngày ni cấy sợi nấm bắt đầu chuyển từ màu trắng sang màu ngà, tiến hành thu hoạch Sợi nấm lọc qua rây, rửa qua hệ sợi nước sau tiến hành sấy hệ sợi nấm nhiệt độ 35oC thời gian 48 – 60 giờ, tuỳ chủng nấm mà thời gian sấy khác nhau, đến độ ẩm không khí đạt 10 -12% dừng sấy Tiến hành nghiền đóng gói kín, bảo quản điều kiện mát Sản phẩm thu hoạch mơ qua hình ảnh Hình 3.40 Hình 3.41 Hình 3.41: Hệ sợi C militaris khơ Hình 3.42: Bột C militaris 66 Quy trình sản xuất Bột nấm Cordyceps miltaris tóm tắt qua Sơ đồ sau: Giống lưu trữ bảo quản PDA, 25oC 10 -15ngày nuôi Cất giống Nước cất vô trùng Lưu trữ bảo quản giống Giống sản xuất Dịch PD, 25oC 120 vòng/phút Sản xuất hệ sợi (Nhân sinh khối) Thu hoạch Sấy 35oC 48 – 60 Sợi nấm khơ Nghiền Đóng gói Bột nấm Cordyceps militaris 67 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết thu thập mẫu nấm có nguồn gốc Việt Nam phân lập mẫu xác định nấm Cordyceps militaris sưu tầm chủng nấm Cordyceps militaris bao gồm chủng Trung Quốc chủng Nhật Bản Như tiến hành nghiên cứu chủng nấm Cordyceps militaris có kí hiệu sau: Chủng HL2, chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012 chủng F1080 - Có 4/8 chủng sinh trưởng nhanh môi trường dinh dưỡng nhân tạo bao gồm chủng HL2, chủng CM, chủng F1010 chủng F1080 với tốc độ 104,66; 122,02; 107,64; 105,08 µm/giờ, 4/8 chủng nấm sinh trưởng chậm môi trường nhân tạo có chủng thu thập Việt Nam chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 chủng sưu tầm Nhật Bản chủng F1012 với tốc độ sinh trưởng đạt 69,95; 71,92; 79,37 80,36µm/giờ Chủng CM cho sinh trưởng nhanh - Khả lưu trữ giống nấm Cordyceps militaris nước cất vô trùng, băng kín bảo quản tủ lạnh 4oC đảm bảo chất lượng nấm thời gian 17 tháng Điều kiện tối ưu cho chủng nấm Cordyceps militaris sinh trưởng điều kiện nuôi cấy khiết là: - Chủng HL2: Môi trường dinh dưỡng N10 (PDA + 10% Nhộng tằm), nhiệt độ từ 15 -25oC, độ ẩm khơng khí 85% pH = 5,0 - Chủng HL22, HL34: Môi trường PDA có bổ sung 10 - 20% Nhộng tằm Ở 20oC, độ ẩm 80 – 85% pH = 6,0 - Chủng HL35: Cả công thức môi trường N10; N20; PDA; P10; P20, nhiệt độ 20oC, độ ẩm 80 – 85% pH = 5,0 – 6,5 - Chủng CM: Mơi trường PDA có bổ sung 10% Nhộng tằm, nhiệt độ 20 – 25oC, độ ẩm 80 -85% pH = 4,5; 6,5 - Chủng F1010: Môi trường PDA N10, nhiệt độ 25oC, độ ẩm 85% pH = 6,5 68 - Chủng F1012: Môi trường N10, nhiệt độ 15 – 25oC, độ ẩm 85% pH = 5,0 – 5,5 - Chủng F1080: Môi trường dinh dưỡng P20; PDA; N10; N20, nhiệt độ 20 -25oC, độ ẩm 80 -85% pH = 6,5 Cả chủng nấm Cordyceps militaris có hoạt tính sinh học thông qua: - Khả kháng khuẩn Bacillus subtilis Trong chủng CM có khả kháng mạnh với đường kính vịng ức chế 22,50, chủng HL2, chủng F1012, chủng F1080 có đường kính vịng ức chế khoảng 17,33 -19,00 mm, chủng lại gồm chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35, chủng F1010 khả kháng thấp vòng ức chế từ 12,50 – 15,00 mm - Khả kháng nấm Fusarium oxysporum Kết cho thấy chủng nấm Cordyceps militaris có khả kháng tốt, mạnh chủng CM đường kính vịng ức chế 25,00 mm, chủng HL35, chủng HL2, chủng F1010, chủng F1012 có đường kính vòng ức chế 20,67 – 23,00 mm Các chủng HL22, chủng HL34, chủng F1080 khả kháng thấp với đường kính khoảng 17,33 – 18,33 mm Điều kiện tối ưu để nhân sinh khối hệ sợi nấm là: - Môi trường dinh dưỡng dịch thể tối ưu để nhân nuôi sinh khối hệ sợi nấm môi trường PD (20g Glucoza/lít + 200g khoai tây/lít) Chủng CM có xuất mầm thể điều kiện ni cấy 25oC môi trường dịch thể PD - Tốc độ lắc tối ưu cho sinh trưởng chủng nấm Cordyceps militaris môi trường dịch thể 120 vòng/phút điều kiện 25oC với thời gian lắc ngày để tĩnh ngày - Thời gian thu hoạch nấm tốt chủng HL2, chủng CM, chủng F1010, chủng F1012, chủng F1080 20 ngày kể từ ngày cấy nấm Chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 mọc chậm thời gian thu hoạch tốt 24 ngày - Sấy khô sản phẩm hệ sợi nấm tốt nhiệt độ từ 35 – 40oC, tốt 35oC thời gian 48 – 60 - Quy trình sản xuất bột nấm: Giống nấm cấy truyền môi trường PDA, sau 10 -15 ngày tuổi tiếp tục cấy vào môi trường dịch PD, nuôi 25oC với tốc độ 69 lắc 120 vòng/phút Sau 20 -24 ngày thu hoạch hệ sợi, sấy nhiêt độ 35oC thời gian 48 – 60 đến độ ẩm 10 -12% dừng sấy, nghiền đóng gói, sản phẩm cuối bột nấm Cordyceps militaris Tồn kiến nghị Do thời gian thực đề tài bị hạn chế đề tài dừng lại kết thử nghiệm thời gian lưu trữ bảo quản giống nấm 17 tháng Do hạn chế thời gian nghiên cứu nên kết thử nghiệm hoạt tính sinh học kháng nấm kháng khuẩn chủng Cordyceps militris thực loài khuẩn Bacillus subtilis loài nấm Fusarium oxysporum mà chưa thử nghiệm với loài khuẩn, nấm gây bệnh cho người Kết nghiên cứu có ý nghĩa lớn cho nghiên cứu tiếp theo, đặc biệt sở khoa học để ứng dụng cho giai đoạn nhân nuôi trồng thể nhân tạo Đối tượng nghiên cứu loài nấm dược liệu quý, có ý nghĩa y dược cao, nên tiếp tục sâu nghiên cứu đáp ứng mục đích cuối tạo sản phẩm thể nấm ni trồng nhân tạo có giá trị cao ứng dụng cho ngành y học 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Doãn Diên, Phạm Thị Thùy, Nguyễn Giáng Vân, Trần Thanh Tháp, Đồng Thanh, Nguyễn Thị Bắc (1994), Kết nghiên cứu phân lập sản xuất nấm Beauveria bassiana bước đầu tìm hiểu biện pháp sử dụng nấm để phòng trừ mọt hại kho nơng sản, Hội nghị khoa học tồn quốc Cơng nghệ sinh học Hóa sinh phục vụ sản xuất ĐS, HN Đỗ Tất Lợi (1977), Những thuốc vị thuốc Việt Nam (In lần thứ 3, có sửa chữa bổ sung), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Văn Mão (2002), Sử dụng côn trùng vi sinh vật có ích Tập II Sử dụng vi sinh vật có ích, Trường Đại học Lâm nghiệp, Nhà xuất Nông nghiệp Trịnh Tam Kiệt (1996), Danh mục loài nấm lớn Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Trịnh Tam Kiệt, Đặng Vũ Thanh, Hà Minh Trung (2001), Lớp ASCOMYCETES, Danh lục loài thực vật Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Pham Quang Thu (2009), “Điều tra phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat Phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 4, trang 91-94 Phạm Quang Thu (2009), “Phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps gunnii (Berk) Berk Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 4, trang 96-99 71 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân (2009), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh trưởng hệ sợi ni cấy khiết số lồi nấm ký sinh trùng”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 11, trang 97 – 102 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2009), “Phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.) Link Tại vườn Quốc gia Hoàng Liên Tỉnh Lào Cai”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 9, trang 103 - 113 10 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2010), Phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa Việt Nam” Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn, Bộ Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, số 6, trang 127 – 130 11 Phạm Thị Thùy, Đồng Thanh, Nguyễn Thị Bắc, Trần Thanh Tháp (1994), Kết nghiên cứu sản xuất nấm trùng Beauveria Metarhizium để phịng trừ số sâu hại trồng, Hội nghị khoa học tồn quốc Cơng nghệ sinh học Hóa sinh phục vụ sản xuất đời sống, Hà Nội 12 http://www.khampha24h.com 13 http://www.vast.ac.vn/index.phpoption 14 http://www.vietsiences.free.fr http://vietsiences.net 15 http://www.yhoccotruyen.hmtedsoft.com/baocheduoc/htmdocs/dongtrunghathao.htm Tiếng Anh 16 Ahn Y.J., Park S.J., Lee S.G., Shin S.C., Choi D.H (2000), “Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp.”, J Agric Food Chem., 48, 2744-2748 72 17 Ajay Kumar, Pragati Saini J N Shrivastava (2009), “Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian Journal of Experimental Biology, 47, pp 57 -62 18 Duck-Hyun Cho, Yun-Man Cho, Jong-Il Lee (2000), Fruitbody Formation of Cordyceps militaris in Allomyrina dichotoma Linnaeus Annual Report of Department of biology, Division of Life and Technology, Woosuk University, Cheonju 565-800, Korea 19 Gi-Ho Sung, Nigel L Hywel-Jones, Jae-Mo Sung, J Jennifer Luangsa-ard, Bhushan Shrestha and Joseph W Spatafora (2007) “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi”, Studies in Mycology 57, 5–59 20 Jae-Sung Kim, Kumar Sapkota, Se-Eun Park, Bong-Suk Choi, Seung Kim, Nguyen Thi Hiep, Chun-Sung Kim, Han-Seok Choi, Myung-Kon Kim, Hong-Sung Chun, Yeal Park, and Sung-Jun Kim (2006), “A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris”, The Journal of Microbiology, Vol 44, No.6 Dec 2006, p 622-631 21 Jiang-Feng Song, Chun-Quan Liu, Da-Jing Li and Bang-Quan Jin (2007) “Optimization of cordycepin extraction from cultured Cordyceps militaris by HPLC-DAD coupled with uniform design”, J Chem Technol Biotechnol 82, 1122–1126 22 Kim G.Y., Ko W.S., Lee J.Y., Lee J.O., Ryu C.H., Choi B.T., Park Y.M., Jeong Y.K., Lee K.J., Choi K.S., Heo M.S., Choi Y.H (2006), “Water extract of Cordyceps militaris enhances maturation of murine bone marrow- derived dendritic cells in vitro”, Biol Pharm Bull 29, 354-360 23 Klaunig JE, Kamendulis LM (2004), “The role of oxidative stress in carcinogenesis”, Annu Rev Pharmacol 44, 239-267 73 24 Lee H, Kim Y.J., Kim H.W., Lee D.H., Sung M.K., Park T (2006), “Induction of apoptosis by Cordyceps militaris through activation of caspase-3 in leukemia HL-60 cells”, Biol Pharm Bull 29, 670-674 25 Li Cui, Ming Sheng Dong, Xiao Hong Chen, Mei Jiang, Xin Lv, Guijun Yan (20080, “A novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris, a Chinese traditional medicinal mushroom”, World J Microbiol Biotechno 24, 483– 489 26 Mao X.L (2000), The macrofungi in China, Henam Technical and Science Publication House 27 Mina Masuda, Eriko Urabe, Akihiko Sakurai, Mikio Sakakibara (2005), “Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris”, Enzyme Microbial Technol 39 (2006), 641–646 28 Nan J.X., Park E.J., Yang B.K., Song C.H., Ko G., Sohn D.H (2001), “Antifibrotic effect of extracellular biopolymer from submerged mycelial cultures of Cordyceps militaris on liver fibrosis induced by bile duct ligation and scission in rats”, Arch Pharm Res 24, 327-332 29 Patcharaporn Wongsa, Kanoksri Tasanatai, Patricia Watts and Nigel HywelJones (2005), Isolation and in vitro cultivation of the insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis, Annual Report of National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Thailand 30 Russell R., Paterson M (2008), “Cordyceps – A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory”, Phytochemistry 69 (2008), 1469–1495 31 Sung Jae Mo (2000), Insect-born fungus of Korea, Kangwon National Univ., Korea 74 32 Tsuguo Hongo Masana Izawa (1994), Mushroom in Japan, Yama-Kei publisher, Japan 33 Yoo H.S., Shin J.W., Cho J.H., Son C.G., Lee Y.W., Park S.Y., Cho C.K (2004), “Effect of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth”, Acta Pharmacol Sin 25, 657-65 34 Wang Youwei (2007), Project of Idustrialization Development of Cordyceps militaris, Lioaninh Baoli Industrial Co., Ltd 35.Won S.Y and Park E.H (2005), “Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris” J Ethnopharmacol 96, 555- 561 36 Xian-Bing Mao and Jian-Jiang Zhong (2004), “Hyperproduction of Cordycepin by Two-Stage Dissolved Oxygen Control in Submerged Cultivation of Medicinal Mushroom Cordyceps militaris in Bioreactors Biotechnol” Prog 2004, 20, 1408-1413 37 http://www.jstage.jst.go.jp/article/aez/37/1/37_85/_article/-char/en 38 http://www.mushroomexpert.com/cordyceps_militaris.html 39 http://www.mushroomexpert.com/references.html 40 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15870944 41 http://www.khoahoc.net 42 http://www.Suckhoevadoisong.htm 43 http://www.vnexpres.net/vietnam/suc-khoe/2004/04/3b9d1d39) 44 http://www.ykhoa.net 45 http://www.herbal-power.com/cordyceps.htm ... nguồn gen chủng nấm Cordyceps militaris - Sưu tập chủng nấm từ Trung Quốc Nhật Bản - Phân lập chủng nấm từ mẫu Cordyceps militaris thu thập Việt Nam - Tốc độ sinh trưởng chủng nấm Cordyceps militaris. .. trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L. : Fr. ) Link thu thập sưu tầm từ Việt Nam, Trung Quốc Nhật Bản ” nhằm góp phần bảo tồn, nghiên cứu ứng dụng phát triển bền vững lồi Đơng trùng hạ thảo q Thành... Nhật Bản từ trang trại nuôi trồng nấm Trung Quốc Các chủng nấm sưu tập có ký hiệu sau: Chủng Cordyceps militaris CM (chủng CM), Chủng Cordyceps militaris F1010 (chủng F101 0), Chủng Cordyceps militaris