Phương pháp phân tích vi sinh trong thực phẩm

ReportPHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THỰC PHẨMI.XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ1.Giới thiệuVi sinh vật hiếu khí là vi vinh sinh vật cần oxy để phát triển, trong điều kiện không có oxy, chúng sẽ chết hoặc không hoạt động. Tổng vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu thực phẩm dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản và tốc dộ hư hỏng của thực phẩm.Tổng vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm được xác định bằng phương pháp nuôi cấy trên trên thạch hoặc trên petrifilm. Số lượng colonies đếm được trên đĩa và trên petrifilm thể hiện tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trên mẫu. Kết quả số vi sinh vật phát triển trong mẫu chính xác khi số lượng colonies đếm được trên tất cả các đĩa lớn hơn 15 và nhở hơn 300. Nếu tổng số colonies đếm được trong tất cả các đĩa quá lớn thì phải tiến hành pha loãng mẫu. Tuy nhiên, đối với một số trường hợp số colonies trên tất cả các đĩa nằm trong giới hạn nào đó thì sẽ có những cách tính số vi sinh vật trên mẫu phù hợp. 2.Môi trường và thiết bị sử dụng2.1Môi trườngBuffered peptone water (BPW)Plate count agar (PCA)Petrifilm2.2Dụng cụ thiết bịDao; kéo; túi nilon (nhựa) không thấm nước; ống nghiệm;erlen 250ml; ống đong 500ml, 100ml; chai thủy tinh có nắp 500ml, 250 ml; micropipette 1ml, 5ml; đĩa cấy; đèn cồn;Bể ổn nhiệt (water bath), cân, máy lắc votex, máy ủ, máy hấp, oven. 3.Quy trình thử nghiệm3.1Chuẩn bị môi trường Tất cả các dụng cụ cần phải khử trùng trước khi sử dụngBuffered peptone water (BPW): Thành phầnm (gram)Casein enzymic hydrolysate10Sodium chloride5Disodium phosphate3.5Monopotassium Phosphate1.5Nước cất1000mlCân 20 gram các thành phần đổ vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan hết. Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Điều chỉnh pH = 7.0 ±0.2. Sau đó hấp ở 1210C trong 15 phút. Để nguội xuống 450C 550C rồi sử dụng.Plate count agar (PCA): Thành phầnm (gram)Casein enzymic hydrolysate5Yeast extract 2.5Dextrose1Agar15Nước cất1000mlCân 23.5 gram các thành phần được liệt kê trên bảng đổ vào 1L nước cất và khuấy đều. Điều chỉnh pH = 7.0 ±0.2. Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Hấp để khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội xuống 450C 550C rồi sử dụng.Đổ agar vào đĩa cấy với độ dày từ 34mm (khoảng 1520ml agar).3.2Quy trình cấy mẫuBước 1: Cân 25 gram mẫu vào túi nilon (nhựa) không thấm nước.Cách lấy mẫu: Đối với thịt nguyên khối, cắt nhỏ (cạo) phần vỏ xung quanh khối thịt (phần tiếp xúc với không khí); đối với thịt xay nhuyễn lấy bất kì; đối với dung dịch nước hút phần dịch nước)Bước 2: Đồng nhất mẫu: Đong 225ml PBW vào 25 gr mẫu pha loãng mẫu ở 101Bước 3: Pha loãng mẫu thành 102 103 104 Cách pha loãng mẫu: Chuẩn bị 3 ống nghiệm, đong 9 ml PBW đổ vào mỗi ống nghiệm. Lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 101 đổ vào ống nghiệm thứ nhất ta được độ pha loãng 102 dùng máy lắc, lắc đều. Sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 102 cho vào ống nghiệm thứ 2 ta được độ pha loãng 103dùng máy lắc, lắc đều. Tiếp theo, lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 103 cho vào ống nghiệm thứ 3 ta được độ pha loãng 104 dùng máy lắc, lắc đều. 3.2.1Cấy mẫu trên petrifilmBước 1: Chuẩn bị petrifilm. Chuẩn bị 6 petrifilm (mỗi độ pha loãng cần làm ít nhất 2 lần). Label tên mẫu,độ pha loãng, ngày cấy lên petrifilm.Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 102 103 104 lên petrifilmBước 3: Ủ ở 35oC trong 48h ± 2hBước 4.Đếm số colonies trên film.Hình ảnh minh họa vi sinh vật hiếu khí trên petriflim.3.2.2Cấy mẫu trên đĩa cấyBước 1: Chuẩn bị đĩa cấy. Chuẩn bị 6 đĩa cấy, label tên mẫu, độ pha loãng, ngày cấy lên đĩa)Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 102 103 104 lên đĩaBước 3: Đổ 1520ml agar ở 450C550C vào đĩa đã có 1ml mẫu, sau đó lắc nhẹCách đổ: Đổ một lượng nhỏ agar (510ml) vào đĩa có chứa mẫu, sau đó lắc đều. Lắc nhẹ theo chiều kim đồng hồ và ngược lại, lắc ngang sau đó lắc dọc để mẫu hòa tan đều vào agar, tránh trường hợp nơi có mẫu thì mọc quá nhiều, nơi không có mẫu thì không có vsv phát triển, dẫn đến đếm sô colonies bị sai. Lưu ý, khi lắc tránh trường hợp agar bị dính lên thành, lên nắp hoặc văng ra ngoài.Sau đó đổ thêm mottj lượng nhỏ agar vào đĩa.Bước 4. Ủ ở 35oC trong 48h ± 2hBước 5: Đếm số colonies trên đĩa.Hình ảnh minh họa vi sinh vật hiếu khí trên điã cấyDựa vào số colonies đếm được trên đĩa cấy hoặc trên film, ta có công thức tính CFUg or mlCông thức:Trong đó: là tổng colonies đếm được từ hai đĩa, trong hai đĩa đó số colonies phải lớn hơn 15 colonies và nhỏ hơn 300 colonies là thể tích được sử dụng để cho vào mỗi đĩa (ml) số đĩa ở độ pha loãng thư nhất số đĩa ở độ pha loãng thứ 2d hệ số pha loãng ở độ pha loãng thứ nhấtVD1:Đĩa 1Đĩa 2102 270295103150207104108104 loại vì số colonies 300, 104 loại vì số colonies