TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ====== PHẠM THỊ HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC CIMETIDIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học ThS PHẠM THỊ KIM DUNG HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng trân trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn cô giáo ThS Phạm Thị Kim Dung, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Sinh KTNN thầy cô Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học Chuyển giao công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ hoàn thành luận văn Do bước đầu vào thực tế sáng tạo nghiên cứu khoa học, kiến thức hạn chế nhiều bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi thiếu sót điều chắn, mong nhận góp ý quý báu quý thầy cô bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 17 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Phạm Thị Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học ThS Phạm Thị Kim Dung Những số liệu kết khóa luận trung thực, trùng lặp chép đề tài khác Trong đề tài này, có trích dẫn số liệu số tác giả Tôi xin phép tác giả trích dẫn để bổ sung cho khóa luận Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, Ngày 17 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Phạm Thị Hà DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A.xylinum Acetobacter xylinum cs cộng CVK Cellulose vi khuẩn ĐH Đại học ĐHSP Đại học Sư phạm FDA Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ Nxb Nhà xuất OD Mật độ quang phổ MỤC LỤC Conten\ MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quan đối tượng lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn 1.1.1.1 Đặc điểm Acetobacter xylinum 1.1.1.2 Đặc điểm màng Cellulose vi khuẩn 1.1.1.3 Đặc điểm môi trường chuẩn 1.1.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả tạo màng Cellulose từ vi khuẩn A.xylinum 1.1.2.1 Độ pH 1.1.2.2 Nhiệt độ 1.1.2.3 Độ thông khí 1.1.2.4 Thời gian nuôi cấy 1.1.2.5 Ảnh hưởng bề mặt thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V) 1.1.3 Thuốc Cimetidine 1.1.3.1 Công thức 1.1.3.2 Tác dụng Cimetidine 1.1.3.3 Đặc điểm dược động học 1.1.3.4 Đặc điểm dược lực học 10 1.1.3.5 Tương tác thuốc 10 1.1.3.6 Tác dụng phụ 11 1.2 Tình hình nghiên cứu nước 11 1.2.1 Màng Cellulose vi khuẩn 12 1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu giới 12 1.2.2 Thuốc Cimetidine 13 1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 13 1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu giới 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Giống vi khuẩn 15 2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất 15 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 15 2.1.3.1 Thiết bị .15 2.1.3.2 Dụng cụ 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường chuẩn 15 2.2.2 Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước hấp thụ thuốc xác định lượng màng Cellulose vi khuẩn tạo thành độ dày màng 16 2.2.3 Phương pháp kiểm tra giá độ tinh khiết màng Cellulose vi khuẩn 17 2.2.4 Phương pháp xây dựng đường chuẩn Cimetidine HCl 0,1N 18 2.2.5 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng Cellulose vi khuẩn 19 2.2.6 Phương pháp xử lý thống kê 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .22 3.1 Kết tạo màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn 22 3.2 Quá trính xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước hấp thụ thuốc 22 3.3 Đo bề dày màng Cellulose vi khuẩn 23 3.4 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết màng Cellulose vi khuẩn 24 3.5 Khối lượng hấp thụ thuốc vào màng Cellulose vi khuẩn 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 4.1 Tài liệu tiếng Việt 32 4.2 Tài liệu tiếng Anh 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Công thức môi trường chuẩn 14 Bảng 2.2 Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng 16 Bảng 2.3 Giá trị mật độ quang (OD) dung dịch Cimetidine nồng độ (mg/ml) khác (n = 3) 17 Bảng 3.1 Giá trị đo độ dày màng Cellulose vi khuẩn 23 Bảng 3.2 Giá trị OD (y) trung bình thuốc Cimetidine sau hấp thụ thuốc khoảng thời gian khác 30 phút; giờ; 1,5 giờ; (n = 3) 26 Bảng 3.3 Khối lượng tỉ lệ thuốc Cimetidine hấp thụ vào màng Cellulose vi khuẩn sau 2h (n = 3)……………… 27 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận Cellulose vi khuẩn 16 Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn Cimetidine .19 Hình 3.1 Hình ảnh màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn 22 Hình 3.2 Các quy trình xử lý màng Cellulose vi khuẩn 23 Hình 3.3 Đo độ dày màng Cellulose vi khuẩn sau tinh 24 Hình 3.4 Kết thử diện đường glucose 25 Hình 3.5 chuẩn bị màng Cellulose vi khuẩn để hấp thụ thuốc .25 Hình 3.6 chuẩn bị hấp thu thuốc Cimetidine độ dày màng Cellulose vi khuẩn khác 26 Hình 3.7 Lắc màng Cellulose vi khuẩn dung dịch thuốc Cimetidine 20% rút dịch định kì đo OD 26 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ thao tác hai màng có độ dày 0,3cm 0,5cm .29 Hình 3.9 Biểu đồ so sánh thao tác với màng Cellulose vi khuẩn 0,3cm 29 Hình 3.10 Biểu đồ so sánh thao tác với màng Cellulose vi khuẩn 0,5cm 29 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Cùng với phát triển công nghiệp hóa, đại hóa người bị sống đại trở nên bận rộn với công việc nên nhiều thời gian nấu nướng nhiều loại thức ăn nhanh, đồ ăn đóng hộp đời thêm việc ăn uống không thời gian, không theo quy luật số nguyên nhân khác căng thẳng, stress, hay thức khuya không ngủ đủ giấc dẫn tới chứng đau dày, lâu dần dẫn tới viêm loét dày chí ung thư dày ngày xuất nhiều Với phát triển ngành y học, có nhiều loại thuốc nhằm chữa trị, hạn chế việc đau, viêm loét dày có thuốc Cimetidine Cimetidine chất đối kháng có cạnh tranh thuận nghịch với Histamine thụ thể H2 tế bào thành dày Cimetidine làm ức chế tiết dịch acid (khi đói) ngày đêm dày tiết dịch acid kích thích thức ăn, histamin, pentagastrin, cafein insulin Lượng pepsin dày sản xuất giảm theo… Thuốc có tác dụng điều trị ngắn hạn loét dày tiến triển lành tính, trì loét tá tràng với liều thấp sau ổ loét lành, ngăn chặn chứng trào ngược dày thực quản gây loét, trạng thái bệnh lý tăng tiết dịch vị hội chứng Zollinger - Ellison, bệnh đa u tuyến nội tiết, chảy máu tiêu hóa loét dày tá tràng phòng chảy máu đường tiêu hóa người có bệnh nặng [2] Cimetidine có tác dụng hiệu cao nhiên lại tương tác với nhiều thuốc metformin, warfarin, qunidin, procaznamimd, lidocain, propanolol, nifedipin, phenytoin, acid valproic, pheophylin… làm ảnh hưởng hấp thu, cạnh tranh với đào thải ống thận, thay đổi lượng máu qua gan số tác dụng phụ như: ỉa chảy, mệt mỏi đau đầu, phát ban, dị ứng kể sốc phản vệ… [2] Hiện nay, màng cellulose vi khuẩn (CVK) đối tượng nhiều nghiên cứu ứng dụng nhà khoa học nước nước Đây loại nguyên liệu mới, ứng dụng nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, mỹ phẩm Theo kết nghiên cứu cho thấy màng Cellulose vi khuẩn tạo nên từ nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, sản xuất quy mô công nghiệp Về mặt tính chất Cellulose vi khuẩn có độ tinh lớn nhiều so với loại cellulose khác, phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngoài ra, CVK có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định kích thước hướng Cellulose vi khuẩn mạng polymer sinh học có khả giữ nước lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, chịu thể tích đáng kể bề mặt (lực bền học cao), đường kính sợi nhỏ Đồng thời hàng rào cản oxi sinh vật khác, ngăn cản phân hủy chất tế bào ngăn cản tác động UV, ổn định kích thước hướng, màng Cellulose vi khuẩn có ý nghĩa giữ thuốc giải phóng thuốc kéo dài giúp tăng hiệu chữa bệnh [14], [18] Màng Cellulose vi khuẩn lên men từ nhiều môi trường khác như: nước vo gạo, nước dừa già… Tuy nhiên môi trường sử dụng nhiều coi môi trường tối ưu lên men màng Cellulose vi khuẩn môi trường chuẩn Hestrin - Schramm (HS) (2wt% glucose, 0,5wt% nấm men chiết xuất, 0,5wt% peptone, 0,27wt% disodium phosphate 0,15wt% acid citric) [26] Để khắc phục yếu điểm Cimetidine em nghĩ đến việc kết hợp với màng Cellulose vi khuẩn để hạn chế đào thải thuốc, giúp cho lượng thuốc ngấm vào thể nhiều làm tăng hiệu chữa trị nên em định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Cimetidine màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn” Mục đích nghiên cứu trường lên men sản phẩm trình trao đổi chất, acid acetic Vì vậy, trước hấp thu thuốc cần phải xử lý màng để thu màng Cellulose vi khuẩn tinh chế Quy trình xử lý màng Cellulose vi khuẩn thể qua hình 3.4 (1) (2) (3) (5) (4) (6) Hình 3.2 Các quy trình xử lý màng Cellulose vi khuẩn (1) CVK thô (4) CVK ngâm HCl 3% (48h) (2) CVK ngâm NaOH 3% (48h) (5) CVK ngâm nước cất hai lần (48h) (3) Rửa CVK với nước (6) CVK tinh chế 3.3 Đo bề dày màng Cellulose vi khuẩn Màng Cellulose vi khuẩn đo thước điểm khác 23 d1, d2, d3, d4 bề dày màng tính trung bình với kích thước dtb Màng khảo sát thể tích môi trường nuôi cấy 150ml Hình 3.3 Đo độ dày màng Cellulose vi khuẩn sau tinh Bảng 3.1 Giá trị đo độ dày màng Cellulose vi khuẩn Mẫu d1 (cm) d2 (cm) d3 (cm) d4 (cm) dtb (cm) 0,28 0,27 0,26 0,30 0,28 ± 0,0017 0,30 0,31 0,30 0,29 0,30 ± 0,0082 0,47 0,51 0,50 0,48 0.49 ± 0,0183 0,51 0,49 0,52 0,47 0,50 ± 0,0222 3.4 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết màng Cellulose vi khuẩn Mục đích: Kiểm tra diện đường glucose nồng độ cao môi trường nuôi cấy Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling pha để phát diện đường D- glucose, có đường xuất kết tủa màu nâu đỏ Tiến hành: - Mẫu thử: dịch màng Cellulose vi khuẩn sau xử lý hóa học - Mẫu chứng: Là H2O cất dung dịch D-glucose 24 - Cho vào ống nghiệm chứa mẫu thử, ống nghiệm 1ml thuốc Fehling Đun cách thủy 10 phút - Quan sát kết tủa ống nghiệm - Kết quả: không phát thấy xuất Glucose mẫu thử thể hình 3.6 Hình 3.4 Kết thử diện đường glucose Mẫu thử 1: màng 0,5cm Mẫu thử 2: màng 0,3cm 3.5 Khối lượng hấp thụ thuốc vào màng Cellulose vi khuẩn Màng Cellulose vi khuẩn sau tinh chế cắt thành hình vuông cạnh 2,5cm Tiếp theo, màng sấy loại nước 50% khối lượng sấy khô tới khối lượng không đổi (a) (b) Hình 3.5 chuẩn bị màng Cellulose vi khuẩn để hấp thụ thuốc a Cắt mẫu hình vuông có cạnh 2,5cm b Sấy mẫu đến khối lượng không đổi 25 Sau đó, cho màng Cellulose vi khuẩn chuẩn bị vào 100ml dung dịch Cimetidine 20% (a) (b) Hình 3.6 chuẩn bị hấp thu thuốc Cimetidine độ dày màng Cellulose vi khuẩn khác a Pha thuốc Cimetidine 20% b Màng Cellulose vi khuẩn dung dịch Cimetidine 20% Sử dụng máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút nhiệt độ phòng, sau 30 phút, giờ, 1,5 giờ, lấy dịch đo quang phổ (a) (b) Hình 3.7 Lắc màng Cellulose vi khuẩn dung dịch thuốc Cimetidine 20% rút dịch định kì đo OD a Lắc màng Cellulose vi khuẩn dung dịch thuốc Cimetidine 20% b Định kì rút dịch bình lắc sau khoảng thời gian 0,5h, 1h, 1,5h, 2h Lặp lại thí nghiệm lần, xác định giá trị OD (y) trung bình 26 thuốc Cimetidine bảng 3.2 Bảng 3.2 Giá trị OD (y) trung bình thuốc Cimetidine sau hấp thụ thuốc khoảng thời gian khác 30 phút; giờ; 1,5 giờ; (n = 3) Độ dày màng Giá trị OD (y) dung dịch 30 phút 1,5 giờ 0,337 ± 0,302 ± 0,288 ± 0,276 ± 0,0123 0,008 0,0167 0,0065 Sấy loại nước 50% 0,301 ± 0,278 ± 0,266 ± 0,251 ± khối lượng 0,0055 0,011 0,0031 0,0092 Sấy màng tới khối 0,281 ± 0,244 ± 0,227 ± 0,211 ± lượng không đổi 0,0113 0,0141 0,0065 0,0019 Không sấy 0,437 ± 0,398 ± 0,335 ± 0,304 ± 0,025 0,0218 0,008 0,014 Sấy loại nước 50% 0,396 ± 0,334 ± 0,311 ± 0,274 ± khối lượng 0,0019 0,1014 0,0331 0,0045 Sấy màng tới khối 0,371 ± 0,318 ± 0,286 ± 0,237 ± lượng không đổi 0,0023 0,0111 0,0078 0,0086 Thao tác 0.3cm 0,5cm Không sấy Qua bảng 3.2 thấy: Khi màng Cellulose vi khuẩn hấp thụ thuốc, giá trị OD (y) trung bình dung dịch thuốc giảm dần sau không đổi độ dày màng Có thể sau khoảng thời gian 0,5 giờ; giờ; 1,5 lượng thuốc Cimetidine hấp thụ vào màng Cimetidine tăng dần đạt cực đại Sau giá trị OD dung dịch tăng lên, chứng tỏ lượng thuốc màng giảm đi, màng bắt đầu giải phóng thuốc Theo công thức (2.2) công thức (2.3) ta tính khối lượng tỉ lệ (%) thuốc Cimetidine hấp thụ vào màng Cellulose vi khuẩn bảng 3.3 27 Bảng 3.3 Khối lượng tỉ lệ thuốc Cimetidine hấp thụ vào màng Cellulose vi khuẩn sau 2h (n = 3) Độ dày màng mtr (mg) Thao tác (Cimetidine 20%) Không sấy 20 Sấy loại 0,3cm nước 50% 20 khối lượng Sấy tới khối lượng 20 không đổi Không sấy 20 Sấy loại 0,5cm nước 50% 20 khối lượng Sấy tới khối lượng không đổi 20 Thể tích msau mht (mg) (mg) màng (cm3) 10,3 ± 9,7± 0,025 0,025 9,31 ± 10,69 ± 0,015 0,015 7,74 ± 12,26 ± 0,019 0,019 11,41 ± 8,59 ± 0,017 0,017 10,23 ± 9,77 ± 0,033 0,033 8,76 ± 11,24 ± 0,036 0,036 28 1,875 1,875 1,875 3,125 3,125 3,125 Cường độ hấp thụ EE (%) (mg/cm3) 5,701 ± 48,5 ± 0,004 0,5852 5,701 ± 53,5 ± 0,0026 0,2673 6,539 ± 61,3 ± 0,0031 0,5343 2,749 ± 42,3 ± 0,0027 0,3451 3,126 ± 48,9 ± 0,0052 0,672 3,597 ± 56,2 ± 0,0057 0,678 Qua bảng 3.3 ta có biểu đồ: 70 61.3 60 56.2 53.5 48.9 48.5 50 42.3 40 màng 0.3cm 30 Màng 0,5cm 20 10 Không sấy Sấy loại nước 50% Sấy tới khối lượng khối lượng không đổi Hình 3.8 Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ thao tác hai màng có độ dày 0,3cm 0,5cm 70 60 50 53.5 48.5 56.2 60 61.3 50 Không sấy 48.9 42.3 Không sấy 40 40 Sấy loại nước 50% khối lượng 30 20 20 Sấy tới khối lượng không đổi 10 Sấy loại nước 50% khối lượng 30 Sấy tới khối lượng không đổi 10 0 Màng CV 0,3cm Màng CV 0,5cm Hình 3.9 Biểu đồ so sánh thao Hình 3.10 Biểu đồ so sánh thao tác với màng Cellulose vi khuẩn 0,3cm tác với màng Cellulose vi khuẩn 0,5cm 29 Qua biểu đồ, thấy sau hiệu suất hấp thụ màng Cellulose vi khuẩn ba thao tác không sấy, sấy loại nước 50% khối lượng sấy màng tới khối lượng không đổi màng 0,3cm hấp thụ thuốc tốt màng 0,5cm, điều giải thích màng 0,3cm mỏng hơn, sợi cellulose hơn, liên kết lỏng lẻo nên thuốc dễ dàng hấp thụ vào màng Cellulose vi khuẩn So sánh giá trị cường độ hấp thụ thuốc việc sử dụng hàm t Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, kết có khác biệt khả hấp thụ độ dày màng P = 0,011 (T