TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN - NGUYỄN NGUYỆT QUỲNH NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HOÀNG THẢO Ý NGỌC (Dendrobium transparens Wall ex Lindl.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT LAN PHI ĐIỆP TỪ HẠT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngƣời hƣớng Chuyên ngành: Sinh lý học thựcdẫn vậtkhoa học TS LA VIỆT HỒNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS LA VIỆT HỒNG Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, động viên giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận đƣợc giúp đỡ tận tình cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, anh Đào Văn Kiên- Học viên Cao học K18 giúp đỡ, đóng góp ý kiến để hoàn thành đề tài khóa luận, nhân xin gửi lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phƣơng tiện để hoàn thành khóa luận Cảm ơn gia đình bạn bè động viên, góp ý cho trình học tập hoàn thành đề tài Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Nguyệt Quỳnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc công bố Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Nguyệt Quỳnh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: α- Napthlacetic acid KIN: Kinetin IBA: Indol 3- butyric acid IAA: - Indole- acetic acid BAP: 6- Benzyl amino purin MS: Murashige Skoog Nxb: Nhà xuất Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu 4.Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG Chƣơng1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chi Dendrobium 1.1.1.Vài nét chi Dendrobium 1.1.2 Vài nét lan Hoàng thảo ý ngọc 1.2 Đặc điểm sinh học lan 1.2.1 Hạt lan 1.2.2 Sự nảy mầm cộng sinh với nấm tự nhiên hạt lan 1.2.3 Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro hạt lan 1.3 Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium Việt Nam 12 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 14 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 14 2.3.1 Thiết bị 14 2.3.2 Dụng cụ 14 2.4 Môi trƣờng nuôi cấy 14 2.5 Điều kiện nuôi cấy 15 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.6.1 Nhân nhanh protocorm phát triển chồi từ protocorm 15 2.6.2 Nhân nhanh chồi in vitro: 16 2.6.3 Ra rễ-tạo in vitro hoàn chỉnh: 16 2.6.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: 16 2.7 Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm 16 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nhân nhanh protocorm tạo chồi từ protocorm 18 3.1.1 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh protocorm 18 3.1.2 Ảnh hưởng nước dừa đến khả tạo chồi từ protocorm 19 3.2 Nhân nhanh chồi in vitro 21 3.2.1 Ảnh hưởng KIN lên khả nhân chồi 21 3.2.2 Ảnh hưởng BAP lên khả nhân chồi 22 3.2.3 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả nhân chồi 25 3.3 Tạo rễ - hình thành in vitro hoàn chỉnh 26 3.3.1 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ 26 3.3.2 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ 27 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hƣởng kinetin đến khả nhân nhanh protocorm loài D transparens 18 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nƣớc dừa đến khả tạo chồi từ protocorm D transparens 19 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng KIN lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy 21 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng BAP lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy 22 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy 24 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 26 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 27 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Protocorm phát sinh từ protocorm D transparens 18 Hình 3.2 Chồi phát sinh từ protocorm D transparens môi trƣờng MS +10% ND 20 Hình 3.3 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trƣờng MS + 0,5 mg/l KIN 22 Hình 3.4 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trƣờng MS 23 Hình 3.5 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trƣờng MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA 25 Hình 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 26 Hình 3.7 Ảnh hƣởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 28 Hình 3.8 D transparens in vitro rèn luyện tự nhiên 29 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Họ Phong lan họ lớn thực vật có hoa với 800 chi 25.000 loài Hoa lan đƣợc đánh giá cao vẻ đẹp lôi cuốn, quyến rũ đa dạng kích thƣớc, hình dạng, màu sắc Hiện nay, hoa lan chiếm 8% ngành thƣơng mại hoa giới có tiềm thay đổi tình hình kinh tế quốc gia [26] Chi Dendrobium thuộc họ Phong lan chi thực vật phổ biến giới, chi có khoảng 1200-1500 loài phân bố rộng khắp Châu Á, Bắc Australia New Zealand Các loài thuộc chi sinh trƣởng nhanh, dễ dàng tái sinh hệ mới, hoa đẹp, hoa quanh năm [16] Ngoài giá trị thƣơng mại, số loài lan thuộc chi Dendrobium thành phần thuốc truyền thống Trung Quốc Ấn Độ [44]… Trong tự nhiên, loài lan sinh trƣởng chậm, tái sinh chủ yếu hạt Tuy nhiên, khả nảy mầm tự nhiên hạt lan thấp Do đó, khả phục hồi quần thể lan rừng tự nhiên khó [1], [2] Bằng phƣơng pháp nhân giống vô tính truyền thống nhƣ giâm cành, chiết cành, ghép cành, ngƣời ta thu đƣợc nhiều giống trồng cho suất phẩm chất tốt Tuy nhiên, phƣơng pháp nhiều hạn chế nhƣ hệ số nhân thấp, tốn nhiều thời gian Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đời mang lại lợi ích lớn cho nhiều nƣớc giới Bên cạnh việc khắc phục nhƣợc điểm biện pháp nhân giống vô tính truyền thống, thể ƣu điểm vƣợt trội nhƣ tạo lƣợng lớn giống bệnh, đồng mặt di truyền thời gian ngắn; tạo sinh khối tế bào lớn làm nguyên liệu cho công nghiệp y dƣợc Do khắc phục hạn chế phƣơng pháp nhân giống truyền thống [3] Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.) loài lan có hoa đẹp, lâu tàn, trồng vƣờn nhà nên đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng Tuy nhiên, việc trồng loài lan gặp nhiều khó khăn nguồn giống Để chủ động nguồn giống phục vụ cho phát triển sản xuất phục vụ nhu cầu nội tiêu nhƣ xuất nhiệm vụ nhân giống lan phƣơng pháp nuôi cấy mô hƣớng đắn Nhân giống Hoàng thảo ý ngọc phƣơng pháp nuôi cấy mô cung cấp lƣợng lớn giống chất lƣợng cao, đồng đều, bệnh, khắc phục đƣợc tƣợng thoái hoá đặc biệt lƣu giữ nguồn gen quý cho nhu cầu nuôi trồng Xuất phát từ thực tế tiến hành thực đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.) kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật” để chọn môi trƣờng nhân nhanh phù hợp tạo số lƣợng lớn, đồng bệnh thời gian ngắn, làm tiền đề cho việc cung cấp giống có chất lƣợng tốt phục vụ cho sản xuất, góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen quý Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.) nhằm tạo sở cung cấp giống cho trình sản xuất Phạm vi nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu phạm vi phòng thí nghiệm 4.Ý nghĩa khoa học thực tiễn Ý nghĩa khoa học: góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu invitro lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.) Ý nghĩa thực tiễn: kết đề tài đƣợc sử dụng nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.) Góp phần sản xuất giống có hiệu cao, chất lƣợng tốt, ứng dụng vào sản xuất góp phần nâng cao hiệu nghiên cứu khai thác, bảo Hình 3.5 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trƣờng MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA 3.3 Tạo rễ - hình thành in vitro hoàn chỉnh Tạo rễ giai đoạn cuối trình nhân nhanh in vitro Với mục đích tạo có sức sống cao, đạt tiêu chuẩn Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật auxin đƣợc sử dụng để kích thích phân chia tế bào phân hoá rễ Những auxin đƣợc dùng rộng rãi nuôi cấy mô tế bào thực vật NAA IAA Để tăng khả rễ cho chồi giống lan nghiên cứu tiến hành lấy chồi D transparens thu đƣợc từ thí nghiệm tách riêng lẻ cấy lên môi trƣờng MS bổ sung NAA (0,3; 0,5; 0,7 mg/l ) IAA (0,3; 0,5; 0,7 mg/l) để khảo sát khả tạo rễ in vitro 3.3.1 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Kết ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ D transparens đƣợc trình bày bảng 3.6 cho thấy, môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l NAA môi trƣờng thích hợp cho trình hình thành rễ D transparens với trung bình 5,20 rễ/chồi (Hình 3.6c); chiều dài rễ đạt giá trị lớn 1,23 cm nồng độ 0,3 mg/l (Hình 3.6b) Ở chồi rễ phát triển gần nhƣ hoàn chỉnh giống với rễ lan tự nhiên, rễ có kích thƣớc lớn, màu xanh Khi 26 tăng nồng độ lên 0,7 mg/l NAA nhận thấy trình phát triển rễ bị ức chế dẫn đến hình thành rễ hơn, rễ có kích thƣớc nhỏ ngắn Bảng 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy NAA (mg/l) Tỷ lệ tạo rễ(%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) ĐC 29,63 1,00 ± 0b 0,2 ± 0,03a 0,3 41,67 2,00 ± 0,7a 1,23 ± 0,05b 0,5 77,50 5,20 ±0,83c 0,83 ± 0,05c 0,7 31,11 2,40 ± 0,89a 0,47 ± 0,05d Các chữ khác cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 Hình 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy (a) ĐC: môi trường nuôi cấy không bổ sung chất kích thích sinh trưởng, (b,c,d) Môi trường MS bổ sung (0,3;0,5;0,7) mg/l NAA 3.3.2 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ Kết ảnh hƣởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens đƣợc trình bày bảng 3.10, cho thấy môi trƣờng bổ sung 0,3 mg/l IAA môi trƣờng thích hợp cho trình hình thành rễ D transparens với trung bình 4,80 rễ/chồi; với nồng độ 0,3 mg/l IAA chiều dài rễ đạt giá trị lớn 2,07 cm (Hình 3.7b) Khi tăng nồng độ lên 0,7 27 mg/l IAA trình phát triển rễ bị ức chế dẫn đến hình thành rễ hơn, rễ có kích thƣớc nhỏ ngắn (Hình 3.7d) Nhƣ ta thấy IAA 0,3 mg/l môi trƣờng thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro D transparens Parthibhan (2015) nghiên cứu Dendrobium aqueum cho môi trƣờng 1/2MS+IBA mg/l môi trƣờng thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro với số rễ/chồi cao đạt 8,75 chiều dài rễ in vitro tốt môi trƣờng 1/2MS+NAA mg/l [44] Sở dĩ có khác có lẽ đối tƣợng nghiên cứu khác Bảng 3.7 Ảnh hƣởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy Chiều dài rễ IAA (mg/l) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ/chồi ( cm) ĐC 29,63 1,00 ± b 0,2 ± 0a 0,3 80,77 4,80 ± 0,83 c 2,07 ± 0,06b 0,5 62,96 3,00 ± 1,87a 1,53 ± 0,06c 0,7 65,22 2,60 ± 0,54a 1,07 ± 0,06d Các chữ khác cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 28 Hình 3.7 Ảnh hƣởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy (a) ĐC: môi trường nuôi cấy không bổ sung chất kích thích sinh trưởng, (b,c,d) Môi trường MS bổ sung (0,3;0,5;0,7) mg/l IAA 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Do lan dễ bị chết úng nƣớc hay độ ẩm cao, lí gây bệnh thối rữa Trong phòng nuôi cấy, lan đƣợc phát triển điều kiện tối ƣu, nhiệt độ nơi nuôi trồng tƣơng đối ổn định (25-27oC) Khi chuyển in vitro tự nhiên, môi trƣờng ẩm nóng tự nhiên thuận lợi cho vi khuẩn gây bệnh Do đó, bình nuôi cấy thu đƣợc từ thí nghiệm tạo rễ chứa lan D transparens tái sinh hoàn chỉnh (cao 4-5 cm, có 3-4 rễ) đƣợc chuyển từ phòng nuôi cấy phòng thí nghiệm với ánh sáng đầy đủ, điều kiện nhiệt độ phòng tuần nhằm huấn luyện để thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Sau tiến hành chuyển khỏi bình nuôi cấy, rửa môi trƣờng, cắt ngắn rễ dài dập nát Ngâm vào dung dịch thuốc diệt nấm VIDOC 30 BTN loãng với nồng độ 1% phút Cây 29 đƣợc trồng giá thể xơ dừa miếng cắt nhỏ 1:1:1:1 Theo dõi sinh trƣởng phát triển lan D transparens tuần sau in vitro Kết sau tuần bắt đầu hình thành rễ mới, tạo thêm chồi mới, tỉ lệ sống cao, đạt xấp xỉ 85% (Hình 3.8) Hình 3.8 D transparens in vitro rèn luyện tự nhiên (a,b) D transparens tuần tuổi, (c,d) D transparens tuần tuổi 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Quy trình nhân giống in vitro lan Dendrobium transparens Wall ex Lindl đƣợc xây dựng : Môi trƣờng MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,3-0,5 mg/l Kinetin thích hợp cho trình nhân nhanh protocorm Môi trƣờng MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 10% nƣớc dừa (ND) thích hợp để tạo chồi in vitro từ protocorm Môi trƣờng MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro với hệ số nhân cao 6,33 sau tuần nuôi cấy Môi trƣờng MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,3 mg/l IAA môi trƣờng tạo rễ tốt (số rễ/chồi 4,80; chiều dài rễ: 2,07cm) sau tuần Cây rèn luyện giá thể xơ dừa cho tỷ lệ sống sót cao đạt 85% Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu rèn luyện lan D transparens giai đoạn sau in vitro loại giá thể khác để tìm loại giá thể tối ƣu, cho tỷ lệ sống sót cao 31 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu tiếng Việt Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ Tp HCM Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Hữu Cƣờng, Nguyễn Văn Giang (2010), “ Ảnh hƣởng giá thể trồng đến trình sinh trƣởng lan Hoàng Thảo trúc đen (Dendrobium hancockii rolfe)”, Tạp chí khoa học phát triển, tập 9, số 6, trang 903-911 Nguyễn Hoàng Lộc, Mai Văn Phô (2000), “Điều tra sơ thành phần loài họ lan Thừa Thiên Huế bƣớc đầu bảo tồn in vitro số loài phân bố đây”, Tạp chí sinh học, tập 22, số 3, trang 173-178 Vũ Quốc Luận, Dƣơng Tuấn Nhựt (2007), “Bƣớc đầu nghiên cứu khả tạo chồi hoa Dendrobium Mild Yumitrong nuôi cấy in vitro”, Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, Nxb Nông nghiệp Tp.HCM Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Công Nghiệp (2000), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ Tp.HCM Ngô Thị Nguyệt, Hoàng Thị Thế, Tô Phƣơng Thảo, Đinh Thu Huế, Đặng Thị Chinh, Nguyễn Thị Thu Trang, Trần Thùy Dung, Trần Thị Hà (2013), Thu thập lƣu trữ nguồn gen ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển số loài lan quý Quảng Ninh, Chƣơng trình Nghiên cứu Khoa học phát triển Công nghệ năm tỉnh Quảng Ninh, Trung tâm khoa học sản xuất Lâm Nông nghiệp Quảng Ninh Nguyễn Văn Song, Phan Hùng Vĩnh, Trƣơng Thị Bích Phƣợng (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)- loài lan rừng có nguy tuyệt chủng”, Tạp chí khoa học Đại học Huế, Số 64, 33 trang 127-136 10 Nguyễn Bảo Toàn (2004), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nxb Đại học Cần Thơ 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Xuân Trƣờng, Đỗ Văn Vịnh (2003), “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống nuôi trồng phong lan Phalaenopsis”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 12 Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Thị Hoài (2004), “Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào nhân nhanh in vitro số giống địa lan có giá trị”, Tạp chí KHKT Nông nghiệp, số 2, trang 340-343 13 Hà Thị Thúy (2011), “Quy trình nuôi cấy tế bào lớp mỏng tái sinh giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) địa”, Báo cáo Đề tài khoa học công nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp 14 Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân (1998), Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan, Nxb Nông nghiệp Tp.HCM 15 Dƣơng Thị Thảo Trang, Trƣơng Thị Bích Phƣợng, Huỳnh Văn Kiệt (2006), “Nghiên cứu nhân giống in vitro bời lời (Litsea rubescens)” Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, số15, trang 56-58 *Tài liệu tiếng Anh 16 Adams P (2011), “Systematics of Dendrobiinae (Orchidaceae) with special reference to Australian taxa”, Botanical Journal of the LinneanSociety, 166: 105–126 17 Asghar S, Ahmad T, Hafi I.A and Yaseen M (2011), “In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var Emma White” African Journal of Biotechnology, 10: 3097 – 3103 18 Babu K.N, Sajina A, Minoo D, John C.Z, Mini P.M, Tushar K.V, Rema J, Ravindran P.N (2003), “Micropropagation of camphor tree (Cinnamomum 34 camphora)”, Plant Cell Tiss Org Cult, 74: 179-183 19 Bhatia P., Bhatia N.P., Ashwath N (2002), “In vitro propagation of Stackhousia tryonii Bailey (Stackhousiaceae): A rare and serpentineendemic species of central Queensland, Autralia”, Biodiversity and Conservation 11:1469-1477 20 Benson E.F., Danaher J.E., Pimbley I.M., Anderson C.T., Wake J.E., Daley S, Adams L.K (2000), “In vitro micropropagation of Primula scotica: A rare Scottish plant”, Biodiversity and Conservation, 9: 711726 21 Chen Q.X., Ji Z.H (1998), “Encyclopedia of China orchid Beijing, China”, China Forestry Publishing House 22 Chen J T and Chang W C (2001), “Effect of auxins and cytokinins on direct somatic embryogenesis on leaf explant of Oncidium”, Plant GrowthReg, 34: 229-232 23 Chen J T and Chang, W C (2000), “Efficient plant regeneration through somaticembry genesis from callus cultures of Oncidium (Orchidaceae)”, Plant Sci, 160: 87-93 24 Chen JT and Chang WC (2002), “Effect of tissue culture conditions and explant characteristics on direct somatic embryogenesis in Oncidium Gower Ramsey”, Plant Cell Tiss Org Cult, 69: 41-44 25 Chou L.C., Chang D.C.N (2004), “Asymbiotic and symbiotic seed germination of Anoectochilus formosanus and Haemaria discolor and their F1 hybrids”, Botanical Bulletin of Academia Sinica, 45: 143-147 26 Chugh S, Guha S, Rao I U (2009), “Micropropagation of orchids: A review on the potential of different explants”, Sci Hortic, 122: 507–520 27 Dai ChuanYun, Liu TengFei, Guan TianBing, Liu WanHong (2011), “Optimization of medium formula for the proliferation of Dendrobium 35 candidum Wall ex Lindl Protocorm”, Medicinal Plant, 1: 1-2 28 Dearnaley JDW (2007), “Further advances in orchid mycorrhizal research”, Mycorrhiza, 17: 475-486 29 Gaspar T, Kevers C, Penel C, Greppin H, Reid D.M, Thrope T.A (1996), “Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture in vitro”, Cell Dev Biol Plant, 32:272-289 30 Geogre E.F., Hall M.A., Klerk G.J (2008), “Plant Propagation by TissueCulture”, The Background Springer 31 Goh C J and Loh, C S (1975), “Furtherobservations on meristem culture of Aranda Deborah”, Malayan Orchid Rev, 12: 10-13 32 Goh C J (1970), “Tissue culture of Vanda Miss Joaquim”, I Natl Acad Sci, 2: 31-33 33 Goh C.J (1973), “Meristem culture of Aranda Deborah”, Malayan Orchid Rev, 11: 10-15 34 He SL; DeZheng K, Qiu YS and QiXiang Z (2003), “Effect of carbon sources and organic compounds on the multiplication of Oncidiumaloha var, Iwanaga protocorm-like body”, Lournal of Henan Agricultural University, 37: 154-157 35 José Geraldo ZV, Keiko UL, Kaoro JY, Takashi GN, Tadeu F (2009), “Propagation and aclimatization of Cattleya Lindl (Orchidaceae) using banana pulp and coconut water”, Científica Jaboticabal, 37(1): 48-52 36 Kull T., Arditi J., Wong S.K (2009), Orchid Biology: Reviews and Perspectives X Springer 37 Loh Goh C J and Rao A N (1978), “Some factors affecting morphogenesis of Aranda orchid tissue culture, Proc Symp Orchidology”, Orchid Soc South East Asia, 4: 43 - 55 38 Luan V.Q., Thien N.Q., Khiem D.V., Nhut D.T (2006), “In vitro germination capacity and plant recovery of some native and rare orchids”, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agricultur, 7: 36 175-177 39 Maridass M, Mahesh R, Raju G, Benniamin A, Muthuchelian K (2010), “In vitro Propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture”, International Journal of Biological Technology, 1: 50-54 40 McKendrick S (2000) “In vitro germination of orchids: amanual”, Ceiba Foundation for Tropical Conservation, 8: 1-17 41 Molnar Z., Virag E and Ordog V (2011), “Natural substances in tissue culture media of higher plants, Acta Biologica Szegediensis”, 55 : 123127 42 Morel G (1964), “A new means ofclonal propagation of orchids”, Am Orchid Soc Bull, 33: 473-478 43 Morel G (1960), “Producing virus-free Cymbidiums, Am”, Orchid Soc Bull, 29: 495-497 44 Parthibhan S, Rao MV, Kumar TS (2015), “In vitro regeneration from protocorms in Dendrobium aqueum Lindley-An imperiled orchid”, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 13: 227–233 45 Park S.Y., Murth H.N, Paek K.Y (2003), “Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tip cultures of Doritaenopsis”, Plant Science, 164: 919-23 46 Ranjan C (2008), “Efffects of different factors on immature embryo culture, PLBs differentiation and rapid mass multiplication of Coelogyne suaveolens”, Indian Journal Exp Biol, 46: 243-248 47 Rayle D.L, Ross C.W, Robinson N (1982), “Estimation of osmotic parameters accompanying zeatin-induced growth of detached cucumber cotyledons”, Plant Physiol, 70: 1634-1636 48 Rezend JC, Ferreira EA, Pasqual M, Santos FC (2009), “Growth regulators and saccarose on the development of Cattleya loddigesiis” 37 Revista Agrarian, 2: 99-114 49 Sagawa Y and Kunisaki JT (1982), “Clonal propagation of orchid by tissue culture”, Plant tissue culture, 8: 683-684 50 Saiprasad G.V.S, Raughuveer P., Khetarpal S., Chandra R (2004), “Effect of various polyamines on production of protocorm-like bodies in orchid Dendrobium „Sonia‟”, Scientia Horticulturae, 100: 161-168 51 Scully R (1967), “Aspects of meristem culture in the Cattleya alliance, Amer”, Orchid Soc Bull, 36: 103-108 52 Sudha C.G., Krishnan P.N., Pushpahgadan P (1998), In vitro propagation of Holostemma annulare (Roxb.) K Schum, a rare medicinal plant, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 34: 57-63 53 Tuhuteru S, Hehanussa ML (2012), “Pertumbuhan dan Perkembangan Anggrek Dendrobium Anosmum Pada Media Kultur Dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa”, Jurnal Ilmu Budidaya Tanaman, Agrologia, 1: 1-12 54 Yam T.W, Arditti J.(2009), “History of orchid propagation: a mirrior of the history of biotechnology, plant Biotechnol Rep”, Korean Society forPlant Biotechnology and Springer, Published online 2009 38 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY ... cầu nuôi trồng Xuất phát từ thực tế tiến hành thực đề tài: X y dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl. ) kĩ thuật nuôi c y mô thực vật để chọn môi trƣờng nhân. .. invitro lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl. ) Ý nghĩa thực tiễn: kết đề tài đƣợc sử dụng nghiên cứu nuôi c y mô tế bào lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl. ) Góp phần... cấp giống có chất lƣợng tốt phục vụ cho sản xuất, góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen quý Mục đích nghiên cứu X y dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl. )