ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Tiến Đạt PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4 Ở LÚA (Oryza sativa) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN * * Nguyễn Tiến Đạt PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4 Ở LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: TS Đỗ Thị Phúc Hà Nội, 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, người hướng dẫn, quan tâm tận tình bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Cảm ơn cô, người truyền cảm hứng niềm tin cho tơi thí nghiệm, cơng việc Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô công tác Bộ môn Di truyền học quan tâm tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Các thầy bảo cho tơi cẩn thận, kiên trì nghiêm túc nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn tới CN Trần Xuân An, CN Phạm Quỳnh Hoa, CN Ngô Thị Hạnh giúp đỡ tơi thí nghiệm Các em ln quan tâm truyền đạt cho kinh nghiệm quý báu thực nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Protein Enzyme; Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ nhiều trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, người tận tình giúp đỡ, bảo tạo điều kiện tốt để học tập Cảm ơn người động viên, khuyến khích tơi q trình học tập thí nghiệm Hà Nội, tháng 11 năm 2016 Nguyễn Tiến Đạt MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Lúa (Oryza sativa) 1.2 Giới thiệu họ protein vận chuyển ion xuyên màng HKT thực vật lúa 1.2.1 Họ protein HKT thực vật 1.2.2 Họ protein HKT lúa 1.2.3 Gen OsHKT2;4 1.2.4 Tình hình nghiên cứu gen OsHKT2;4 10 1.3 Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa hình nucleotide 11 1.3.1 Phƣơng pháp RFLP-PCR 11 1.3.2 Phƣơng pháp giải trình tự 14 1.4 Phƣơng pháp phân tích mức độ biểu gen 16 1.4.1 Lai Northern blot lai huỳnh quang chỗ 16 1.4.2 RT-PCR Real-time PCR 17 1.4.3 Các phƣơng pháp sử dụng chip 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu, hóa chất thiết bị 20 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.1.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Các phƣơng pháp sử dụng nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 22 2.2.2 Các phƣơng pháp sử dụng phân tích biểu gen 26 CHƢƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 Phân tích đa hình gen Oshkt2;4 lúa 30 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 30 3.1.2 Khuếch đại gen OsHKT2;4 PCR 31 3.1.3 Giải trình tự gen OsHKT2;4 32 3.1.4 Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 33 3.2 Phân tích biểu gen 43 3.2.1 Kết trồng lúa thủy canh xử lý mặn 43 3.2.2 Kết tách chiết RNA tổng hợp cDNA 43 3.2.3 Phản ứng Real-time PCR phân tích mức độ biểu gen OsHKT2;4 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phụ lục DANH MụC BảNG Bảng 1.1 Các protein họ HKT đƣợc biết Bảng 1.2 Họ gen HKT lúa (Oryza sativa) Bảng 2.1 Các giống lúa nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu đƣợc sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Hai nhóm giống lúa phân chia theo đa hình nucleotide 33 Bảng 3.2 Vị trí đa hình nucleotide nhóm 35 Bảng 3.3 Các đa hình amino acid tƣơng ứng với đa hình nucleotide 36 Bảng 3.7 Giá trị Fold change mẫu tách chiết từ giống Nipponbare Pokkali thời điểm 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây lúa (Oryza sativa) phận lúa .3 Hình 1.2 Một số chế vận chuyển Na+ hệ thống đáp ứng stress mặn thực vật Hình 1.3 Gen OsHKT2;4 sở liệu Phytozome 10 Hình 1.4 Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng nghiên cứu di truyền phân tử 13 Hình 1.5 Kỹ thuật giải trình tự phƣơng pháp Sanger cải biến 14 Hình 1.6 Các bƣớc phƣơng pháp Northern blot 17 Hình 1.7 Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR 18 Hình 1.8 Sử dụng chip Microarray phân tích biểu 19 Hình 2.1 Các bƣớc thí nghiệm nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 23 Hình2.2 Các bƣớc thực thí nghiệm phân tích biểu gen OsHKT2;4 26 Hình 2.3 Trồng lúa thủy canh xử lý mặn .27 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu 14 giống lúa 31 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen OsHKT2;4 .31 Hình 3.3 Kết giải trình tự đƣợc phân tích phần mềm Bioedit 32 Hình 3.4 Một phần kết so sánh trình tự cơng cụ MultAlin 34 Hình 3.5 Mơ hình dự đốn cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4 37 Hình 3.6 Phân bố góc quay amino acid mơ hình cấu trúc 3D qua phân tích Ramachandran Plot 38 Hình 3.7 Cấu trúc phân tử amino acid đa hình vị trí 53 253 39 Hình 3.8 Cấu trúc phân tử amino acid đa hình vị trí 342 40 Hình 3.9 Mơ hình dự đốn cấu trúc xuyên màng .41 Hình 3.10 Filter pore protein OsHKT2;4 hai nhóm giống lúa 42 Hình 3.11 Kết điện di kiểm tra RNA tổng số 44 Hình 3.12 Biểu đồ Association curve thể nhiệt độ gắn mồi .45 Hình 3.13 Biểu đồ Amplification curve mẫu gen OsHKT2;4 46 Hình 3.14 Đồ thị biểu mức độ thay đổi nồng độ mRNA mẫu xử lý mặn so với mẫu đối chứng giống Nipponbare (A) giống Pokkali (B) 48 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT HKT High-affinity Potassium Transporter DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic acid cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid bp Basepair PCR Polymerase Chain Reaction RFLP-PCR Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate (Deoxynucleotide) ddNTP Dideoxynucleotide Fw Forward Rv Reverse Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt MỞ ĐẦU Tình hình biến đổi khí hậu giới diễn ngày phức tạp Việt Nam nƣớc chịu tác động tiêu cực nặng nề biến đổi khí hậu Với đƣờng bờ biển dài 3.260 km, với hệ thống sơng ngịi chằng chịt đổ biển qua nhiều cửa sơng, tình hình xâm nhập mặn, hệ biến đổi khí hậu ảnh hƣởng mạnh đến tình hình sản xuất nông nghiệp nƣớc ta Ở đồng sông Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất liền qua sông đến 70 km, dự báo đến tiếp tục tăng Hạn hán đất nhiễm mặn ảnh hƣởng đến 30 tỉnh thành nƣớc ta Đất nhiễm mặn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sinh trƣởng phát triển trồng, gây cân ion tích lũy Na+ Cl-, tăng cƣờng peroxide lipid, tăng sản phẩm dạng phản ứng oxy nhƣ gốc superoxide hydroxyl Để cải thiện suất điều kiện stress mặn thực vật nói chung lúa nói riêng, việc hiểu đƣợc chế phân tử đáp ứng stress mặn quan trọng Khả chịu mặn tính trạng đƣợc kiểm sốt nhiều gen Việc tìm hiểu mối liên hệ gen quan tâm khả đáp ứng với stress mặn có vai trị quan trọng lai tạo giống chịu mặn Có nhiều kênh vận chuyển màng tế bào thực vật giữ vai trò chế chống chịu mặn Trong số kênh vận chuyển Na+ K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium transporter) có vai trị quan trọng đáp ứng với stress mặn OsHKT2;4 thuộc nhóm họ protein HKT, OsHKT2;4 đƣợc biết đến với vai trò đồng vận chuyển Na+ K+.Tuy nhiên, nghiên cứu phân tử genmã hóa cho protein OsHKT2;4 giống lúa Việt Nam cịn hạn chế Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: “Phân tích đa hình di truyền mức độ biểu genOsHKT2;4 lúa QH.2014.T.CH - 60420121 ... TỰ NHIÊN * * Nguyễn Tiến Đạt PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4 Ở LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ... đề tài: ? ?Phân tích đa hình di truyền mức độ biểu genOsHKT2;4 lúa QH.2014.T.CH - 60420121 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt (Oryza sativa)? ?? với mục tiêu :Phân tích đa hình genOsHKT2;4 nghiên... dụng nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 22 2.2.2 Các phƣơng pháp sử dụng phân tích biểu gen 26 CHƢƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 Phân tích đa hình gen Oshkt2;4 lúa 30 3.1.1