TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC NĂM 2016 Biểu xylan 1,4-beta-xylosidase có nguồn gốc từ vi sinh ruột mối Escherichia coli Sinh viên: Phạm Hải Như Giáo viên hướng dẫn: TS Đỗ Thị Huyền TS Đinh Nho Thái SV Phạm Hải Như - K57 CNSH NỘI DUNG I/ TỔNG QUAN Tầm quan trọng xylan 1,4-β-xylosidase II/ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chọn chủng biểu E coli Rosetta, BL21, JM109 SoluBL21; tối ưu điều kiện IPTG, nhiệt độ, thời gian thu mẫu III/ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biểu thành công xylan 1,4-β-xylosidase dạng tan, có hoạt tính Điều kiện tối ưu cho thí nghiệm: IPTG o 0,6mM; 16 C; ngày IV/ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU Tối ưu thêm điều kiện biểu để đat lượng protein tan lớn TỔNG QUAN Lignocellulose nguồn nguyên liệu tái tạo có nhiều ứng dụng phổ biến đặc biệt nước nông nghiệp SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Việt Nam VIỆC SỬ DỤNG HỮU HIỆU SINH KHỐI THỰC VẬT PHỤ THUỘC VÀO Sinh khối thực vật cấu tạo từ Monome nhiều loại polyme Để giải toán này, nhiều phương pháp phân giải vật lý, hóa học đề Song, giá thành phương pháp cao, quy trình phức tạp, yêu cầu hóa chất gây ô nhiêm môi trường SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Trong tình hình đó, công nghệ enzyme tái tổ hợp trở thành hướng phát triển ổn định tiềm cho việc phân giải sinh khối thực vật Thực tế thúc đẩy phòng Kỹ thuật di truyền – Viện công nghệ sinh học nghiên cứu gen thủy phân sinh khối thực vật có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi Khóa luận tốt nghiệp “Biểu gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase chủng Escherichia coli” phần nhỏ nghiên cứu Dùng plasmid tái tổ hợp pET22xbx thiết kế từ giai đoạn trước nghiên cứu, xylan 1,4-β-xylosidase tiến hành biểu chủng Escherichia coli * xbx: gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Xylan 1,4-β-xylosidase enzyme chìa khóa tham gia thủy phân lignocellulose Có khả cắt (1,4)-β-D-xylan từ đầu không khử để giải phóng gốc đường D-xylose SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Giảm nhớt ủ bia, rượu Sản xuất xylitol Sản xuất xăng sinh học Xylan 1,4-βxylosidase … Chuyển hóa bột giấy ứng dụng nhiều ngành SV Phạm Hải Như - K57 CNSH VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Dựa xylan1,4-β-xylosidase nghiên cứu đặc tính liệu CAZy Mẫu dò (probe) ORF GL0112518 (từ 12 ORF chọn được) + “Blast” với kho liệu metagenome từ ruột mối Đưa vào enzyme XhoI + NcoI iệ uh ể i B n n ạp Biến E Coli BL21 (DE3) Tốc độ sinh trưởng mạnh đặc trưng cho dòng B Có đột biến DE3 (thêm gen mã hóa T7 polymerase) giúp tăng khả biểu trình tự gen ngoại lai vector chứa T7 promoter pET22b(+); đột biến protease lon ompT giúpbảo vệ protein ngoại lai E Coli JM109 (DE3) Thuộc dòng K, có tốc độ sinh trưởng chậm dòng B; giúp protein có đủ thời gian hoàn thiện cải biến sau dịch mã E Coli Rosetta (DE3) Biến thể từ E coli BL21, giữ ưu điểm BL21 tối ưu hóa codon Có E Coli SoluBL21 (DE3) thêm vector pRARE chứa tRNA mang argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT, tyrU, thrU Biến thể từ E coli BL21, cải thiện trình gấp xoắn protein Protein tái tổ hợp thu thí nghiệm thử hoạt tính với chất p-nitropheny-β-xylopyranoside (pNPX) Xylan-1,4-β-xylosidase Xylan-1,4-β-xylosidase Màu vàng đặc trưng nitropheny Sử dụng chủng biểu chọn để khảo sát điều kiện biểu IPTG, nhiệt độ thời gian thu mẫu SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Khảo sát nhiệt độ cảm ứng Nhiệt độ thích hợp o 20 C o Mà sinh khối thu 20 C lớn sinh khối o 16 C SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG IPTG chất cảm ứng cho hoạt động gen xbx điều khiển promoter T7 vector pET22xbx Đây chất cảm ứng đắt tiền ảnh hướng lớn đến mức độ biểu gen xbx Băng protein xbx (≈40kDa) dòng có cảm ứng IPTG khác so với dòng đối chứng SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG Nồng độ thích hợp OD t hu mẫu 0,6mM 3.5 2.5 1.5 0.5 1.71 1.76 1.77 1.72 1.8 1.81 1.77 1.7 1.69 1.9 Sinh khối thu cảm ứng 1.82 1.61 1.69 nồng độ IPTG khác tương đương 0.05 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ IPTG (mM) SV Phạm Hải Như - K57 CNSH 1.4 1.6 1.8 2.5 3 Khảo sát thời gian thu mẫu Đường chạy Tan tất thu mẫu, xuất băng protein xylan-1,4-β-xylosidase (≈40kDa) khác với dòng đối chứng o Chứng tỏ xbx dạng tan biểu thành công 12-48h nuôi cấy 20 C, cảm ứng IPTG 0,6mM SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Khảo sát thời gian thu mẫu Thời gian thu mẫu thích hợp 48h Sinh khối thu 48h lớn SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Đã biểu thành công xylan 1,4-β-xylosidase dạng tan E coli Rosetta o với điều kiện biểu thích hợp nhiệt độ 20 C, cảm ứng với IPTG 0,6mM, thu mẫu sau 48h SV Phạm Hải Như - K57 CNSH ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU Tối ưu thêm điều kiện ảnh hưởng đến biểu hiện: _ Môi trường (TB, TB cải biến, LB pH khác nhau,…) _ Cảm ứng nồng độ khác Tiến hành phá tế bào đệm khác (Tris-HCl, PBS,…) Tiến hành “Heat-shock” trước cảm ứng SV Phạm Hải Như - K57 CNSH Em xin chân thành cảm ơn! Đánh giá mức độ phù hợp codon Dự đoán tính tan ORF GL0112518 cầu disulfit Có thể thử thêm với chủng E coli Origami chủng cải biến để hỗ trợ trình tạo cầu disulfit Đuôi Hist-tag giúp tinh protein T7lac promoter giúp kiểm soát chặt chẽ thời điểm biểu LacI mã hóa chất ức chế gắn vào operator lac -> biểu có IPTG DE3 – đột biến thêm gen mã hóa cho T7 ARN polymerase Peptid tín hiệu tiết pelB, có tác dụng định hướng protein tái tổ hợp chuyển khoang chu chất tế bào Xylan 1,4-β-xylosidase thường tìm thấy sinh vật tiêu thụ sinh khối thực vật, phần lớn số vi khuẩn nấm Xylan 1,4-β-xylosidase nấm đưa vào sử dụng giá thành cao Trình tự ORF GL0112518 mã hóa xylan-1,4-β-xylosidase atggataaagttaccaatccggtgcttaccggttttcacgccgacccctcgattgtgagagtcggggattatttttacatcgctaattccacttttgaatggtatccaggcgtggaa ctgcaccgttcaaaaaacttggcgaattgggaatcgctgccttcgccgctgggcgaacggcggcttctggacatggaaggcgcgcgcgcgtcctgcggcatctgggcgccct gcttgagctacgccgacgggcttttctggctcatctataccaacgtgcgcacctggaacgcggggccgtggaaggactgccccaactacctgacaaccgccaagtcaatcga aggcccgtggtcagaccccgtgttcctcaactgctcaggctttgacccctcgctttttcatgacgatgacggcagaaagtggctggtcaacatggagtgggactaccgcaagcc gggcgaccccgaaggcccgcagttttcgggcatactgattcaggaatacagccccgcggaaaaaaggctcgcggggccggttcgcaagattttcacgggttccccgatagcc tgcgtggaaggcccgcacgtctacaagcgggacggctggtactacctgctcaccgccgagggcggcacggtgtataaccacgcggcgacccttgcccgctcccgcgcgttgg aagggccttacgagattcacccgcagaacccgcttatcagttcgcgggggaagccggaactgcgcctgcaaaaagcggggcacgcgagctggtgcgagaccgccgacggc agaacctacctggccttcttgtgcgggaggccgctgcccggcacgcaaaactgcccgctggggcgggagacttcgatagccgagctggtctggcacgaggggtggccgtat gtcaaaggcgaagacggaaacaggcagaatttccccgcggacactttcgagcctcccgtgaaaattgccgccccggcgcgaaagaggcgcgggcgctctatcagtttgacg gccccgccatccacggcgacttcaagactctccgcgttcccgccgaccctgaacgctgctcgttga ... giúp protein có đủ thời gian hoàn thiện cải biến sau dịch mã E Coli Rosetta (DE3) Biến thể từ E coli BL21, giữ ưu điểm BL21 tối ưu hóa codon Có E Coli SoluBL21 (DE3) thêm vector pRARE chứa tRNA... liệu metagenome từ ruột mối Đưa vào enzyme XhoI + NcoI iệ uh ể i B n n ạp Biến E Coli BL21 (DE3) Tốc độ sinh trưởng mạnh đặc trưng cho dòng B Có đột biến DE3 (thêm gen mã hóa T7 polymerase) giúp... nghiên cứu, xylan 1,4-β -xylosidase tiến hành biểu chủng Escherichia coli * xbx: gen mã hóa xylan 1,4-β -xylosidase có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh ruột mối Coptotermes gestroi SV Phạm Hải Như