Đang tải... (xem toàn văn)
Giáo trình các kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu sinh học. Nội DUNG 1. Thu hồi nucleic acid 2. Phân tích định tính và định lượng nucleic acid 3. Sử dụng các enzyme thông dụng trong sinh học phân tử 4. Lai phân tử 5. Tạo dòng 6. PCR 7. Giải trình tự nucleic acid 8. Biến đổi vật liệu di truyền và chuyển vật liệu di truyền đã biến đổi vào tế bào
Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn KỸ THUẬT DI TRUYỀN Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU GENE Sử dụng enzyme, vector Tách chiêt DNA, RNA CÔ LẬP GENE Phân tích đònh tính, đònh lượng Điện di PCR, RT-PCR Tạo dòng Giải trình tự Southern blot THU NHẬN GENE XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GENE Tổng hợp nhân tạo Các phương pháp in silico Northern blot Gây tạo đột biến TÌM HIỂU CHỨC NĂNG CỦA GENE Phiên mã – dòch mã in vitro Đo OD ỨNG DỤNG Mục tiêu : Hiểu rõ cấu trúc chức gene để ứng dụng vào lónh vực khoa học đời sống Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn NỘI DUNG Thu hồi nucleic acid Phân tích đònh tính đònh lượng nucleic acid Sử dụng enzyme thông dụng sinh học phân tử Lai phân tử Tạo dòng PCR Giải trình tự nucleic acid Biến đổi vật liệu di truyền chuyển vật liệu di truyền biến đổi vào tế bào Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn THU HỒI NUCLEIC ACID PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT - Tách chiết DNA - Tách chiết RNA PHƯƠNG PHÁP LY TÂM - Ly tâm phân đoạn - Ly tâm đẳng tỷ trọng – Thu nhận nucleic acid tinh PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Thu mRNA Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn TÁCH CHIẾT DNA & RNA DNA RNA Phá màng tế bào, màng nhân Chất tẩy (SDS) + siêu âm, Thiocyanate guanidinium LiCl, Urea, + học, Loại protein Phenol pH8 : Chloroform:IAA Khác Phenol pH4 : Chloroform:IAA Khác Tủa Ethanol tuyệt đối Isopropanol, Ethanol tuyệt đối Isopropanol, Boom Hấp phụ silica Hấp phụ silica Lọc Thu màng lọc Thu màng lọc Thu hồi nucleic acid : Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn PHÁ MÀNG SINH HỌC BẰNG CHẤT TẨY Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ Chất tẩy, phân tử lưỡng cực, kết hợp với protein màng phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn LY TÂM PHÂN ĐOẠN Ly tâm phân đọan (a) phân đoạn vùng (b) phân tách phần tử hỗn hợp dựa khối lượng chúng Thời gian lực ly tâm xác đònh cho nhóm phần tử Dung dòch ly tâm có tỷ trọng thấp phần tử cần phân tách Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn LY TÂM ĐẲNG TỶ TRỌNG Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân tách phần tử hỗn hợp dựa tỷ trọng chúng Thời gian lực ly tâm chung cho nhóm phần tử Dung dòch ly tâm có tỷ trọng với giá trò từ thấp đến cao tỷ trọng phần tử cần phân tách Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn THU HỒI NUCLEIC ACID, PHAGE SAU LY TÂM ĐẲNG TỶ TRỌNG Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Sắc ký lọc gel Sắc ký lực KT-KN Sắc ký trao đổi ion 10 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ MAXAM-GILBERT Các phản ứng giải trình tự : C : Hydrazine NaCl cắt base C G : G methyl hóa dimethylsulfate sau bò cắt kiềm G + A : Formic acid cắt liên kết base đường T + C : Hydrazine cắt vòng pyrimidine Bước cuối : Piperidine cắt base biến đổi Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ HÓA HỌC Kết kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ SANGER Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn MỘT SỐ BIỆN PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn The Single-Priming Method Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PRIMER ĐỘT BIẾN Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn PHƯƠNG PHÁP KUNKEL dut : dUTPase ung : uracil-DNA-glycosylase Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn PHƯƠNG PHÁP “TÁI SẮP XẾP DNA” (DNA SHUFFLING) Gồm bước : • “Đục lỗ” DNA Dnase I • Tiến hành PCR mồi : - Biến tính - Tái bắt cặp - Kéo dài Ỵ Tạo trình tự DNA “lai” (W.P Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747-10751) Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có mang plasmid Ti tái tổ hợp để chuyển gene vào tế bào thực vật Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn MỘT SỐ BIỆN PHÁP CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Phương pháp bắn gene Phương pháp vi tiêm Phương pháp biến nạp Phương pháp dùng vector virus Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT LIỆU PHÁP GENE Ở ĐỘNG VẬT : W Chuyển gene tế bào sinh dục Ỉ động vật chuyển gene W Chuyển gene tế bào sinh dưỡng Ỉ động vật “khảm” Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT Chuyển gene động vật thông qua tế bào ES (Embryonic Stem Cell – tế bào mầm) Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CÂU HỎI PHẦN Những yếu tố đònh tính đặc hiệu ? độ nhạy phương pháp PCR ? Làm cách tăng tính đặc hiệu, độ nhạy phương pháp PCR ? Những cách hạn chế nhược điểm phương pháp PCR Nêu số ứng dụng nested-,multiplex, AP-PCR, RACE, in situ PCR Nêu cách thực phản ứng real-time RT-PCR Đường chuẩn ? Xây dựng ? Dùng làm ? Ct ? Vì cần xác đònh Ct ? Nguyên lý PCR tái tổ hợp Nguyên lý phương pháp Giải trình tự theo Sanger, phương pháp Giải trình tự tự động Khác biệt hai phương pháp ? 10 Có thể gây đột biến điểm không đònh hướng ? 11 Có thể gây đột biến điểm đònh hướng ? 12 Nêu ứng dụng củ phương pháp “DNA Shuffling” 13 Cách chuyển vật liệu di truyền (VLDT) thực vật 14 Chuyển VLDT động vật : cách tiếp cận ưu nhược điểm chúng Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn ... chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE - Điện di theo phương nằm ngang - Giá thể gel agarose - Phát với màu nhuộm ethidium bromide, … phát huỳnh quang đèn tử ngoại... CÂU HỎI - PHẦN Các điểm khác biệt phương pháp tiến hành điện di gel agarose gel polyacrylamide Các ứng dụng điện di gel agarose, điện di gel polyacrylamide Phương pháp đo mật độ quang (OD) : -... wWw.SinhHoc.edu.vn ĐIỆN DI TRONG TRƯỜNG XUNG (PULSED-FIELD ELECTROPHORESIS) 15 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE