NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM RPS XỬ LÝ LIGNIN – CELLULOSE TRONG VỎ CÀ PHÊ THÀNH PHÂN HỮU CƠ Lời mở đầu I tổng quan tài liệu I.1. nghiên cứu ligin – cellulose(lc) trong vỏ cà phê( thành phần hóa học vỏ cà phê) Thành phần chủ yếu của tế bào thực vật là xenlulo, hemixenlulo và lignin I.1.1 Xenlulo. Thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm 505 tổng lượng hydrocacbon trên trái đất. Ngoài thực vật là nguồn chủ yếu còn có trong giới động vật, nhưng số lượng rất ít. Xenlulo là polysacarit gồm có anhydro- D- … liên kết với nhau bằng lien kết -1,4-glucozit, mức độ polyme hóa của Xenlulo rất cao tới 10000-14000 đơn vị glucoza/ phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và gian phân tử làm cho phân tử Xenlulo có độ cứng và vững chắc Liên kết glucozit không bền với acid. Xenlulo dễ bị phân hủy bởi acid và tạo thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro- Xenlulo có độ bền cơ học kém hơn Xenlulo nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo thành là D-glucoza Về bản chất hóa học Xenlulo là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo thành xenlulo-ancolat. Nguyên tử hydro ở các ở các nhóm OH bậc một và hai trong phân tử Xenlulo cũng có thể bị thay thế bởi các gốc – metyl, -etyl, … tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác nhau. Xenlulo cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy- Xenlulo. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO 4 ), và muối của nó. Xenlulo không tan trong nước, dung dịch kiềm làm trương phồng mạch Xenlulo và hòa tan một phần Xenlulo phân tử nhỏ. Đặc biệt Xenlulo dễ hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat (Cu(NH 3 ) 4 (OH) 2 ), và hàng loạt các dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadmi, kẽm…. I.1.2.Hemi Xenlulo. Cũng là một phần polysacarit thường gặp trong vách tế bào thực vật với hàm lượng lớn sau Xenlulo Tuy nhiên Xenlulo, hemixenlulo được hình thành không chỉ một đường mà nhiều đường khác nhau, thậm chí cả từ acid urnoic của chúng. Người ta gọi tên cụ thể một loại hemixenlulo là dựa theo tên loại đường chủ yếu tạo nên nó. Ví dụ: xylan là một hemixenlulo mà thành phần chủ yếu của nó là xyloza, manan – manoza, Trong gỗ cây lá kim, chủ yếu hemixenlulo được tạo nên từ loại đường 6 cacbon : galactam, manan… Khác với Xenlulo, phân tử hemixenlulo nhỏ hơn nhiều thông thường không quá 150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết -1,4 mà còn bằng liên kết -1,3 và -1,6 glucozit tạo ra mạch ngắn và phân nhánh Vì độ polyme thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemixenlulo không có cấu trúc chặt chẽ như ở xenlulo và độ bền hóa lý cũng thấp hơn. Hemixenlulo dễ tan trong dung dịch kiềm, trong nước nóng và dễ bị phân hủy bởi acid long Xylan là một hemixenlulo phổ biến nhất trong tự nhiên chiếm 30% khối lượng rơm, 20-25% cây gỗ lá rộng, 7-17% cây gỗ lá kim. I.1.3. Lignin Là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ở những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thắm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh Khc với xenlulo, hemixenlulo lignin hình thnh từ cc dẫn suất của phenyl, propan, một chất thơm có mạch nhánh. Nói cách chi tiết hơn, lignin là sản phẩm ngưng tụ của 3 thành phần chủ yếu rượu trans-p-cumaryl, trans-coniferyl, trans-cynapyl theo tỷ lệ khác nhau tùy loại thực vật. lignin của cây gỗ thực vật mềm điển hình (cy vn sm) gồm cĩ 80 conyferyl, 14 cumaryl và 6% coniferyl. Lignin của cây gỗ cứng gồm lượng bằng nhau của conyferyl và cynapyl, cịn cumaryl khiếm tỷ lệ rất nhỏ. Trong đại phân tử lignin, các đại cấu trúc nối với nhau bằng rất nhiều liên kết và loại liên kết, trong đó liên kết chủ yếu chiếm 50-60% số liên kết giữa monome là kiểu liên kết aryl-glyxerol--aryl ete. Ngồi ra cịn cc kiểu lin kết phenyl-cumaryl, biphenyl, diarylete. Vì dẫn suất của cc hợp chất thơm có mạch bên với nhiều nhớm chức hoạt động, đặc biệt là OH của nguyên tử cacbon(đối với vịng thơm) nên lignin có thể tham gia vào nhiều loại phản ứng đặc trưng khác hẳn với xenlulo và hemixenlulo, như các phản ứng thế( clo hóa), phản ứng este hóa, oxy hóa, dimetyl hóa. Hịa tan tốt trong dung dịch kiềm nóng, một phần trong dung môi hữu cơ I.1.4. Lignin-xenlulo tự nhiên là một cơ chất khó phân hủy Mỗi thnh phần cấu tạo nn lignin- xenlulo riêng, do bản chất các kiên kết hóa học, do mức độ polyme hóa và tính không tan trong nước là đối tượng khó phân hủy. tính khó phân hủy lại gia tăng lên nhiều lần khi chúng liên kết với nhau và với các thành phần khác nữa thành một thể cấu trúc chặt chẽ và phức tạp Cc mạch phn tử xelulo khơng bao giờ tồn tại ring lẻ m nhờ lin kết hydro gian phn tử tạo thnh các cấu trúc lớn hơn gọi là vi sợi, dọc theo sợi có những vùng tại đó các phân tử sắp xếp song song và chặt khít gọi là vùng kết tinh, xen kẽ những vùng mà có sự sắp xếp kém trật tự và chặt chẽ là vùng vô định hình. Cc vi sợi lin kết với nhau bằng cch đan xen ở những vùng vô định hình ny. Các vi sợi xenlulo, lignin, hemixenlulo theo những quy tắc những quy tắc nhất định để hình thnh nn cấu trc vi sợi. với cấu trc nhiều lớp gồm cĩ nhiều thnh phần cĩ bản chất hĩa học khc nhau như vậy, lignin-xenlulo có độ bền vật lý cao rất khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ thành phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến thành phần khác. Ví dụ để phân giải LX cần đồng thời phải tác động phân giải cả L, X, Hx. Nhưng do cả ba điều có tính chất hóa học khác nhau nên cơ chế tác động và điều kiện tiến hành cũng khác nhau . I.1.5.Xử lý sơ bộ nguyên liệu Thành phần hữu ích nhất của nguyên liệu đối với mục đích sinh học là X. hiệu quả của các quá trình thủy phân X phụ thuộc nhiều vào độ mẫn cảm của nó đối với tác nhân thủy phân. Trong tự nhiên X rất khó phân hủy vì phn tử của nĩ rất lớn độ kết tinh cao và nó liên kết chặt chẽ với lignin vì vậy việc xử lý sơ bộ là cần thiết. Phương pháp cổ điển là là xử lý bằng kiềm dựa trn tc dung kiềm hịa tan Lignin, lm phịng xenlulo, kỹ thuật đơn giản chỉ việc ngâm trong dung dịch NaOH 1,5% ở nhiệt độ thường sau 24h lọc rửa lấy chất cịn lại giu xenlulo cĩ độ thủy phân cao 70% ( ban đầu chỉ 50%) Na 2 CO 3 , NaOCl, acid peracetic… cũng là tác nhân khử Lignin mạnh. Đặc biệt là nhiệt độ và áp suất cao, etylenglycol ở 120 0 C 1at có thể khử 84% trong sản phẩm thu hồi chỉ có 1.9% Lignin ( ban đầu là 11.6%) Các phương pháp cắt, nghiền … tuy không làm giảm lượng Lignin nhưng sẽ làm tăng tiếp xúc bề mặt của cơ chất, góp phần làm yếu đi liên kết L-X, giảm độ polyme hóa, độ kết tinh của của Xenlulo do đó làm tăng độ thủy phân Tia γ có bước sóng ngắn làm giảm độ polyme hóa của X do đó làm tăng độ thủy phân. Tuy nhiên chúng có thể làm tăng biến tính mạch sacarit có hại cho quá trình chuyển hĩa sinh học Cc tc nhn vật lý khc như siêu âm, áp suất cao, nhiệt cũng có kết quả cao Các phương pháp trên có kết quả tốt nhưng chỉ trong điều kiện thí nghiệm và địi hỏi tốn nhiều chi phí, nhiều năng lượng và có thể gây ô nhiễm do sản phẩm phụ, I.2. Các enzyme phn hủy cellulose I.2.1.Thành phần và cơ chế tác động a) endo – 1,4--D- glucanaza không tấn công vào X kết tinh tấn công vào X vô định hình v CMC cũng như các xenlo-oligosacarit mạch dài b) exo – 1,4- -D- glucanaza tấn công X kết tinh, X vô định hình v xenlo- oligosacarit, CMC thì khơng. c) Xenlobiozan ( glucozidaza) chỉ thủy phn xenlobioza v xenlo- oligosacarit mạch ngắn, glucoza l sản phẩm thủy phn duy nhất v l chất kiềm chế Theo cơ chế này đầu tiên endo – glucanaza tấn công vào các vùng vô định hình trn bề mặt xenlulo cắt cc lin kết – 1,4 – glucozit tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp đến exo – glucanaza tấn công cắt ra từng đoạn 2 đơn vị glucoza, từng mạch đơn tạo thành. Kết quả tác động của endo-exo glucanaza lm xuất hiện cc xenlo- oligosacarit mạch ngắn, xenlobioza v cả glucoza, xenlobiza thủy phn tiếp tạo thnh glucoza. I.2.2.Sinh tổng hợp cellulase ở nấm Trong điều kiện hiếu khí, vai trị chính phn giải lignin-cellulose thuộc về nấm mục nâu và nấm mục trắng. cơ chất bị phân hủy hóa nâu là do lignin tích lũy. Nấm mục trắng phân giải tất cả các thành phần đó. Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật Trong tự nhiên có rất nhiều loài sinh vật có khả năng sinh ra cellulsae, nhưng nguồn quan trọng và có khả năng phân hủy cao vẫn là nấm, chúng dễ dàng phát triển trên môi trường đơn giản giải phóng nhiều nhiều enzyme cellulase có hiệu quả phân hủy cao cellulose Nhiều tác giả khẳng định cellulase có cơ chất cảm ứng tốt là cellulose, lactoza, … Nhưng có một số tác giả lại đưa ra bằng chứng cho rằng cellulase là một enzyme cấu trúc: có thể tộng hợp cellulase trên môi trường không có cellulose hay các chất cảm ứng thích hợp. đúng hơn cả cần phải coi sự tổng hợp cellulase có tính cảm ứng không chặt chẽ. Quan niệm này phù hợp với thực tế và cũng logic khi cellulose là cơ chất không tan trong nước, phân tử lớn, bản thân nó không thể xâm nhập vào tế bào để gây ra các phản ứng sinh hĩa bn trong tế bo vi sinh vật. Các chất gọi là cảm ứng chỉ có tác dụng dương tính trong một giới hạn nhất định, vượt qua giá trị đó sẽ ức chế tổng hợp cellulase. Sự kiềm chế tổng hợp celluase xảy ra rất mạnh trong môi trường có cacbon hydrat dễ tiêu, đặc biệt là glucoza. Khi môi trường cịn cĩ cc cacbon hydrat dễ tiu thì qu trình tổng hợp cellulase chưa xảy ra, thậm chí khi tế bào đang tổng hợp cellulase m bổ sung vo glucoza thì ngay lập tức sẽ lm giảm khả năng tổng hợp cellulase. Từ hiện tượng này các nhà khoa học cho rằng tổng hợp cellulase được kiểm soát bởi cơ chế dị hóa. Một số chất hữu cơ dễ đồng hóa không phải đường : pepton, glyxerin, gluxin có tác dụng làm tăng tổng hợp cellulase ở nhiều loài nấm Cĩ lẽ qu trình tổng hợp cellulase chịu điều khiển của nhiều cơ chế: cảm ứng, kiềm chế bởi sản phẩm cuối, kiềm chí dị hóa vàn hiệu quả của mỗi cơ chế tùy thuộc vào điều kiện môi trường và loài vi sinh vật Một hiện tượng phổ biến là: điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase khác với điều kiện tối ưu cho sinh trưởng, có lẽ đây là một biện pháp thích ứng với môi trường của vi sinh vật: cơ chế cần tiêu thụ nhiều đường glucoza hơn để bù đấp lại những bất lợi mà môi trường gây ra, kết quả là cellulase được tổng hợp nhiều hơn. Cũng có thể sự tổng hợp nhiều cellulase trong môi trường gây bất lợi cho sinh trưởng chỉ là kết quả của sự mất cân bằng sinh lý . Tác dụng bất lợi của một số chất hoạt động bề mặt ( twen 80, triton ) tới sự tổng hợp cellulase cũng được giải thích theo hai cơ chế. Theo sterberg , mandels, weber chất hoạt động bề mặt làm tăng tính thẩm thấu của màng tế bào, do đó làm dễ dàng giải phóng ra cellulase ra khỏi màng tế bào. Cịn Hulme v Strans cho rằng chng lm giảm sự thm nhập của oxy vo tế bo, do đó hạn chế sinh trưởng tăng tổng hợp cellulase. I.2.3. Cc enzyme phn giải lignin Thành phần và cơ chế tác động Ngay từ 1938, davison và cộng sự đ cho rằng enzyme phenoloxydaza rất phổ biến ở nấm mục trắng, chắc cĩ một vai trị no đó trong quá trình phn giải lignin, về sau hng loạt những enzyme oxy hóa phụ thuộc hay không phụ thuộc peroxyt, NAD, NADP đ được chứng minh là có vai trị trong qu trình phn giải lignin Eggling nhận thấy rằng tính oxy hóa rất mạnh và không đặc hiệu của các tác nhân phân giải lignin. Tác giả này cũng gi thiết vai trị quan trọng của gĩc OH. Ơng cho rằng gốc tự do ny tham gia vo nhiều phản ứng sinh hĩa trong cc phản ứng của qu trình phn giải lignin, gĩc . OH cĩ thể sinh ra từ H 2 O 2 , O 2 - + H 2 O 2 O 2 +OH - + . OH Trong vỏ cà phê có đầy đủ điều kiện để nấm tạo ra H 2 O 2 v tiến hnh phản ứng ny, cịn O 2 - đđược sinh ra trực tiếp từ phản ứng oxy hóa acol, glucoza, được xúc tác bởi oxygenaza. Các tác giả cũng nhận thấy như vậy và chắc rằng các góc tự do mang điện tích dương có vai trị khơi màu phản ứng cắt mạch bên của đại phân tử lignin Skersten và cộng tác bằng phương pháp cộng hưởng điện đ chứng minh sự hình thnh điện tích dương từ metoxybenzen trong quá trình phn giải cc hợp chất lignin Skriabin và cộng sự,m maltseva và cộng sự đ xc định được mối quan hệ chặt chẽ giữa sự hình thnh H 2 O 2 và mức độ lignin. Skriabin cịn chứng minh được sự có mặt và vai trị của gĩc . OH trong qu trình ny. Cho đến nay, những kết quả thu được và cho phép khẳng định thêm rằng hệ thống phân giải lignin bao gồm rất nhiều loại enzyme và coenzyme có khả năng oxy hóa cao. Sinh tổng hợp lignaza Các nấm mục trắng là nhóm vi sinh vật phân giải lignin. Trong đó có nấm pharerochaete chrysosporium có hoạt lực lignaza ngoại bào thuộc loại cao nhất. Một số tc giả thơng bo về về hiệu quả kích thích phân giải lignin, các dẫn suất thơm thành phần của lignin Nhiều tác giả thấy rằng sự phân giải lignin chỉ bắt đầu sau pha lag dài hay ngắn tùy thuộc vào loài và điều kiện môi trường, thường xảy ra mạnh nhất trong pha cân bằng của chu trình pht triển chính của vi sinh vật. Theo ý kiến của: Ander P, K.E. Eriksson sự phn giải l một hoạt động trao đổi chất thứ cấp, các tác giả cũng cho rằng các hoạt động trao đổi chất thứ cấp trong đó có cả phân giải lignin được khởi đầu bằng sự hạn chế dinh dưỡng và việc bổ sung dinh dưỡng thường hạn chế sự phân giải I.3. Lên men rắn và định hưĩng sản xuất chế phẩm RPS I.3.1. sơ lựoc lịch sử - đặc điểm của phưong php ln men rắn Tên này được sử dụng đầu tiên vào năm 1977 để phân biệt với tên len men lỏng hay chìm [...]... năng phân huỷ Lignin của nấm trên cơ chất này III.2 khả năng phân hủy lignin- cellulose vỏ cà phê của 3 chủng Nghiên cứu củ nhóm là ứng dụng khả năng phân huỷ LC trong vỏ cà phê của 3 chủng nấm để sãn xuất chế phẩm sinh học Trong vỏ cà phê có chứa hàm lượng Cellulose là 63,2% ,Lignin là 17,7%.Hai thành phần này rất khó phân huỷ,vì vậy cách rút ngắn tối đa thời gian phân huỷ của 2 thành phần này trong vỏ. .. trong vỏ cà phê là chọn các chủng nấm có khả năng phân giải mạnh LC Theo nghiên cứu của Th.sĩ Lê Hồng Phúc(ĐH Bách Khoa TPHCM):Thử nghiệm Enzym trên vỏ cà phê phế thải cho thấy: trong vòng 14 ngày hàm lượng LC giãm đáng kể.Quá trình lên men đã làm giảm 53% tổng lựơng Lignin và 33,4% tổng luợng Cellulose trong vỏ ban đầu III.3 chọn 3 chủng nấm sản xuất chế phẩm là phù hợp với yêu cầu nghiên cứu Phanerochete... tạo ra từ trước hay hình thnh một cch tự nhin trong lịng khối cơ chất I.3.3 chuyển hóa phế liệu LC thành phân bón hữu cơ I.3.4 .Sản xuất và bảo quản chế phẩm I.3.4.1.Chọn giá thể-tỉ lệ phối trộn 1 Chọn giá thể: Sản xuất chế phẩm vi sinh vật là một phương thức bảo quản giống hoạt hóa dưới dạng tiềm sinh,phương pháp cũng dựa trên nguyên tắc bào tử vsv được giữ trong hạt ngũ cốc hoặc ký sinh tạm trên môi... khi thay đổi pH trong nuôi cấy 3 chủng trên cho thấy tỉ lệ phối hợp trên phù hợp với với kết quả mà Mathodoes cùng cộng sự đã nghiên cứu năm 1999.Như vậy chúng tôi tiến hành chọn tỉ lệ phối trộn trong sản xuất chế phẩm RPS là 1:1:1 với 3 chủng PC36201 ,LE,SC là phù hợp với thực tế I.3.4.2.Chọn thiết bị sấy cho chế phẩm: Máy sấy băng tải: Để sấy các chủng nấm dùng trong thu hồi chế phẩm RPS chúng tôi... nghiên cứu Phanerochete chrysosporium,Schyzophyllum commune,Lentinula Edodes sãn xuất chế phẩm sinh học thành phân hữu cơ, thức ăn gia súc là phù hợp với yêu cầu nghiên cứu vì:khả năng phân huỷ tốt LC của 3 chủng nấm, tiết kiệm được chi phí cho nhà nông,vừa giữ gìn được môi trường không bị ô nhiễm từ mùi thối của vỏ cà phê phế thải ... hiện chế độ ‘ luân canh’ hoặc bổ sung chủng nấm bào tử giống vào,duy trì mật độ tb III kết quả và bàn luận III.1 sơ tuyển các dòng nấm tại VN có khả năng phân hủy LC và dùng trong sản xuất chế phẩm Các chủng nấm ở VN đều có khả năg phân huỷ LC,khi lai tạo bằng đơn bào tử xuất hiện 1 số dòng lai của nấm chân chim Schyzophyllum commune,nấm hương Lentinula Edodes, có khả năng phân huỷ Lignin tốt hơn và phân. .. được một khối lượng lớn cơ chất 4-5 lần lên men lỏng Môi trường rắn dễ bảo quản Lượng nước ít nên tiêu hao năng lượng cho việc khử trùng và xử lý sản phẩm ít Hoạt tính nước thấp, ít bị nhiễm Địi hỏi thiết bị v kỹ thuật đơn giản Tuy mức độ sử dụng cơ chất và chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm thấp nhưng tính theo mật độ cơ chất thì năng suất vẫn cao Nhược điểm: Khí, nhiệt bị hạn chế vi sinh vật phát triển... năng phân giải lignin- cellulose của 3 nòi trên dựa trên sự phối trộn kết quả (Kirschoff và cộng sự 2000) : Trên môi trường CMC có bố sung 10% cám,30% vỏ cà phê xay nhuyễn,60% mùn cưa Tỉ lệ phối hợp PC:LE:SC= Lignin( %) 70% 1:2:>=3 Cellulose( %) 60% 1:1:3 60% 50% 1:2:1 65% 55% 1:1:1 95% 2:1:1 38% 99,8% 47% Kirschoff và cộng sự đã nghiên cứu sự 3 chủng phối hợp sau thời gian 33 ngày ,cho thấy sự phân giải... Hấp khử trùng bằng nồi autoclave ở 1 atm trong 30 phút [116] - Môi trường gạo để nhân giống trung gian Thành phần gồm Gạo lức Nước 1kg 600 – 700ml Hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm trong 30 phút [6] - Môi trường lignin để khảo sát khả năng phân huỷ lignin Thành phần gồm: Lignin Agar 1g 20g Cho lignin vào nước cất, điều chỉnh pH = 4 bằng HCl 0,1N; đun nóng để lignin tan hoàn toàn Thêm nước cất đủ 1... autoclave ở 1 atm trong 30 phút - Môi trường lignin Lignin 1g Agar 20g Cho lignin vào nước cất, điều chỉnh pH=4 bằng HCl 0,1N; đun nóng để lignin tan hoàn toàn Thêm nước cất đủ 1lit, hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm trong 30 phút 2 khảo sát khả năng phân hủy lignin và cellulose bằng định tính - Phân lập tơ thứ cấp: Dùng dao cấy tách lấy mô nhầy của tai nấm, cho vào môi trường Raper đặc trong ống nghiệm . NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM RPS XỬ LÝ LIGNIN – CELLULOSE TRONG VỎ CÀ PHÊ THÀNH PHÂN HỮU CƠ Lời mở đầu I tổng quan tài liệu I.1. nghiên cứu ligin – cellulose( lc). cellulose( lc) trong vỏ cà phê( thành phần hóa học vỏ cà phê) Thành phần chủ yếu của tế bào thực vật là xenlulo, hemixenlulo và lignin I.1.1 Xenlulo. Thành phần