BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐỖ VĂN ĐẠT NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CATECHIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CHÈ XANH CAMELLIA SINENSIS L LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGHÀNH : KĨ THUẬT HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS TRẦN BẠCH DƯƠNG PGS.TS VŨ ĐÌNH HOÀNG HÀ NỘI, NĂM 2011 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 10 1.1 Giới thiệu chung chè EGCG 10 1.1.1 Vài nét tình hình trồng chế biến chè nước 10 1.1.2 Chè xanh chế phẩm thực phẩm dược phẩm 11 1.2 Thành phần hóa học sinh học chè xanh 13 1.2.1 Tannin catechin 14 1.2.2 Giới thiệu riêng EGCG 17 1.2.3 Các thành phần khác 18 1.3 Các phương pháp công nghệ sản xuất catechin chè xanh CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Các phương pháp phân lập sản phẩm 27 2.2.1 Quy trình chiết tổng Polyphenol caffeine thô 27 2.2.2 Phân tách hợp chất catechin từ tổng pholyphenol 28 2.3 Các phương pháp phân tích sản phẩm 31 2.3.1 Sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ 31 2.3.2 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 31 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Tổng polyphenol thu nhận 32 3.2 Caffeine (T4) 35 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt 3.2.1 Tinh chế caffeine thô 35 3.2.2 Kết phân tích cấu trúc caffeine phổ cộng hưởng từ hạt nhân –NMR 37 3.3 Epicatechin - EC ( FT2) 42 3.3.1 Tinh chế EC thô 42 3.3.2 Kết phân tích cấu trúc FT2 phổ cộng hưởng từ hạt nhân –NMR 42 3.4 Epigallocatechin - EGC ( TM2K) 47 3.4.1 Tinh chế EGC thô 47 3.4.2 Kết phân tích cấu trúc FT2 phổ cộng hưởng từ hạt nhân –NMR 47 3.5 Epigallocatechin gallat – EGCG (TM3K) 53 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 64 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) DEPT Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (Two – dimensional NMR) HSQC Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence ) HMBC Phổ HMBC ( heteronuclear multiple bond connectivity) MS ESI-MS TLC δ (ppm) EGCG Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) electron spray ionization mass spectroscopy Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Độ chuyển dịch hóa học (ppm) Epigallocatechin gallate (TM3K) EGC Epigallocatechin (TM2K) Luận văn thạc sĩ khoa học ECG EC (FT2) Đỗ Văn Đạt Epicatechin gallate Epicatechin T4 Caffeine Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt DANH MỤC CÁC BẢNG DÙNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.2a: Các catechin tìm thấy chè xanh 13 Bảng 1.2b: Thành phần catechin phận chè xanh 14 Bảng 1.4: So sánh lượng catechin chiết từ chè xanh theocác kỹ thuật sử dụng viba, siêu âm Soxhlet 16 Bảng 1.5: Tiêu chuẩn sản phẩm polyphenol công ty FuZhou Corona Science & Technology Development Co., Ltd (Trung Quốc) 22 Bảng 3.1 Đánh giá cảm quan polyphenol 24 Bảng 3.2 : Hàm lượng Catechin polyphenol đo LC-MS .33 Bảng 3.3: Độ chuyển dịch hóa học δH δC T4 ( caffeine) 34 Bảng 3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hợp chất EC 39 Bảng 3.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hợp chất TM2K (EGC) 45 Bảng 3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hợp chất EGCG (epi-Gallocatechin gallate) 51 Bảng 1.1: Ứng dụng chế phẩm polyphenol chè xanh chế biến thực phẩm .57 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt DANH MỤC HÌNH DÙNG TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1: Búp chè xanh .10 Hình 1.2 Công thức tổng quát catechin 14 Hình 1.3: Một số cấu trúc catechin chè xanh 15 Hình 1.4: Tóm tắt công nghệ chiết Polyphenol chè xanh giới .21 Hình 2.1: Chè xanh nguyên liệu đề tài 26 Hình 2.2 Thiết bị Soxhlet Pilot 20 lít 27 Hình 2.3 Cột chạy tách hợp chất catechin thô từ polyphenol .29 Hình 2.4 Cột tinh chế EGCG .31 Hình 3.1 Mẫu tinh thể polyphenol .32 Hình 3.2.a : Sắc ký đồ mẫu tổng polyphenol 33 Hình 3.2.b Các thông số phân tích mẫu tổng polyphenol 34 Hình 3.3: Tinh thể caffeine 35 Hình 3.4 Sơ đồ tinh chế Caffeine 36 Hình 3.5a : Phổ 1H caffein( T4) ghi dung môi DMSO-d6 38 Hình 3.5b : Phổ 13C caffein( T4) ghi dung môi DMSO-d6 39 Hình 3.6 Phổ DEPT caffein ( T4) ghi dung môi DMSO-d6 .40 Hình 3.7 Công thức cấu tạo caffein 41 Hình 3.8 a: Phổ 1H EC dung môi DMSO-d6 .43 Hình 3.8 b: Phổ 13C EC dung môi DMSO-d6 .44 Hình 3.9 Phổ DEPT EC ghi dung môi DMSO-d6 46 Hình 3.10 Công thức cấu tạo EC 47 Hình 3.11 a Phổ 1H EGCG ghi dung môi DMSO-d6 49 Hình 3.11 b: : Phổ C13 ghi dung môi DMSO-d6 50 Hình 3.12 Phổ DEPT EGC ghi dung môi DMSO-d6 52 Hình 3.13 Công thức cấu tạo EGC .53 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt Hình 3.14 Quy trình tách EGCG 54 Hình 3.15a : Phổ 1H EGCG ghi dung môi DMSO-d6 55 Hình 3.15 b : Phổ C13 ghi dung môi DMSO-d6 .56 Hình 3.16 Phổ DEPT EGCG ghi dung môi DMSO-d6 58 Hình 3.17 Công thức cấu tạo EGCG 59 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt LỜI MỞ ĐẦU Chè sử dụng loại đồ uống phương thuốc y học phương đông từ hàng ngàn năm trước Công nguyên Tuy nhiên, việc đẩy mạnh nghiên cứu chế tìm cách ứng dụng hoạt chất phenolic chè xanh vào y học đại nửa sau kỷ 20 Cho đến nay, với hoạt tính chống ôxy hóa mạnh, hợp chất catechin chè xanh (chiếm tới 30 % hàm lượng khô) sử dụng mỹ phẩm thực phẩm chức Trong y học, catechin (EC, EGC, ECG, EGCG) áp dụng điều trị nhiều loại bệnh tim mạch, viêm ung thư Các hoạt chất đặc biệt hiệu sử dụng phối hợp với biệt dược xử lý bệnh viêm, dị ứng, tim mạch Alzheimer, béo phì, tiểu đường phụ thuộc Insulin, Parkinson, HIV-1, ung thư da số loại ung thư khác Năm 2006, Cục Quản lý Dược Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận cao chiết chè xanh, polyphenol chè xanh catechin loại dược phẩm thực phẩm chức phép sử dụng Mỹ Trong chè xanh, thành phần catechin chủ yếu Epigallocatechin gallat (EGCG, có hàm lượng > 50 % tổng polyphenol) chất có hoạt tính mạnh Vì mà làm tách catechin riêng biệt có độ tinh khiết cao, phương pháp chiết tách đơn giản mà kinh tế vấn đề quan tâm Tuy nhiên, catechin chè xanh có cấu trúc tương tự làm cho trình tách riêng catechin trở nên khó khăn Hơn thường catechin chè xanh bị nhiễm lượng caffein, chất chiếm tới % trọng lượng khô chè không dễ dàng loại bỏ trình tách catechin Với tác dụng to lớn catechin mà đặc biệt EGCG, việc nghiên cứu chiết xuất chất từ chè quan tâm để ý tới.Với hướng tác giả chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu chiết tách catechin có hoạt tính sinh học từ chè canh Camellia Sinensis L ” Nội dung đề tài : Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt - Nghiên cứu phương pháp chiết chè xanh để thu nhận polyphenol tổng số từ chè xanh, đồng thời thu lượng caffeine - Xác định hàm lượng “tổng phenol”, phân bố catechin; - Phân lập xác định cấu trúc catechin tinh khiết phân lập được; Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt Hình 3.17 Công thức cấu tạo EGCG Cụ thể ta thấy cấu trúc vòng A thông qua proton H-8 H-6 tương tác ortho với số tương tác J = 2,2 HZ ( 5,38 5,93 ppm) Đồng thời ta thấy cấu trúc vòng C thể tín hiệu H-2 (4,95 ppm ); H-3 (5,37 ppm); H4eq H4 ax ( Ha (2,66 ppm ; J= 17,5HZ); (Hb (2,93 ppm ; J=5Hz; J=17,5HZ) Cuối so sánh giá trị phổ khối 1H- NMR 13C- NMR với tư liệu [41] Epigallocatechin gallate (EGCG) cho thấy trùng khớp Như với kết phân tích khẳng định cấu trúc EGCG hình 3.17 59 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt KẾT LUẬN Thực đề tài "Nghiên cứu chiết tách catechin có hoạt tính sinh học chè xanh Camllia sinensis L” thu kết sau: 1.Từ nguyên liệu chè xanh thu tổng polyphenol có hàm lượng catechin cao caffeine, tổng poyphenol nguyên liệu để phân lập catechin Bằng phương pháp sắc kí kết hợp, phân lập hợp chất từ huyết giác : Epicatechin – EC Epigalo caechin – EGC Epigalocatechin galat – EGCG Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT ), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều ( HSQC, HMBC) 60 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Ngọc Quỹ, Nguyễn Kim Phong Cây chè Việt Nam.NXB Nông Nghiệp 1997 GS TS Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 2003, 187-188 Đỗ Ngọc Quý, Cây chè Việt Nam: Sản xuất, chế biến tiêu thụ, NXB Nghệ An, 2003 http://cnx.org/content/m30280/latest (24/07/2009) N Caffin et al (2004), Developing an index of quality for Australian tea, © 2004 Rural Industries Research and Development Corp., Australia, 2004; J Tan et al (2006), Brain Research, 2006, p 216; Nguyễn Văn Chung Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm polyphenol từ chè xanh Việt Nam, TP Hồ Chí Minh tháng 12-2005 Nguyễn Thị Kim Oanh, Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà để ứng dụng vào thực phẩm dược phẩm, Luận văn thạc sĩ, Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh, 2004 Ngô Hữu Hợp, Hoá học Hoá sinh chế biến chè NXB Nông nghiệp, 1972 10 http://www.herbs-tech.com/product/egcg.asp 11 Saijo Ryoyasu (1982), Isolation and chemical structures of two new catechins from fresh tea leaf, Agric.Biol.Chem., 46(7), 1969-1970 12 Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Tác dụng dịch chiết chè xanh lên vi khuẩn sâu , Tạp chí dược liệu, tập 8, số 4/2003 ( trang 110 – 114) 13 C.A Rice-Evans et al (1995), Free Radical Research, 22 (4), p 375; 14 Chang.C.J, Chiu.K.L et.al (2000), Food chemistry 2000, 68, p 109; 61 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt 15 N Salah et al (1995), Archiv Biochem and Biophys 322 (2), p 339; 16 F Nanjo et al.(1996), Free Radical Biology and Medicine 21 (6), p 895; 17 S.Valcic et al (1999), Chem Res in Toxicology, 12 (4), p 382; 18 H.H Chow et al (2003), Clinical Cancer Research, 9(9), p 3312; 19 M.J Lee et al (2002), Cancer Epidemiology, Biomarkers, and Prevention, 11 (10/1), p 1025; 20 K.M Pisters et al (2001), Journal of Clinical Oncology, 19 (6), p 1830; 21 C.W Chang et al (1994), J of Biomed Sci., 1994; 22 C Santos-Buelga et al (2003), Methods in Polyphenol Analysis, ed by C Santos-Buelga and G Williamson, Pub by Hadcorver, England, 2003; 23 S.R Prous et al (2009), Process for the production of Botanical extracts, US Patent 2009/0042975; 24 I.A Gilmour et al (1997), Process for extraction of proanthocyanidins from Botanical material, WO Patent 97/44407; 25 H.N Graham et al (1992), Preventive Medicine, 21 (3), p 334; 26 P.A Dewdney, M.L Meara Natural fat-soluble antioxidants Scientific and technical Surveys No96 The British Food Manufacturing Industries Research Association,1977; 27 Kj Duve et al (1991), J Am Oil Chem Soc., 1991, 68, p 365; 28 M Watanable, Y ohshita, et.al (1997), J Agric Food Chem 1997, 45, p 1039; 29 T Constantina et al (2003), Extraction Optimization in food Engineeering, New York - Basel., 2003; 30 M Sims (1990), Decaffeinating with cacbondioxide, Tea and Coffee Trade Journal, September Issue, 1990, p.8; 31 Xuejun Pan et al (2003), Chemical Engineering and Processing, 2003, 42, p 62 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt 129; 32 Z Djarmati et.al (1991), J Am Oil Chem Soc., 1991, 68, p 731; 33 G Nonaka et al (1989), Poor and Appl Chem., 61 (3), p 357; 34 D.T Bailey et al (2001), Method for the isolation of caffein -free catechin from green tea, WO patent 01/5686; 35 D.C Burdick et al (2001), Procedure for the production of epigallocatechin gallate, EP patent 1077211; 36 M Ibern-Gomez et al (2002), Am I of Eno & Vit., 53 (3), p 218; 37 J.L Rubichaud et al (1990), J of the Sci F Agri., 53, p 343; 38 R Rodriguez et al (2005), J of Chrom A, 1066 (1-2), p 105 39 US patent 7012149 40 C.W Chang, F.L Hsu, J.Y Lin (1994), “Inhibitory effects of polyphenolic catechins from Chinese green tea on HIV reverse transcriptase activity”, Journal of Biomedical Science (Basel, Swizerland) 63 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt PHỤ LỤC A.Phụ lục Phụ lục 1.a : Phổ HSQC - 2D-NMR T4 (caffeine) dung môi DMSO-d6 64 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt Phụ lục 1.b : Phổ HMBC - 2D-NMR T4 (caffeine) dung môi DMSO-d6 65 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt B Phụ lục Phụ lục 2.a : Phổ HSQC - 2D-NMR FT2 (EC) dung môi DMSO-d6 66 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt 67 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt Phụ lục 2.b : Phổ HMBC - 2D-NMR FT2 (EC) dung môi DMSO-d6 C.Phụ lục 68 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt Phụ lục 3.a : Phổ HSQC - 2D-NMR TM2K (EGC) dung môi DMSO-d6 69 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt Phụ lục 3.b : Phổ HMBC - 2D-NMR TM2K (EGC) dung môi DMSO-d6 70 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt C.Phụ lục Phụ lục 4.a : Phổ HSQC - 2D-NMR TM3K (EGCG) dung môi DMSO-d6 71 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt Phụ lục 4.b : Phổ HMBC - 2D-NMR TM3K (EGCG) dung môi DMSO-d6 72 Luận văn thạc sĩ khoa học Đỗ Văn Đạt 73 ... EGCG, việc nghiên cứu chiết xuất chất từ chè quan tâm để ý tới.Với hướng tác giả chọn đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu chiết tách catechin có hoạt tính sinh học từ chè canh Camellia Sinensis L.. . có giá thành sản phẩm thấp, đặc biệt có ý nghĩa quốc gia vùng lãnh thổ nguyên liệu chè phế loại Các kỹ thuật tách EGCG catechin từ chè xanh: Các hợp chất catechin proanthocyanin chè xanh có tính. .. MỤC CÁC BẢNG DÙNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.2a: Các catechin tìm thấy chè xanh 13 Bảng 1.2b: Thành phần catechin phận chè xanh 14 Bảng 1.4: So sánh lượng catechin chiết từ chè xanh theocác