BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THU CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MỘT SỐ MẪU CHẾ PHẨM THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THU CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MỘT SỐ MẪU CHẾ PHẨM THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ: 60720408 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS-TS Nguyễn Thị Lập HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội dạy dỗ truyền đạt tri thức quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện trƣờng nhƣ trình tiến hành làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng với thầy cô giáo anh chị môn Hóa sinh trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện cho hoàn thành tốt công việc nghiên cứu khoa học Đặc biệt xin tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS.TS Nguyễn Thị Lập ngƣời trực tiếp tận tình hƣớng dẫn góp ý để hoàn thành luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan công tác giúp đỡ trình học tập thực luận văn Hà nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Trần Thị Thu Cúc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1.1.1.Đặc điểm hình thái nuôi cấy 1.1.2.Đặc điểm sinh hóa 1.1.3 Đặc điểm kháng nguyên 1.1.4 Hệ gen 1.1.5.Các yếu tố độc lực 1.1.6 Khả gây bệnh 1.1.7 Khả kháng thuốc kháng sinh 10 1.2 PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOÀI VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG 11 1.2.1 Theo phƣơng pháp truyền thống 11 1.2.2 Theo phƣơng pháp đại 12 1.2.2.1 Phƣơng pháp ELISA 13 1.2.2.2 Phƣơng pháp giải trình tự DNA 13 1.2.2.3 Phƣơng pháp lai phân tử (Hybridization) 14 1.2.2.4 Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) 15 1.3 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu: 23 2.1.2.Nguyên vật liệu, trang thiết bị: 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Các bƣớc tạo mẫu tự tạo dùng nghiên cứu 26 2.2.2.Quy trình phát P aeruginosa theo phƣơng pháp truyền thống .27 2.2.3 Tách chiết DNA vi khuẩn phƣơng pháp PCR 29 2.2.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn: 29 2.2.3.2 Định lƣợng DNA phƣơng pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 260 nm (A260) 30 2.2.3.3 Nhân đoạn gen 16S ribosomal RNA loài vi khuẩn kỹ thuật PCR 30 2.2.3.4 Lựa chọn yếu tố phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa 32 2.2.3.5 Nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa cặp mồi đặc hiệu chọn 35 2.2.3.6 Điện di ADN gel agarose 35 2.2.3.7 Đánh giá độ đặc hiệu: 36 2.2.3.8 Đánh giá độ nhạy phƣơng pháp: 37 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 TÁCH CHIẾT DNA CỦA P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM THUỐC TỰ TẠO 39 3.1.1 Tạo mẫu tự tạo kiểm tra có mặt P aeruginosa theo phƣơng pháp truyền thống 39 3.1.2 Kết kiểm tra tách chiết DNA tổng số điện di 41 3.1.3 Kết kiểm tra tách chiết DNA vi khuẩn tổng số PCR .42 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR 43 3.2.1.Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa 43 3.2.2 Nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa 50 3.2.3 Xác định độ đặc hiệu quy trình thiết lập 51 3.2.4 Xác định ngƣỡng phát quy trình thiết lập 55 3.3.ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PCR ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG MẪU CHẾ PHẨM TỰ TẠO 57 CHƢƠNG BÀN LUẬN 61 4.1 VỀ KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA CỦA P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM 61 4.2 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR 61 4.3 VỀ KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PCR ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG MẪU CHẾ PHẨM TỰ TẠO 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PCR Polymerase chain reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa DNA Acid deoxyribonucleic RNA Acid ribonucleic dNTP Deoxynucleotide triphotphat ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng chuẩn Hoa kỳ) CFU bp Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) Base pair (cặp base) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Đặc điểm hình thái P.aeruginosa môi trƣờng lựa chọn .28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra DNA tách…………31 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng phản ứng PCR thông thƣờng…… 32 Bảng 2.4: Dải nồng độ lựa chọn thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu…………………………………………………………………… 33 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR khảo sát lựa chọn thành phần phản ứng nhân gen đặc hiệu …………………………………… …….34 Bảng 3.1 Kết kiểm tra P aeruginosa mẫu tự tạo theo phƣơng pháp truyền thống ………………………………………………………… 40 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa ………………………………………………………… 44 Bảng 3.3 Bảng thành phần PCR phù hợp cho phản ứng nhân đoạn gen đặc hiệu …………………………………….…………………….49 Bảng 3.4: Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi 26 loài chủng vi sinh vật chuẩn……………………………………………………………… 52 Bảng 3.5 Kết đếm lại số lƣợng vi sinh vật đƣa vào mẫu ban đầu… ….55 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA ……………………….41 Hình 3.2: Nhân đoạn gen 16s rRNA vi khuẩn cặp mồi ID16R08F IDL16R09R ………………………………………………42 Hình 3.3 Kết tối nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………… 43 Hình 3.4: Kết lựa chọn nồng độ mồi cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa cặp mồi PAL-F/PAL-R …………… 45 Hình 3.5: Kết lựa chọn nồng độ Mg2+ cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P.aeruginosa cặp mồi PAL-F/PAL-R …………… 46 Hình 3.6: Kết lựa chọn nồng độ dNTPs cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa cặp mồi PAL-F/PAL-R …………… 47 Hình 3.7 Kết lựa chọn nồng độ enzyme cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa cặp mồi PAL-F/PAL-R ……… 48 Hình 3.8: Kết lựa chọn nồng độ đệm cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa cặp mồi PAL-F/PAL-R …………… 49 Hình 3.9 Kết nhân đoạn gen đặc hiệu P aeruginosa cặp mồi PAL-F/PAL-R ……………………………………………………51 Hình 3.10.Kết PCR kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi PAL-F/PAL-R 54 Hình 3.11: Kết kiểm tra ngƣỡng phát quy trình …………… …… 56 Hình 3.12 Kết điện di kết PCR kiểm tra hiệu tách chiết DNA từ mẫu tự tạo …………………………………………………………… 57 Hình 3.13: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt P aeruginosa mẫu tự tạo cặp mồi PAL-F/PAL-R …………….58 Hình 3.14 Kết PCR phát P aeruginosa chế phẩm nghi ngờ nhiễm P aeruginosa ………………………………………………… 60 Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 VỀ KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA CỦA P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM Trong nghiên cứu này, kết điện di hình 3.1 cho thấy băng DNA tổng số xuất dƣới dạng băng nét, không chứa nhiều tạp chất Điều chứng tỏ quy trình tách chiết tinh thành công DNA tổng số Phản ứng PCR xảy thích hợp đoạn DNA khuôn mẫu không đƣợc dài, thƣờng khuếch đại tốt đoạn DNA dài khoảng – 1,5 kb Hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc vào mức độ sai sót thân enzym mà phụ thuộc vào số ban đầu DNA mẫu Lƣợng DNA mẫu ban đầu lớn gây sai số cao trình chép Phƣơng pháp cho phép xác định DNA với lƣợng thấp, khoảng nhỏ 100 ng Sai số ngẫu nhiên vài chu kỳ đầu lan rộng đến chu kỳ sau Do đó, việc giảm lƣợng DNA mẫu ban đầu hạn chế đƣợc khuếch đại ―kí sinh‖ tạo sản phẩm phụ không mong muốn Mẫu DNA tinh cho kết tốt nhất, nhiên nhiều kỹ thuật PCR đạt kết tốt DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Thậm chí phƣơng pháp PCR cho phép khuếch đại mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt, bị phân hủy nhƣ vết máu lâu ngày, tinh dịch khô, hóa thạch, tóc, móng tay ngƣời chết 4.2 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR Để phƣơng pháp phát có độ đặc hiệu cao, bƣớc quan trọng quy trình PCR việc chọn mồi Mồi tiêu quan trọng để đạt đƣợc khuếch đại đặc trƣng có hiệu cao Chọn mồi dựa theo 61 số nguyên tắc sau đây: Chọn trình tự mồi xuôi mồi ngƣợc cho chúng không bắt cặp bổ sung mồi xuôi mồi ngƣợc cấu trúc kẹp tóc bắt cặp bổ sung phần khác mồi Mồi phải đặc hiệu DNA cần khuếch đại không trùng với trình tự khác gen Trong nghiên cứu lựa chọn cặp mồi dựa trình tự mồi đƣợc thiết kế, lựa chọn chứng minh tính đặc hiệu từ nghiên cứu trƣớc [14,6,46] Với cặp mồi PAL-F/ PAL- R nhân đƣợc đoạn gen có kích thƣớc khoảng 504 bp loài P aeruginosa, đoạn gen oprL mã hóa tạo lipoprotein màng [14] Các kích thƣớc vạch hoàn toàn phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết loài này, không thu đƣợc vạch nhân mẫu không chứa DNA (hình 3.9) Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi PAL-F/PAL-R 26 loài chủng vi sinh vật chuẩn với cặp mồi PAL-F/PAL-R, quy trình PCR nhân đoạn gen đặc hiệu cho kết PCR dƣơng tính với khuôn DNA chủng P aeruginosa 23 loài vi sinh vật dùng để kiểm tra độ đặc hiệu lại có kết PCR âm tính ( hình 3.10) Nhƣ vậy, với thành phần phản ứng, quy trình thiết lập cặp mồi thiết kế, nhân thành công đoạn gen đặc hiệu cho loài P aeruginosa Quy trình đạt độ đặc hiệu cao (100%) Kết nghiên trƣớc Sedighe Rashno Taee cộng với gen oprL cho độ đặc hiệu 100% [51], điều chứng tỏ đoạn gen có độ đặc hiệu loài cao Mặt khác, độ nhạy cao tiêu chí quan trọng việc phát vi sinh vật Kết nghiên cứu đề tài cho thấy ngƣỡng phát quy trình (bao gồm từ bƣớc làm giàu vi khuẩn qua môi trƣờng tăng sinh, tách chiết DNA PCR)