BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… TRỊNH ANH VIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI ARDISIA THUỘC HỌ MYRSINACEAE Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số: 62.44.01.17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội-2017 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Quốc Long TS Nguyễn Thị Hồng Vân Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Việt Nam nước nhiệt đới gió mùa, đa dạng địa hình, thổ nhưỡng đặc trưng khí hậu khác vùng miền Đây điều kiện thuận lợi để loài sinh vật phát triển đa dạng số lượng loài, phong phú chủng loại, có nhiều loài thực vật sử dụng làm thuốc dân gian Họ Đơn nem (Myrsinaceae) họ thực vật lớn, bao gồm 50 chi khoảng 1400 loài, phân bố rộng rãi giới, nước có khí hậu ôn đới nhiệt đới Trong đó, chi Cơm nguội (Ardisia) có khoảng 400 - 500 loài Kết nghiên cứu tài liệu cho thấy loài Ardisia có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý, như: hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, hoạt tính chống oxi hóa, chống lao, antileishmania, chống đái tháo đường, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch, chống loãng xương đặc biệt hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư tốt Các hợp chất phân lập từ số loài Ardisia có cấu trúc phong phú, bao gồm tritecpen saponin, benzoquinon, flavonoid, alkylphenolic, dẫn xuất bergenin, dẫn xuất resorcinol…, có nhiều chất có cấu trúc Ở Việt Nam, họ Đơn nem có khoảng 140 loài phân thành chi (gồm có: Ardisia, Embelia, Maesa, Aegyceras, Rapanea Myrsine) phân bố rộng Việt Nam, vùng đồng trung du Chi Ardisia có khoảng 101 loài, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thực vật hạn chế Việt Nam, chúng sử dụng phạm vi dân gian để chữa bệnh Các loài chi Ardisia thường có tác dụng nhiệt giải độc, tiêu thũng sử dụng để chữa bệnh viêm khớp, đòn ngã tổn thương, sưng đau hầu họng, trị tiêu chảy, lậu, sốt rét, viêm ruột, mụn nhọt ghẻ lở trị bệnh gan Vì vậy, với mong muốn tìm kiếm hoạt chất ứng dụng Y-Dược từ nguồn dược liệu Việt Nam, chọn loài thuộc chi Cơm nguội (Ardisia), họ Đơn nem (Myrsinaceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án - Phân lập hợp chất từ số loài Ardisia Việt Nam - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập - Thăm dò hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập Các nội dung nghiên cứu luận án - Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn gây độc tế bào cặn chiết metanol tổng 09 loài Ardisia thu hái Việt Nam - Nghiên cứu phân lập hợp chất từ loài Ardisia A balansana, A splendens, A insularis A incarnata - Nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp hóa lý đại - Nghiên cứu thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng vi rút hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập Cấu trúc luận án Luận án gồm 155 trang đánh máy với 54 bảng, 48 hình Phân bố cụ thể sau: Mở đầu 02 trang, tổng quan 37 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 08 trang, thực nghiệm 20 trang, kết thảo luận 68 trang, kết luận kiến nghị 03 trang, danh mục công trình công bố 02 trang, tài liệu tham khảo 15 trang NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN Chƣơng TỔNG QUAN Bao gồm ba phần: phần tổng quan đặc điểm hình thái phân loại họ Đơn nem (Myrsinaceae) chi Cơm nguội (Ardisia) thông tin loài Ardisia sử dụng làm thuốc dân gian Việt Nam; phần tổng quan tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ardisia giới; phần tổng quan tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ardisia Việt Nam Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án loài Ardisia, bao gồm: A incarnata, A insularis, A pseudocrispa, A splendens, A stangii, A balansana, A caudata, A maculosa A primulaefolia, có 04 loài nghiên cứu sâu thành phần hóa học hoạt tính sinh học A balansana, A splendens, A insularis, A incarnata 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xử lý chiết mẫu Các mẫu thực vật sau thu hái rửa sạch, thái nhỏ, phơi bóng mát, sấy khô nhiệt độ 50-60oC nghiền thành bột Bột chiết kết hợp siêu âm gia nhiệt dung môi metanol 50oC (3 lần × lần) Dịch chiết metanol sau cất loại dung môi áp suất giảm thu cao chiết metanol Cao metanol bổ sung thêm nước chiết phân bố lại với dung môi n-hexan, cloroform, etyl axetat n-butanol Cất loại dung môi áp suất giảm thu cao chiết tương ứng 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất từ mẫu Việc phân tích, phân tách phần dịch chiết thực phương pháp sắc ký khác như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) với pha tĩnh silica gel pha thường silica gel pha đảo YMC RP 18, sắc ký rây phân tử với pha tĩnh sephadex LH-20 (Merck) sắc ký cột diaion 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Sử dụng phương pháp phổ đại đồng thời kết hợp phân tích, tra cứu tài liệu tham khảo để xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Các thiết bị phương pháp sử dụng gồm: Điểm nóng chảy (Mp); phổ khối lượng (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1HNMR, 13C-NMR DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY 2.2.4 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Các chủng vi sinh vật kiểm định: vi khuẩn Gram (+) B subtillis, S aureus; vi khuẩn Gram (-) E coli, P aeruginosa; nấm men S cerevisiae, C albicans nấm mốc Asp niger, F oxysporum Các chứng dương tính là: ampicilin cho vi khuẩn Gram (+), tetracylin cho vi khuẩn Gram (-), nystatin cho nấm sợi nấm men 2.2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi rút Hoạt tính kháng virut đánh giá theo phương pháp SRB có đánh giá hiệu gây bệnh tế bào (CPE) Ribavirin sử dụng làm chứng dương, DMSO sử dụng làm chứng âm 2.2.4.3 Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro Hoạt tính gây độc tế bào thử Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phép thử thực theo phương pháp Monks Skehan Các dòng tế bào ung thư thử nghiệm: KB; LU-1; MCF7; HepG2; LNCaP; A-549, HT-29 OVCAR Chƣơng THỰC NGHIỆM 3.1 Sàng lọc đối tƣợng nghiên cứu theo định hƣớng hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn gây độc tế bào 3.2 Chiết tách, phân lập hợp chất 3.2.1 Chiết tách, phân lập hợp chất từ rễ A balansana 3.2.1.1 Xử lý mẫu từ rễ A balansana Từ cao chiết cloroform (AB/B, 50 g), etyl axetat (AB/C, 30 g), phần cặn nước (AB/F, g) rễ cơm nguội balansa (A balansana), 06 hợp chất phân lập xác định cấu trúc hóa học 3.1.2.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ rễ A balansana 3.2.2 Chiết tách, phân lập hợp chất từ A splendens 3.2.2.1 Xử lý mẫu A splendens Từ cao chiết n-hexan (AS1; 50 g), etyl axetat (AS2; 80 g) cặn nước (AS3; 70 g) loài cơm nguội rạng (A splendens), phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất, hợp chất có cấu trúc 3.2.2.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ A splendens 3.2.3 Chiết tách, phân lập hợp chất từ A insularis 3.2.3.1 Xử lý mẫu A insularis Từ cao chiết n-hexan (AI1; 40 g), etyl axetat (AI2; 45 g) cặn nước (AI3; 65 g) tương ứng, phân lập xác định cấu trúc 14 hợp chất, hợp chất có cấu trúc 3.2.3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ A insularis 3.2.4 Chiết tách, phân lập hợp chất từ A incarnata 3.2.4.1 Xử lý mẫu A incarnata Từ cao chiết n-hexan (AInc1; 55g), etyl axetat (AInc2; 86g) cặn nước (AInc3; 72g), phân lập xác định cấu trúc hợp chất 3.2.4.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ A incarnata CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết sàng lọc hoạt tính cao chiết metanol tổng 4.1.1 Kết sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn Bảng 4.1 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cao chiết metanol tổng STT Tên mẫu thử AC AInc AI AM APr APs AS ASt AB VK Gram (-) E c P e 200 200 200 200 200 200 Giá trị MIC (µg/ml) VK Gram (+) Nấm mốc B s S a A n F o 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Nấm men C a S.s 200 200 200 200 - Ghi ký hiệu viết tắt bảng: E c: E Coli; P e: P Earuginosa; B.s: B.subtilis, S a: S.aureus; A n: A.niger; F o:F.oxysporum; C a: C.albicans; S s: S serevisiae Kết Bảng 4.1 cho thấy: Một số loài cơm nguội thể khả kháng lại số chủng vi khuẩn chủng nấm thử nghiệm với giá trị MIC 200 µg/ml, loài: A incarnata, A insularis, A pseudocrispa, A splendens, A stangii A balansana 4.1.2 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào cao metanol tổng Bảng 4.2 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cao chiết metanol tổng STT Tên mẫu thử KB LU-1 Giá trị IC50 (µg/ml) HepG2 LNCaP MCF7 7 10 AC AInc AI AM APr APs AS ASt AB >100 6,09 41,55 >100 > 100 99,85 55,52 57,18 53,67 >100 8,46 45,31 >100 > 100 > 100 56,51 44,77 54,11 >100 5,26 45,62 >100 93,79 > 100 50,62 50,41 47,68 >100 5,59 56,13 >100 >100 > 100 59,20 59,51 67,09 >100 12,63 61,13 >100 89,05 > 100 52,99 55,84 74,27 Từ kết Bảng 4.2, thấy rằng: cao chiết metanol loài cơm nguội thắm (Ardisia incarnata) thể hoạt tính tốt dòng tế bào ung thư thử nghiệm, giá trị IC50 nằm khoảng 5,26 – 12,63 µg/ml Cao chiết metanol loài A insularis, A splendens, A balansana A stangii thể hoạt tính trung bình dòng tế bào Cao chiết metanol loài lại có hoạt tính 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất đƣợc phân lập 4.2.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ rễ cơm nguội balansa (A balansana) Từ rễ A balansana, hợp chất bao gồm: angelicoidenol (AB-1), axit gallic (AB-2), metyl gallate (AB-3), quercetin (AB-4), myricitrin (AB-5) rutin (AB-6) phân lập xác định cấu trúc Trong đó, hợp chất AB-1 AB-3 lần phân lập từ chi Ardisia 4.2.2 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập từ cơm nguội rạng (A splendens) Từ cơm nguội rạng (Ardisia splendens), 12 hợp chất bao gồm chất myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS-1) 11 hợp chất biết khác myricitrin (AS-2), desmanthin-1 (AS-3), myricetin 3O-(3"-O-galloyl)α-L-rhamnopyranoside (AS-4), quercetin 3,-O-α-L- rhamnopyranoside (AS-5), quercetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS6), catechin (AS-7), benzyl O-β-D-glucopyranoside (AS-8), 2-phenylethyl O-β-D-glucopyranoside (AS-9), 3S, 5R, 6R, 9S-tetrahydroxymegastigman- 7-ene (AS-10), corilagin (AS-11) (2S)-3-O-(9, 12, 15-octadecatrienoyl)glyceryl-β-D-galactopyranoside (AS-12) phân lập xác định cấu trúc Các hợp chất AS-3, AS-4, AS-5, AS-6, AS-8, AS-9, AS-10, AS-11 AS-12 lần phân lập từ chi Cơm nguội (Ardisia) Hợp chất AS-1 (myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside) Hợp chất AS-1 thu dạng chất bột màu vàng Các tín hiệu thu phổ 1H-NMR 13C-NMR AS-1 gợi ý hợp chất falavonoid Cụ thể, phổ 1H-NMR hợp chất AS-1 cho thấy có mặt tín hiệu sau: hai tín hiệu doublet với số tương tác J = 2,5 Hz δH 6,39 (1H, d) 6,64 (1H, d) đặc trưng cho hai proton ghép cặp meta vòng A; tín hiệu singlet δH 6,95 (2H, s) đặc trưng cho hai proton vòng B Về phía trường cao có xuất hai tín hiệu hai proton anomeric δH 5,31 (br s) 5,52 (br s) Điều gợi ý AS-1 flavonoid glycoside Phổ 13C-NMR (Bảng 4.9) có mặt tín hiệu cộng hưởng 27 nguyên tử cacbon, có 15 cacbon thuộc khung flavonol 12 cacbon hai cấu tử đường Các liệu phổ 1H-NMR 13 C-NMR AS-1 có dạng tương tự hợp chất quercetin 3,7-di-O-α-Lrhamnopyranoside ngoại trừ xuất thêm nhóm hydroxyl vị trí C-5´ Tiến hành thủy phân hợp chất AS-1 thu L-rhamnose (được xác định dẫn xuất trimetylsilyl phương pháp GC-MS) Điều khẳng định có mặt hai cấu tử đường α-L-rhamnopyranosyl cấu trúc AS-1 Trên phổ HMBC có xuất tương tác proton anomeric cấu tử đường rhamnose thứ H-1" (δH 5,31) với cacbon C-3 (δC 136,5); proton anomeric cấu tử đường rhamnose thứ hai H-1"' (δH 5,52) với cacbon C-7 (δC 163,4), cho thấy hai cấu tử đường gắn váo vị trí C-3 C-7 khung flavonol Các kết 11 metyl gallat (AI-13) 01 dẫn xuất megastigman lần phân lập từ chi Ardisia (3S, 5R, 6R, 7E, 9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside (AI-14) phân lập xác định cấu trúc Hợp chất AI-1 (ardinsuloside) : Hợp chất AI-1 thu dạng chất bột màu trắng Phổ 1H-NMR AI-1 cho thấy có xuất tín hiệu sau: sáu tín hiệu singlet nhóm metyl bậc δH 0,73, 0,87, 0,88, 0,99, 1,00 1,20 với tín hiệu broad singlet proton olefinic δH 5,17 tín hiệu doublet proton nhóm oximetin δH 3,61, gợi ý hợp chất AI1 có cấu trúc kiểu khung tritecpen olean Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR AI-1 có xuất hai proton anomeric δH 4,35 (1H, d, J = 7,6 Hz) 4,54 (1H, d, J = 7,6 Hz) chứng tỏ cấu trúc AI-1 có chứa hai cấu tử đường Phổ 13C-NMR phổ DEPT AI-1 cho thấy xuất tín hiệu 41 nguyên tử cacbon, bao gồm: 07 cacbon bậc bốn, 14 cacbon nhóm metin, 14 cacbon nhóm metylen cacbon nhóm metyl Các liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR AI-1 tương tự với số liệu phổ hợp chất assamicoside A, nhiên hợp chất AI-1 không xuất hai nhóm hydroxy C-16 C-21 khung aglycone Trên phổ HMBC, mối tương tác proton H-23 (δH 3,33 3,64) với cacbon C-3 (δC 83,5), C-4 (δC 43,8), C-5 (δC 48,2) C-24 (δC 13,4); proton H-24 (δH 0,73) với cacbon C-3 (δC 83,5), C-4 (δC 43,8), C-5 (δC 48,2), C-23 (δC 65,2) cho thấy hai nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C-3 C-23 khung aglycon Cấu hình nhóm hydroxyl C-3 nhóm metyl C-4 xác định cấu hình β xuất phổ ROESY tương tác proton H-3 (δH 3,61)/H-23 (δH 3,33 3,64)/H-5 (δH 1,22) với số tương tác lớn JH2a/H3a = 10,4 Hz Mặt khác, phổ 12 HMBC, tương tác proton H-28 (δH 3,10) với cacbon C-16 (δC 22,9), C-17 (δC 38,1), C-18 (δC 43,9) C-22 (δC 32,3) khẳng định nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C-28 Thủy phân hợp chất AI-1 thu Dglucose L-arabinose Hằng số tương tác proton anomeric hai cấu tử đường JH-1′/H-2′ =7,6 Hz JH-1″/H-2″ = 7,6 Hz chứng tỏ hai cấu tử đường có cấu hình -D-glucopyranoside -L-arabinopyranoside Ngoài ra, phổ HMBC hợp chất AI-1 xuất tương tác proton anomeric H-1″ (δH 4,54) cấu tử đường glucopyranoside với cacbon C-3′ (δC 84,2) cấu tử đường arabinopyranoside, tương tác proton H-3′ (δH 3,64) cấu tử đường arabinopyranoside với cacbon C-1″ (δC 105,5) cấu tử đường glucopyranoside chứng tỏ hai cấu tử đường gắn với thông qua liên kết  -D-glucopyranosyl-(13)--Larabinopyranoside Phần cấu tử đường lại gắn vào vị trí C-3 khung aglycon thông qua xuất mối tương tác proton H-3 (δH 3,61) cacbon C-1′ (δC 106,1) arabinopyranoside, tương tác proton anomeric H-1′ (δH 4,35) arabinopyranoside với cacbon C-3 (δC 83,5) khung aglycon phổ HMBC Ngoài ra, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS hợp chất AI-1 cho pic ion giả phân tử m/z 787,4394 [M+Cl]– (tính toántheo lý thuyết cho công thức phân tử C41H68O12Cl, Calcd 787,4405) Hình 4.23 Phổ 1H-NMR hợp chất AI-1 13 Hình 4.24 Phổ 13C-NMR hợp chất AI-1 Hình 4.30 Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS hợp chất AI-1 Tổng hợp liệu phổ thu đây, hợp chất AI-1 xác định 3,23,28-trihydroxyolean-12-ene-3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→3)-L-arabinopyranoside Đây hợp chất đƣợc đặt tên ardinsuloside Bảng 4.20 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất AI-1 C Hợp chất AS-1 δC, ppm δH, ppm (J, Hz) 39,6 0,96 (m)/1,62 (m) 26,3 1,73 (m)/1,81 (m) C 21 22 83,5 3.61 (br d, 10,4) 23 43,8 48,2 18,9 33,3 1,22 (m) 1,40 (m)/1,50 (m) 1,32 (m)/1,65 (m) 24 25 26 27 41,0 - 28 10 49,0 37,6 1,64 (m) - 29 30 Hợp chất AS-1 δC, ppm δH, ppm (J, Hz) 35,3 1,12 (m) 32,3 1,35 (m)/1,52 (m) 3,33 (d, 10,4) 65,2 3,64 (d, 10,4) 13,4 0,73 (s) 16,6 1,00 (s) 17,4 0,99 (s) 26,6 1,20 (s) 3,10 (d, 11,2) 69,8 3,51 (d, 11,2) 33,8 0,87 (s) 24,0 0,88 (s) 14 11 12 13 14 24,7 123,4 145,7 42,9 1,89 (m) 5,17 (br s) - 1 2 3 4 106,1 72,1 84,2 69,5 15 26,6 1,32 (m)/1,84 (m) 5 66,9 16 17 18 19 20 22,9 38,1 43,9 47,8 31,8 1,19 (m) 1,97 (m) 1,04 (m)/1,77 (m) - 1″ 2″ 3″ 4″ 5″ 105,5 75,3 77,9 71,1 77,6 6″ 62,3 4,35 (d, 7,6) 3,68 (dd, 7,6/8,0) 3,64 (m) 4,03 (br s) 3,56 (d, 12,0) 3,86 (d, 12,0) 4,54 (d, 7,6) 3,30 (m) 3,35 (m) 3,30 (m) 3,30 (m) 3,65 (d, 4,8/12,0) 3,83 (d, 12,0) Hình 4.31 Cấu trúc hóa học hợp chất AI-1 4.2.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ cơm nguội thắm (Ardisia incarnata) Từ cơm nguội thắm (Ardisia incarnata), hợp chất bao gồm myricitrin (AInc-1), quercitrin (AInc-2), afzeline (AInc-3), 3S, 5R, 6R, 9Stetrahydroxymegastigman-7-ene (AInc-4), (3S,5R,6R,7E,9S)-megastigman-7ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside (AInc-5), (2S)-3-O-(9, 12, 15octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside (AInc-6), angelicoidenol (AInc-7) axit gallic (AInc-8) phân lập xác định cấu trúc Nhận xét chung kết nghiên cứu thành phần hóa học 04 loài cơm nguội : Như vậy, kết nghiên thành phần hóa học từ loài cơm nguội A balansana, A splenden, A insularis A incarnata, phân lập xác định cấu trúc 40 hợp chất, có hợp chất 12 hợp chất lần phân lập từ chi Ardisia Cấu trúc 40 hợp chất phân lập trình bày Bảng 4.30 15 Bảng 4.30: Tổng hợp cấu trúc hóa học hợp chất phân lập ST T Tên hợp chất Ký hiệu chất Myricetin 3,7-di-O-αL-rhamnopyranoside AS-1 Chất ardinsuloside AI-1 Chất myricitrin AB-5 AS-2 AI-6 AInc-1 desmanthin-1 AS-3 myricetin 3-O-(3"-Ogalloyl)-α-Lrhamnopyranoside AS-4 AI-7 desmathine-2 AI-8 quercetin AB-4 Cấu trúc 16 quercetin 3-O-α-Lrhamnopyranoside AS-5 AI-9 AInc-2 quercetin 3,7-di-O-αL-rhamnopyranoside AS-6 10 rutin AB-6 11 afzeline AInc-3 12 catechin AS-7 13 3-O-galloylepicatechin AI-10 14 3-O-galloyl-3'methoxyepicatechin AI-11 15 Axit gallic 16 Metyl gallat 17 bergenin AB-2 AI-12 AInc-8 AB-3 AI-13 AI-2 17 18 norbergenin AI-3 19 demethoxybergenin AI-4 20 4-O-galloylbergenin AI-5 21 β-1-O-galloyl-3,6-(R)hexahydroxydiphenoyl -D-glucose AS-11 22 benzyl O-β-Dglucopyranoside AS-8 23 2-phenylethyl O-β-Dglucopyranoside AS-9 24 angelicoidenol AB-1 AInc-7 25 26 27 3S, 5R, 6R, 9Stetrahydroxymegastig man-7-ene (3S, 5R, 6R, 7E, 9S)megastigman-7-ene3,5,6,9-tetrol 3-O-β-Dglucopyranoside (2S)-3-O-(9,12,15octadecatrienoyl)glyceryl-β-Dgalactopyranoside AS-10 AInc-4 AI-14 AInc-5 AS-12 AInc-6 18 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập đƣợc 4.3.1 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn Bảng 4.31 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn số hợp chất phân lập S T T Ký hiệu chất AB-4 AB-6 AS-3 AS-11 AI-2 AI-3 AInc-1 AInc-2 AInc-3 VK Gr (-) E c P e 200 200 200 200 200 Giá trị MIC (µg/ml) VK Gr (+) Nấm mốc B s S a A n F o 200 200 200 200 - Nấm men C a S.s 200 200 200 - Ghi ký hiệu viết tắt bảng: E c: E Coli; P e: P Earuginosa; B.s: B.subtilis, S a: S.aureus; A n: A.niger; F o: F.oxysporum; C a: C.albicans; S s: S serevisiae Kết thu Bảng 4.31 cho thấy: số hợp chất AB-6 (rutin), AS-3 (desmanthin-1), AI-3 (norbergenin), AInc-1 (myricitrin), quercitrin (AInc-2), afzeline (AInc-3) thể có hoạt tính số chủng vi sinh vật kiểm nghiệm với giá trị MIC 200 µg/ml 4.3.2 Hoạt tính kháng virut Coxsackie A16 Bảng 4.32 Hoạt tính kháng virut số hợp chất phân lập STT Ký hiệu chất AS-2 (AInc-1) AS-3 AS-11 Tên hợp chất Myricitrin Desmanthin-1 Corilagin IC50 (µM) 40,1 32,2 30,5 Các kết thu Bảng 4.32 cho thấy: hợp chất myricitrin, desmanthin-1, corilagin có hoạt tính ức chế virut CA16 với giá trị IC50 tương ứng 40,1, 32,2 30,5 µM 4.3.3 Hoạt tính gây độc tế bào Một số hợp chất thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào A-549, HT-29 OVCAR, kết thu bảng 19 Bảng 4.33 Hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập Ký hiệu chất AI-1 AI-2 AI-3 AI-4 AI-5 AI-6 AI-7 AI-8 AI-9 AI-10 AI-11 AI-12 AI-13 A-549 14,6±3,1 94,4±8,2 94,4±7,4 99,3±12,4 65,6±10,4 71,5±5,7 76,2±4,5 53,1±5,6 66,4±8,8 99,2±5,3 43,3±2,6 79,7±6,6 91,5±7,5 (%) Tế bào sống sót HT-29 OVCAR 21,7±5,3 16,2±2,8 92,7±5,9 97,0±6,7 87,5±6,2 99,9±6,6 97,9±9,9 80,8±5,5 88,9±7,3 76,7±4,5 73,4±5,6 93,6±3,6 86,4±7,2 89,0±2,1 69,3±3,9 59,4±9,7 76,0±5,4 69,7±12,1 98,8±8,9 91,4±6,1 56,2±6,4 48,8±4,6 65,9±7,1 81,8±8,7 83,7±5,8 82,3±4,3 Các kết thu Bảng 4.33 cho thấy: hợp chất ardinsuloside (AI-1) thể khả ức chế dòng tế bào A549, HT-29 OVCAR với tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót tương ứng là: 14,6; 21,7 16,2%, hợp chất lại thử nghiệm khả ức chế ức chế tế bào ung thư thử nghiệm Do đó, hợp chất AI-1 lựa chọn tiếp tục nghiên cứu để xác định giá trị IC50 Bảng 3.34 đưa giá trị IC50 hợp chất AI-1 chất đối chứng dương mitroxantrone Bảng 4.34 Giá trị IC50 hợp chất AI-1 dòng tế bào A-549, HT-29 OVCAR Ký hiệu chất AI-1 Mitroxantrone A-549 8,5± 1,2 7,2±0,5 Giá trị IC50 (μM) HT-29 16,4± 3,1 3,1±0,3 OVCAR 13,6±3,4 8,4±0,9 Kết thu cho thấy, hợp chất AI-1 có hoạt tính gây độc tế bào mạnh ba dòng tế bào thử nghiệm A-549, HT-29 OVCAR với giá trị IC50 tương ứng 8,5; 16,4; 13,6 μM Ngoài ra, tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào 20 số hợp chất dòng tế bào ung thư như: KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan) LNCaP (ung thư tuyến tiền liệt) Kết đưa Bảng 4.35 Bảng 4.35 Hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập STT Ký hiệu chất 10 AB-4 AB-6 AS-3 AS-11 AI-2 AI-3 AInc-1 AInc-2 AInc-3 Elippticine KB >100 >100 62,12 57,8 >100 53,37 48,96 >100 >100 1,13 LU-1 >100 >100 76,48 85,97 >100 57,99 52,45 >100 >100 0,96 Giá trị IC50 (µg/ml) HepG2 LNCaP >100 >100 >100 >100 67,89 81,57 >100 >100 >100 >100 >100 >100 49,95 48,79 68,92 75,83 >100 >100 0,08 0,97 MCF7 >100 >100 >100 >100 >100 32,09 81,92 >100 >100 1,22 Các kết thu Bảng 4.35 cho thấy: hợp chất myricitrin (AInc-1 hay AS-2) có hoạt tính trung bình dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB, LU-1, HepG2 LNCaP Các hợp chất lại không biểu có hoạt tính có hoạt tính yếu số dòng tế bào thử nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Sau thời gian thực hiện, đề tài thu kết sau: Về thành phần hóa học: Đã phân lập xác định cấu trúc 40 hợp chất từ 04 loài Ardisia, có 02 hợp chất có cấu trúc mới, 12 hợp chất lần phân lập từ chi Ardisia Cụ thể sau: - Từ cơm nguội rạng (Ardisia splendens), phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất, bao gồm myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS-1) 11 hợp chất biết khác myricitrin (AS-2), desmanthin-1 (AS- 21 3), myricetin 3-O-(3"-O-galloyl)α-L-rhamnopyranoside (AS-4), quercetin 3,O-α-L-rhamnopyranoside (AS-5), quercetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS-6), catechin (AS-7), benzyl O-β-D-glucopyranoside (AS-8), 2phenylethyl O-β-D-glucopyranoside (AS-9), 3S,5R,6R,9S- tetrahydroxymegastigman-7-ene (AS-10), corilagin (AS-11) (2S)-3-O(9,12,15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside (AS-12) Trong đó, hợp chất AS-1 hợp chất mới; hợp chất AS-3, AS-4, AS-5, AS-6, AS-8, AS-9, AS-10, AS-11 AS-12 lần phân lập từ chi Ardisia - Từ cơm nguội đảo (Ardisia insularis), phân lập xác định cấu trúc 14 hợp chất, bao gồm: ardinsuloside (AI-1), 04 dẫn xuất bergenin (bergenin (AI-2), norbergenin (AI-3), demethoxybergenin (AI-4), 4-Ogalloylbergenin (AI-5), 06 hợp chất flavonoid gồm myricitrin (AI-6), myricetin 3-O-(3″-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside (AI-7), desmanthine-2 (AI-8), quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside (AI-9), 3-O-galloylepicatechin (AI-10), 3O-galloyl-3'-methoxyepicatechin (AI-11), 02 hợp chất phenolic axit gallic (AI-12), metyl gallat (AI-13) 01 dẫn xuất megastigman (3S, 5R, 6R, 7E, 9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside (AI-14) Trong đó, hợp chất AI-1 hợp chất mới, hợp chất AI-14 lần phân lập từ chi Ardisia - Từ cơm nguội thắm (Ardisia incarnata), phân lập xác định cấu trúc hợp chất, bao gồm myricitrin (AInc-1), quercitrin (AInc-2), afzeline (AInc-3), 3S,5R,6R,9S-tetrahydroxymegastigman-7-ene (AInc-4), (3S,5R,6R,7E,9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-β-D-glucopyranoside (AInc-5), (2S)-3-O-(9,12,15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside (AInc-6), angelicoidenol (AInc-7) axit gallic (AInc-8) - Từ rễ cơm nguội balansa (Ardisia balansana), phân lập xác định cấu trúc hợp chất, bao gồm: angelicoidenol (AB-1), axit gallic (AB-2), metyl gallate (AB-3), quercetin (AB-4), myricitrin (AB-5) rutin 22 (AB-6) Trong đó, hợp chất AB-1 AB-3 lần phân lập từ chi Ardisia Về hoạt tính sinh học: * Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn: Đã khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn số chất phân lập Kết cho thấy, số hợp chất AB-6 (rutin), AS-3 (desmanthin-1), AI-3 (norbergenin), AInc-1 (myricitrin), quercitrin (AInc2), afzeline (AInc-3) thể có hoạt tính số chủng vi sinh vật kiểm nghiệm với giá trị MIC 200 µg/ml * Hoạt tính gây độc tế bào: Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro số chất phân lập Kết cho thấy, hợp chất ardinsuloside (AI-1) thể khả ức chế dòng tế bào A-549, HT-29 OVCAR với giá trị IC50 tương ứng 8,5; 16,4 13,6 μM Hợp chất myricitrin (AInc-1 hay AS-2) có hoạt tính trung bình dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB, LU-1, HepG2 LNCaP * Hoạt tính kháng virus: Đã khảo sát hoạt tính kháng virut số chất phân lập Kết thu cho thấy, hợp chất myricitrin (AInc-1), desmanthin-1 (AS-3) corilagin (AS-11) có hoạt tính kháng virut Coxsackie A16 (một loại virut gây bệnh chân tay miệng trẻ em) với giá trị IC50 tương ứng 40,1; 32,2 30,5 µM KIẾN NGHỊ Trong số chất phân lập từ loài Ardisia, có hợp chất myricitrin có loài Ardisia nghiên cứu (A splendens, A balansana, A insularis, A Incarnata) Đây hợp chất flavonoid glycoside, biết đến có hoạt tính kháng virut, kháng viêm, 23 giảm đau, chống oxi hóa Đặc biệt, khuôn khổ đề tài luận án này, myricitrin chứng minh có khả ức chế virus Coxsackie A16 gây bệnh chân tay miệng trẻ em Do đó, đề xuất cần nghiên cứu sâu dược lý hợp chất myricitrin để ứng dụng hóa dược NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đã lần nghiên cứu thành phần hóa học 04 loài Ardisia Việt Nam, loài: cơm nguội thắm (A incarnata), cơm nguội balansa (A balansana), cơm nguội rạng (A splendens), cơm nguội đảo (A insularis) - Đã phân lập xác định cấu trúc 40 hợp chất, có hợp chất myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS-1) ardinsuloside (AI-1); 12 hợp chất lần phân lập từ chi Ardisia gồm : angelicoidenol (AB-1), metyl gallate (AB-3), desmanthin-1 (AS-3), myricetin 3-O-(3"-O-galloyl)α-L-rhamnopyranoside (AS-4), quercetin 3,O-α-L-rhamnopyranoside (AS-5), quercetin 3,7-di-O-α-L- rhamnopyranoside (AS-6),benzyl O-β-D-glucopyranoside (AS-8), 2phenylethyl O-β-D-glucopyranoside (AS-9), 3S,5R,6R,9S- tetrahydroxymegastigman-7-ene (AS-10), corilagin (AS-11), (2S)-3-O(9,12,15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D-galactopyranoside (AS-12) (3S, 5R, 6R, 7E, 9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-β-D- glucopyranoside (AI-14) - Đã thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut số hợp chất phân lập Kết cho thấy hợp chất myricitrin (AInc-1), desmanthin-1 (AS-3) corilagin (AS-11) có hoạt tính kháng virut Coxsackie A16 (một loại virut gây bệnh chân tay miệng trẻ em) với giá trị IC50 tương ứng 40,1, 32,2 30,5 µM 24 - Đã thử hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập số dòng tế bào ung thư thử nghiệm Kết cho thấy, chất ardinsuloside (AI-1) thể khả ức chế dòng tế bào A549, HT-29 OVCAR với giá trị IC50 tương ứng 8,5; 16,4; 13,6 μM DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN * Các báo quốc tế: Nguyen Thi Hong Van, Trinh Anh Vien, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Pham Quoc Long, Luu Tuan Anh, Nguyen Manh Cuong, Jae-Hyoung Song, Hyun-Jeong Ko, Nanyoung Kim, Seon Ju Park and Seung Hyun Kim (2014) Chemical components of Ardisia splendens leaves and their activity against Coxsackie A16 viruses Natural Product Communications, 9(5), p 643-645 Nguyen Thi Hong Van, Trinh Anh Vien, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Quoc Long, Luu Tuan Anh, Nanyoung Kim, SeonJu Park, Seung Hyun Kim (2015) Chemical components from the leaves of Ardisia insularis and their cytotoxic activity Arch Pharm Res, 38(11), p1926-1931 Nguyen Thi Hong Van, Céline Rivière, Pham Quoc Long, Trinh Anh Vien, Phan Van Kiem, Chau Van Minh (2015) Flavonoids, megastigmanes and other constituents from Ardisia incarnata Biochemical Systematics and Ecology, 61(2015), 413-416 * Các báo quốc gia: Trinh Anh Vien, Nguyen Thi Hong Van, Pham Quoc Long, Luu Tuan Anh (2014) Preliminary study on the chemical constituents of Ardisia insularis belonging to the family Myrsinaceae in Vietnam Tạp chí Dược 25 liệu, 19 (5), p 310-313 Trịnh Anh Viên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phạm Quốc Long, Lưu Tuấn Anh, Nguyễn Mạnh Cường, Lê Mai Hương, Trần Thị Như Hằng, Đoàn Lan Phương, Lê Minh Hà, Nguyễn Quốc Bình (2014) Các hợp chất flavonoid phân lập từ cơm nguội rạng (Ardisia splendens) Tạp chí KH&CN, 52 (5A), p 116-122 Trịnh Anh Viên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phạm Quốc Long, Lưu Tuấn Anh, Nguyễn Mạnh Cường, Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Cầm Thị Ính, Phạm Cao Bách, Nguyễn Tuấn Anh (2014) Nghiên cứu thành phần hóa học cơm nguội rạng (Ardisia splendens) Tạp chí KH&CN, 52 (5B), p 712-718 Trịnh Anh Viên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Đỗ Thị Thảo, Trần Thị Hằng, Nguyễn Anh Tuấn, Phạm Quốc Long Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn gây độc tế bào số loài chi cơm nguội (Adisia) Việt Nam Tạp Chí Sinh Học, 2016, 38(1): 75-80 Nguyễn Thị Hồng Vân, Trịnh Anh Viên, Phạm Quốc Long, Nguyễn Mạnh Cường, Lưu Tuấn Anh (2014) Một số flavonoid dẫn xuất bergenin phân lập từ cơm nguội đảo Ardisia insularis Tạp chí Hóa học, T53(3), 310-316 Lưu Tuấn Anh, Nguyễn Thị Hồng Vân, Vũ Đình Hoàng, Trịnh Anh Viên, Phạm Quốc Long (2013) Một số kết nghiên cứu ban đầu thành phần hóa học cơm nguội balansana (Ardisia balansana) Việt Nam Tạp chí Hóa học, 51(6ABC), p 99-102 10 Nguyễn Thị Hồng Vân, Lưu Tuấn Anh, Trịnh Anh Viên, Vũ Đình Hoàng, Nguyễn Mạnh Cường, Phạm Quốc Long (2013) Một số kết nghiên cứu ban đầu thành phần hóa học cơm nguội balansana (Ardisia balansana) Việt Nam Tạp chí Hóa học, 51(6ABC), p 103-106 ... nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ardisia giới; phần tổng quan tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ardisia Việt Nam Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN... nguội (Ardisia) , họ Đơn nem (Myrsinaceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu. .. Ardisia có khoảng 101 loài, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thực vật hạn chế Việt Nam, chúng sử dụng phạm vi dân gian để chữa bệnh Các loài chi Ardisia thường có tác dụng