BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGÔ THỊ ANH VÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ CELLOBIOSE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ HÀ NỘI - 2015 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc ủng hộ, giúp đỡ hƣớng dẫn tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Trƣớc hết, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ Phòng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình định hƣớng, hƣớng dẫn, truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên sinh viên phòng thí nghiệm hóa sinh - sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, khuyến khích giúp vƣợt qua khó khăn suốt trình nghiên cứu Hà Nôi, ngày tháng năm 2015 Ngô Thị Anh Vân LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Trần Liên Hà trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Ngô Thị Anh Vân LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung axit lactic 1.1.1 Đặc điểm công thức cấu tạo 1.1.2 Ứng dụng axit lactic 1.2 1.1.2.1 Ứng dụng thực phẩm 1.1.2.2 Ứng dụng ngành khác Các phƣơng pháp sản xuất axit lactic 1.2.1 Tổng hợp axit lactic đƣờng hóa học 1.2.2 Tổng hợp axit lactic đƣờng sinh học 1.3 1.2.2.1 Lên men sản xuất axit lactic từ glucose 1.2.2.2 Lên men sản xuất axit lactic từ biomass Lên men axit lactic từ cellobiose 13 1.3.1 1.3.1.1 Giới thiệu cellobiose 13 1.3.1.2 Nguồn cung cấp cellobiose 14 1.3.2 1.4 Giới thiệu cellobiose nguồn dinh dƣỡng từ cellobiose 13 Lên men sản xuất axit lactic từ cellobiose 16 1.3.2.1 Cơ chế lên men axit lactic đồng hình từ cellobiose 18 1.3.2.2 Cơ chế lên men axit lactic dị hình từ cellobiose 18 Các vi khuẩn lên men sản xuất axit lactic từ cellobiose 19 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.4.1 Giới thiệu chung vi khuẩn lên men sản xuất axit lactic 19 1.4.2 Đặc điểm chung vi khuẩn lên men axit lactic 19 1.4.3 Một số chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ cellobiose 21 1.5 1.4.3.1 Chủng vi khuẩn phân lập từ tự nhiên 21 1.4.3.2 Chủng vi khuẩn đột biến 21 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả lên men axit lactic 22 1.5.1 1.5.1.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon 22 1.5.1.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ 23 1.5.1.3 Nguồn dinh dưỡng vitamin 23 1.5.1.4 Các hợp chất khoáng 23 1.5.1.5 Các hợp chất hữu khác 24 1.5.2 1.6 Nhu cầu dinh dƣỡng 22 Một số yếu tố ảnh hƣởng 24 1.5.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 24 1.5.2.2 Ảnh hưởng pH 24 1.5.2.3 Ảnh hưởng cellobiose 25 1.5.2.4 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 25 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ cellobiose nƣớc giới 25 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị sử dụng 27 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 27 2.1.2 Dụng cụ hóa chất 27 2.1.3 Môi trƣờng 28 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC 2.2 CÔNG NGHỆ SINH HỌC Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập 28 2.2.2 Phƣơng pháp tuyển chọn 28 2.2.2.1 Phương pháp cấy chấm điểm 28 2.2.2.2 Phương pháp đục lỗ thạch 29 2.2.2.3 Phương pháp định tính axit lactic 29 2.2.2.4 Phương pháp định lượng axit lactic 30 2.2.3 2.2.3.1 Quan sát mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào 31 2.2.3.2 Quan sát mô tả đặc điểm sinh lý – sinh hóa 31 2.2.4 2.3 Đặc tính sinh lý – sinh hóa chủng vi khuẩn đƣợc chọn 31 Định tên vi sinh vật phƣơng pháp sinh học phân tử 31 2.2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 31 2.2.4.2 Phương pháp điện di gel agarose 32 2.2.4.3 Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 33 2.2.4.4 Giải trình tự 33 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả tổng hợp axit lactic chủng vi khuẩn 34 2.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 34 2.3.2 Ảnh hƣởng pH 34 2.3.3 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng 34 2.3.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống 35 2.3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men 35 2.4 Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Behnken 35 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ cellobiose 38 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men thu axit lactic cao 39 3.2.1 Định tính axit lactic 39 3.2.2 Tuyển chọn phƣơng pháp cấy chấm điểm 40 3.2.3 Tuyển chọn phƣơng pháp đục lỗ thạch 41 3.2.4 Tuyển chọn phƣơng pháp chuẩn độ NaOH 0,05N 41 3.3 Định tên chủng S5 43 3.3.1 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng S5 43 3.3.2 Định tên phƣơng pháp sinh học phân tử 44 3.4 3.3.2.1 Tách DNA tổng số 44 3.3.2.2 PCR phân đoạn 16S rRNA 44 3.3.2.3 Giải trình tự DNA 45 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả tổng hợp axit lactic chủng L plantarum S5 48 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 48 3.4.2 Ảnh hƣởng pH 49 3.4.3 Ảnh hƣởng cellobiose 50 3.4.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống 51 3.4.5 Ảnh hƣởng cao nấm men 52 3.5 Tối ƣu quy hoạch thực nghiệm sử dụng phần mềm DX7 53 3.5.1 Tối ƣu quy hoạch thực nghiệm 53 3.5.2 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ƣu sinh tổng hợp axit lactic 59 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC 3.6 CÔNG NGHỆ SINH HỌC Động học trình lên men tổng hợp axit lactic chủng L plantarum S5 điều kiện tối ƣu 60 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 4.1 Kết luận 62 4.2 Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 67 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt 16SF Forward primer Mồi xuôi 16SR Reverse primer Mồi ngƣợc ADP Adenosine diphosphate Phân tử mang lƣợng ATP Adenosine triphosphate Phân tử mang lƣợng Ca Calcium Canxi DNA Deoxylribonucleic acid Axit nucleic mang lƣợng EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit Ethylenediaminetetraacetic g/l Gram/liter Gam/lít g/g Gram/gram Gam/gam G- Gram- Gram âm G+ Gram+ Gram dƣơng PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PLA Polylactic acid Axit polylactic RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate v/p Round/minute Vòng/ phút v/v Volume/volume Thể tích/ thể tích LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo hóa học axit lactic Hình 1.2 Đồng phân quang học axit lactic Hình 1.3 Cấu trúc lignocellulose Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp axit lactic từ sinh khối thực vật 12 Hình 1.5 Sự định hƣớng trục tinh thể nhƣ sơ đồ thứ tự cellobiose lặp lặp lại đơn vị cellulose 13 Hình 1.6 Cấu tạo phân tử cellulose 15 Hình 1.7 Cơ chế hoạt động 1,4-β-D glucan cellobiohydrolase 16 Hình 1.8 Quá trình phân giải cellulose cellulase 16 Hình 1.9 Quy trình lên men axit lactic từ cellobiose 17 Hình 3.1 Kết thử thuốc thử uffelmann 40 Hình 3.2 Kết cấy chấm điểm 40 Hình 3.3 Kết đục lỗ thạch 41 Hình 3.4 Hàm lƣợng axit tạo thành chủng 42 Hình 3.5 Hình thái chủng S5 43 Hình 3.6 Kết điện di tách DNA tổng số 44 Hình 3.7 Kết điện di chủng S5 44 Hình 3.8 Cây phân loại độ tƣơng đồng chủng S5 với chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum 45 Hình 3.9 Kết thử Uffelmann chủng L plantarum S5 môi trƣờng gluocse cellobiose 47 Hình 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ 48 Hình 3.11 Ảnh hƣởng pH 49 Hình 3.12 Ảnh hƣởng cellobiose 50 Hình 3.13 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống 51 Hình 3.14 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men 53 Hình 3.15 Biểu đồ bề mặt đáp ứng tỷ lệ cấp giống hàm lƣợng đƣờng thay đổi, nông độ chất giá trị trung bình 57 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC 3.5.2 CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hàm kỳ vọng điều kiện tối ƣu sinh tổng hợp axit lactic Sử dụng phƣơng pháp hàm kỳ vọng để tối ƣu hóa hàm lƣợng axit lactic thu đƣợc phần mềm Design-Expert Kết tìm đƣợc 43 phƣơng án thí nghiệm phƣơng án tốt để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: hàm lƣợng đƣờng 10,99g/l, tỷ lệ cấp giống 11,40% hàm lƣợng cao nấm men 4,13g/l Dựa vào phƣơng án đƣợc đƣa ra, xét theo điều kiện thí nghiệm phòng thí nghiệm, đƣa phƣơng án thí nghiệm nhƣ sau: hàm lƣợng đƣờng 11,00g/l, tỷ lệ cấp giống 11,50% hàm lƣợng cao nấm men 4,15g/l Hàm lƣợng axit lactic thu đƣợc 8,16g/l Kết có độ tƣơng thích cao so với kết kiểm tra thực nghiệm đƣợc thể hình 3.18 Hình 3.18 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ƣu để sinh tổng hợp axit Tiến hành xây dựng biểu đồ thể hàm lƣợng axit từ phân lập tối ƣu yếu tố quy hoạch thực nghiệm chủng L plantarum S5, kết cho hình 3.18 59 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hình 3.19 Hàm lƣợng axit lactic thu đƣợc điều kiện nuôi cấy L plantarum S5 Từ hình 3.18, thấy rõ thay đổi hàm lƣợng axit lactic trƣớc sau tối ƣu Ta thấy chủng L plantarum S5 thích hợp phát triển nhiệt độ cao, thời gian sinh trƣởng dài Sau khảo sát yếu tố tối ƣu quy hoạch thực nghiệm để xác định tác động đồng thời yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh tổng hợp axit lactic chủng L plantarum S5 thu đƣợc hàm lƣợng cao 6,66 g/l 8,16 g/l Nhƣ chủng L plantarum S5 đƣợc tiến hành lên men sinh tổng hợp axit điều kiện: nhiệt độ 37οC; pH 6; nồng độ đƣờng 11 g/l, tỷ lệ cấp giống 11,4% hàm lƣợng cao nấm men 4,13g/l 3.6 Động học trình lên men tổng hợp axit lactic chủng L plantarum S5 điều kiện tối ƣu Sau tiến hành kiểm tra độ tƣơng thích thực nghiệm trình sinh tổng hợp axit kết cho thấy có sai khác nhỏ, tiến hành xác định động thái trình lên men tổng hợp axit lactic chủng L plantarum S5 Trong trình lên men gián đoạn theo mẻ chất dinh dƣỡng không đƣợc bổ sung không thu nhận sản phẩm trao đổi chất Nên sinh trƣởng, phát triển quần thể vi 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC khuẩn bị gián đoạn, tuân theo quy luật bắt buộc qua giai đoạn: pha lag (pha thích ứng), pha log (phát triển lũy tiến), pha cân pha suy vong Đối với trình lên men sinh tổng hợp axit, mẫu L plantarum S5 đƣợc lên men môi trƣờng: YE – cellobiose dịch thể có hàm lƣợng cellobiose 11 g/L, pH = 6; cấp giống 11,4% hàm lƣợng cao nấm men 4,13g/l Ta đem khử trùng 110oC 30 phút atm, nuôi tĩnh 37 oC Tiến hành nuôi 168 giờ, sau 24 tiến hành lấy mẫu xác định khối lƣợng sinh khối ƣớt hàm lƣợng axit Kết đƣợc biểu diễn hình 3.20 phụ lục P7 Hình 3.20 Động thái trình tổng hợp axit lactic Kết cho thấy, pH dịch lên men giảm dần theo thời gian độ đục tăng, tƣơng ứng với tăng lên hàm lƣợng axit sinh dịch nuôi Tiến hành xác định hàm lƣợng axit mẫu chuẩn độ NaOH 0,05N sau 120 đạt 8,16g/l Từ kết nhận thấy thời điểm thích hợp để thu lƣợng axit lactic lớn cuối pha log, đầu pha cân (ngày thứ 5) trình sinh trƣởng phát triển mẫu L plantarum S5 61 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu, ta rút đƣợc kết luận sau: • Từ mẫu sản phẩm lên men mẫu bã thải dong giềng phân lập đƣợc 23 chủng vi sinh vật • Tuyển chọn: chọn đƣơc chủng dựa vào phƣơng pháp tuyển chọn ta chọn đƣợc chủng S5 sinh tổng hợp axit lactic cao 5,13g/l • Định tên 16S rRNA chủng S5 có độ tƣơng đồng 99% với L plantarum strain S7 Chủng S5 gọi L plantarum S5 • Khảo sát yếu tố: điều kiện nuôi chủng L plantarum S5 t° 37°C, pH 6, hàm lƣợng đƣờng 10g/l, tỷ lệ cấp giống 10%, hàm lƣợng cao nấm men 3g/l sau 120 thu đƣợc hàm lƣợng axit lactic 6,66g/l • Bằng qui hoạch thực nghiệm tối ƣu yếu tố: hàm lƣợng đƣờng 11g/l, tỷ lệ giống 11,5%, hàm lƣợng cao nấm men 4,13g/l sau 120 hàm lƣợng axit lactic thu đƣợc 8,16g/l 4.2 Kiến nghị Từ nghiên cứu này, em bƣớc đầu đạt đƣợt thành việc tìm chủng vi khuẩn có tính ứng dụng lên men tạo lactic từ cellobiose Em mong muốn đề tài đƣợc tiếp tục đƣợc phát triển thời gian tới nhằm hƣớng tới ứng dụng thực tế • Tiếp tục khảo sát thêm điều kiện nuôi chủng S5 tìm điều kiện tối ƣu cho chủng sinh trƣởng phát triển tốt mang lại lợi ích kinh tế • Tiến hành lên men quy mô lớn với chất dịch thủy phân thực vật, đặc biệt từ rơm rạ Sử dụng chủng S5 sản xuất axit lactic, nâng cao hiệu suất trình lên men áp dụng vào thực tế 62 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Việt Anh, (2010), Nghiên cứu công nghệ thiết bị sản xuất chế phẩm vi sinh vật ứng dụng sản xuất thực phẩm lên men truyền thống kiểu công nghiệp, Viện công nghiệp thực phẩm Kiều Hữu Ảnh, (1999), Giáo trình vi sinh vật công nghiệp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Kiều Hữu Ảnh, (2010), Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm, Nhà xuất giáo dục Việt Nam Nguyễn Ngọc Bích, (2003), Kỹ thuật cellulose giấy, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Cảnh Cửu, Nguyễn Chung, (1983), Cách làm tương, chao, nước chấm, Nhà xuất TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục Quách Đính, Nguyễn Văn Tiếp, Nguyễn Văn Thoa, (1996), Công nghệ sau thu hoạch chế biến rau quả, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lƣợng, (2002) Công nghệ vi sinh, tập 2, Vi sinh vật công nghiệp, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết, (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm Vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, trang 72-73, 414-434, 450-461 10 Phan Thanh Tâm, (2008), Nghiên cứu số giải pháp sinh học công nghệ sản xuất nem chua, Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa Hà Nội 11 Khuất Hữu Thanh, (2006), Kỹ thuật gen: Nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật 12 Nguyễn Văn Thoa, Nguyễn Văn Tiếp, Quách Đính, (1986), Kỹ thuật bảo quản chế biến rau quả, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 63 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC 13 Trần Linh Thƣớc, (2012), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục Việt Nam 14 Lê Thị Hồng Tuyết, (2004), Nghiên cứu Bacteriocin sản xuất Lactobacilluss acidophilus NRRL B-2092, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Adsul M, Khire J, Bastawde K, Gokhale D, (2007), Production of lactic acid from cellobiose and cellotriose by Lactobacillus delbrueckii mutant Uc-3, Appl Environ Microbiol, 73: 5055–5057 16 Alfred D French, Glenn P Johnson, (2004), Advanced conformational energy surfaces for cellobiose, Kluwer Academic Publishers, 11: 449-462 17 Alfred D French, Glenn P Johnson, (2006), Quantum mechanics studies of cellobiose conformats, NRC Research Press, 84: 603-612 18 Bevilacqua A E., Califano A N, (1989), Determination of organic acids in dairy products by high performance liquid chromatography, J Food Sci, 54: 1076-1079 19 Charles E.Wyman, (1996), Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor and Francis, 119-285 20 Chris H., Paul V., Raj A., Badrinath J., Dhiraj G and Peter M M., (2015), Isolation and Taxonomic Identity of Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria from Retail Foods and Animal Sources, Microorganisms, 3(1): 80-93 21 Datta, R., et al (1995), Technological and economic potential of poly(lactic acid) and lactic acid derivatives, FEMS Microbiology Reviews, 16(2-30): 221-231 22 D S Joshi, M S Singhvi, J M Khire, D V Gokhale, (2010), Strain improvement of Lactobacillus lactis for D-lactic acid production, Original Research Paper, 32: 517–520 23 George W Huber, Juben N Chheda, Christopher J Barrett, James A Dumesic, (2005), Production of Liquid Alkanes by Aqueous-Phase Processing of BiomassDerived Carbohydrates, Science 308: 1446-1450 64 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC 24 Gina L Strati, Julious L Willet, Frank A Momany, (2002), Ab initio computational study of β-cellobiose conformers using B3LYP/6-311++G, Carbohydrate Research 337: 1833-1849 25 Hetti Palonen, (2004), Role of lignin enzymatic hydrolysis of lignocelluloase, VVT Biotechnology, 11-39 26 Hui H Y, and Khachatourians G George, (1994), Food Biotechnology Microorganisms, 131-145, 249-254 27 Jay M James, (1996), Modern Food Microbiology, Fifth edition, ITP International Thomson Publishing, 131-145 28 Linghao Zhong , James F Matthews, Peter I Hansen, Michael F Crowley, Joseph M Cleary, Ross C Walker, Mark R Nimlos , Charles L Brooks III, William S Adney, Michael E Himmel, John W Brady, (2009), Computational simulations of the Trichoderma reesei cellobiohydrolase I acting on microcrystalline cellulose Ib: the enzyme–substrate complex, Carbohydrate Research 344: 1984-1992 29 Luis Petersen, Albert Arde`vol, Carme Rovira and Peter J Reilly (2009) Mechanism of Cellulose Hydrolysis by Inverting GH8 Endoglucanases: A QM/MM Metadynamics Study, American Chemical Society Published 113: 7331– 7339 30 Makiko Koyama, William Helbert, Tomoya Imai, Junji Sugiyama and Bernard Henrissat (1997), Parallel-up structure evidences the molecular directionality during biosynthesis of bacterial cellulose, The national academy of sciences of the USA, 94: 9091-9095 31 M A Abdel-Rahman, Y Tashiro, T Zendo, K Shibata, K Sonomoto, (2011), Isolation and characterisation of lactic acid bacterium for effective fermentation of cellobiose into optically pure homo L-(+)-lactic acid, Appl Microbiol Biotechnol, 89: 1039–1049 32 Mohamed Ali Abdel-Rahman, Yukihiro Tashiro, Kenji Sonomoto, (2011), Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: Overview and limits, Journal of Biotechnology, 156: 286-301 65 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC 33 Niju Narayanan, Pradip K Roychoudhury, Aradhana Srivastava, (2004), L(+)lactic acid fermentation and its product polymerization, Electronic Journal of Biotechnology ISSN, 17: 0717-3458 34 Okano K, Zhang Q, Yoshida S, Tanaka T, Ogino C, Fukuda H, Kondo A, (2010), D-lactic acid production from cellooligosaccharides and β-glucan using L-LDH gene-deficient and endoglucanasesecreting Lactobacillus plantarum, Appl Microbiol Biotechnol 85: 643–650 35 Pelczar J Michael, Chan E C S Jr, and Krieg R Noel, (1993), Microbiology concepts and application, 873-874 36 Saga, B C., (2003), Hemicellulose bioconversion, J Ind Microbiol Biotechnol 30: 279 – 291 37 Stanier Y Roger, Doudoroff Michael, and Adelberg A Edward, (1957), The Microbial World, 225-229 38 Susana Romero-Garcia, Claudia Hernández-Bustos, Enrique Merino, Guillermo Gosset and Alfredo Martinez, (2009), Homolactic fermentation from glucose and cellobiose using Bacillus subtilis, Microbial Cell Factories, 8:23: 1-8 39 Gina L Strati, Julious L Willet, Frank A Momany, (2002), Ab initio computational study of β-cellobiose conformers using B3LYP/6-311++G, Carbohydrate Research 337: 1833-1849 40 Yue Z, Bin W, Baixu Y, Peiji G, (2004), Mechanism of cellobiose inhibition in cellulose hydrolysis by cellobiohydrolase Science in China Ser 47: 18-24 41 Zin-Eddine Dadach and Serge Kallaguine (1993), Acid Hydrolysis of Cellulose Part I Experimental Kinetic Analysis, The Canadian Journal of Chemical Engineering 71: 880-891 TRANG WEB 42 http:// www Eereenergy.gov.biomass 43 http:// www Triplepundit.com 44 http://vietsciences.free.fr/ 66 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHỤ LỤC Kết giải trình tự DNA chủng S5 CTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGAT TTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCA GAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTG GACCGCATGGTCCAAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTC CCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATAC GTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCA AACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTG ATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTT GTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGCTCAGGTATTGACGGTATTTAA CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG CAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAA GTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGA AACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCG TAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTG ACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGC TGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT TCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAA GAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGtgcatggttgtcgtcagctcgt gtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactg ccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggat ggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacat gaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccat gagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaag Hình P1: Kết giải trình tự Nucleotit chủng S5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả tạo axit lactic chủng S5 Bảng P2: Kết đo hàm lƣợng axit lactic theo ngày khảo sát yếu tố nhiệt độ (g/l) Nhiệt độ o C Hàm lƣợng axit sinh sau 24 nuôi cấy 24 48 72 96 120 144 67 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC 25 30 35 37 40 45 CÔNG NGHỆ SINH HỌC 0.63 1.35 2.16 2.07 2.7 2.52 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.052 0.03 0.03 0.03 0.079 0.99 1.89 2.7 3.15 3.87 3.69 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.05 1.26 2.16 3.15 3.33 4.5 4.05 ± ± ± ± ± ± 0.051 0.03 0.053 0.1 0.06 0.056 1.53 2.61 3.96 4.5 5.13 4.32 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.055 0.02 0.032 0.041 0.03 1.17 2.25 3.06 3.42 4.14 3.6 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.031 0.062 0.038 0.052 0.03 0.81 1.62 2.25 2.44 3.06 3.06 ± ± ± ± ± ± 0.051 0.06 0.03 0.035 0.06 0.041 Bảng P3 Kết đo hàm lƣợng axit lactic theo ngày khảo sát yếu tố pH (g/l) Thời gian Hàm lƣợng axit sinh khoảng pH khác (g/l) 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 68 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC 24 48 72 96 120 144 CÔNG NGHỆ SINH HỌC 0.72 1.08 1.35 1.44 1.17 0.99 0.81 ± ± ± ± ± ± ± 0.052 0.08 0.051 0.079 0.11 0.03 0.05 1.17 2.16 2.34 2.79 2.52 2.25 1.89 ± ± ± ± ± ± ± 0.03 0.052 0.06 0.078 0.072 0.083 0.051 2.07 3.15 3.87 4.23 3.24 3.6 2.79 ± ± ± ± ± ± ± 0.03 0.052 0.079 0.084 0.03 0.086 0.052 2.79 3.87 4.41 4.77 4.41 3.78 2.87 ± ± ± ± ± ± ± 0.03 0.079 0.052 0.051 0.081 0.079 0.049 2.97 3.87 4.95 5.67 4.68 4.5 3.15 ± ± ± ± ± ± ± 0.053 0.06 0.11 0.079 0.03 0.078 0.079 2.88 3.69 4.41 5.13 4.5 4.05 3.24 ± ± ± ± ± ± ± 0.03 0.051 0.079 0.1 0.03 0.076 0.03 Bảng P4: Kết đo hàm lƣợng axit lactic theo ngày khảo sát yếu tố cellobiose (g/l) Thời Hàm lƣợng axit sinh hàm lƣợng đƣờng thay đổi (g/l) 69 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC gian 10 15 20 25 30 24 0.72 1.71 1.89 1.98 2.07 2.16 ± ± ± ± ± ± 0.052 0.079 0.03 0.06 0.057 0.09 1.26 3.15 3.6 3.69 3.51 3.06 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.052 0.079 0.058 0.03 0.05 2.07 4.5 5.13 5.31 5.31 4.05 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.079 0.082 0.056 0.05 0.061 3.24 5.04 5.76 6.12 6.39 5.13 ± ± ± ± ± ± 0.077 0.052 0.079 0.083 0.1 0.052 3.06 6.21 7.11 7.02 6.48 4.95 ± ± ± ± ± ± 0.079 0.052 0.076 0.06 0.056 0.06 2.34 5.31 6.21 6.03 5.94 5.04 ± ± ± ± ± ± 0.052 0.06 0.064 0.05 0.03 0.051 48 72 96 120 144 Bảng P5: Kết đo hàm lƣợng axit lactic theo ngày khảo sát yếu tố tỷ lệ cấp giống (g/l) 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Thời gian 24 48 72 96 120 144 CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hàm lƣợng axit sinh tỷ lệ giống thay đổi (g/l) 10 15 20 25 30 1.48 1.89 1.89 1.98 1.98 1.98 ± ± ± ± ± ± 0.06 0.079 0.03 0.052 0.03 0.03 2.34 3.33 3.42 3.51 3.6 1.8 ± ± ± ± ± ± 0.052 0.03 0.06 0.05 0.056 0.052 2.79 4.86 4.95 5.04 4.77 2.07 ± ± ± ± ± ± 0.079 0.03 0.052 0.079 0.086 0.09 2.34 5.4 5.4 5.49 5.4 2.79 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.079 0.052 0.1 0.06 0.03 1.89 6.48 5.67 5.31 5.22 2.34 ± ± ± ± ± ± 0.051 0.052 0.08 0.09 0.079 0.03 1.17 5.76 4.95 4.95 4.86 1.98 ± ± ± ± ± ± 0.12 0.03 0.052 0.051 0.079 0.08 Bảng P6: Kết đo hàm lƣợng axit lactic theo ngày khảo sát yếu tố cao nấm men (g/l) 71 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thời gian Hàm lƣợng axit sinh hàm lƣợng cao nấm men thay đổi (g/l) 12 15 24 0.72 1.89 2.61 2.52 2.88 3.15 ± ± ± ± ± ± 0.052 0.09 0.051 0.06 0.074 0.03 1.08 3.42 5.04 4.23 4.32 4.77 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.052 0.03 0.05 0.079 0.083 1.35 5.04 5.94 5.22 5.58 6.12 ± ± ± ± ± ± 0.052 0.09 0.03 0.13 0.079 0.082 1.71 5.4 6.48 6.57 6.75 6.03 ± ± ± ± ± ± 0.079 0.052 0.06 0.071 0.079 0.08 1.26 6.66 7.29 7.74 7.65 5.31 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.052 0.073 0.06 0.05 0.031 0.99 6.21 6.66 7.47 6.84 5.4 ± ± ± ± ± ± 0.051 0.06 0.052 0.079 0.081 0.05 48 72 96 120 144 Bảng P7: Kết đo OD, pH hàm lƣợng axit lactic theo ngày (g/l) 72 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Thời gian CÔNG NGHỆ SINH HỌC 24 48 72 96 120 144 168 Hàm lƣợng axit lactic 2.21 3.82 6.02 7.15 8.16 7.82 6.97 OD 0.412 0.793 1.34 1.651 1.908 1.922 1.931 pH 5.01 4.12 3.84 3.62 3.41 3.34 3.21 73 ... chung vi khuẩn lên men axit lactic 19 1.4.3 Một số chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ cellobiose 21 1.5 1.4.3.1 Chủng vi khuẩn phân lập từ tự nhiên 21 1.4.3.2 Chủng vi khuẩn. .. 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ cellobiose 38 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men thu axit lactic cao 39 3.2.1 Định tính axit lactic 39 3.2.2 Tuyển chọn. .. nghiên cứu để tận dụng nguồn lƣợng sẵn có Vì vậy, em tiến hành đề tài Phân lập, tuyển chọn tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ cellobiose’’ LUẬN VĂN THẠC SĨ