Luận văn thạc sĩ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ THỊ THU HÀ VŨ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN ETHANOL TỪ ĐƯỜNG C5 VÀ C6 CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS TRƯƠNG QUỐC PHONG 2009 - 2011 HÀ NỘI - 2011 i Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trương Quốc Phong, phòng Hóa sinh Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình bảo, truyền thụ cho kiến thức lòng say mê khoa học suốt trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm truyền đạt cho kiến thức khoa học vô bổ ích suốt trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng thí nghiệm thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ hướng dẫn gặp khó khăn làm thí nghiệm Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân, người động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội ngày 30/03/2011 Học viên: Vũ Thị Thu Hà ii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu riêng tôi, không chép Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các thông tin, tài liệu trình bày luận văn ghi rõ nguồn gốc Vũ Thị Thu Hà iii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ MỤC LỤC Mục lục …………………………………………………………………………… iv Bảng thuật ngữ viết tắt …………………………………………………………… vii Danh mục bảng sử dụng luận văn ……………………………………… viii Danh mục hình vẽ sử dụng luận văn …………………………………… ix Mở đầu …………………………………………………………………………… Phần I : Tổng quan tài liệu ……………………………………………………… 1.1 Tình hình sản xuất ethanol giới Việt Nam……………………… 1.1.1 Tình hình sản xuất ethanol giới ………………………………… 1.1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol Việt Nam …………………… 1.2 Các vấn đề gặp phải sản xuất bioethanol ……………………………… 1.2.1 Sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu hệ I …………………………… 1.2.2 Sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu hệ II……………………… 1.3 Tìm kiếm chủng vi sinh vật có khả sử dụng nguồn cacbon đa dạng có khả lên men tạo thành ethanol 1.4 Phát triển chủng vi sinh vật có khả lên men đồng thời hai loại đường C5 C6 1.4.1 Vi khuẩn Zymomonas mobilis tái tổ hợp cho trình lên men ethanol … 11 1.4.2 Vi khuẩn Klebsiella oxytoca tái tổ hợp cho trình lên men ethanol …… 13 1.4.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp cho trình lên men 13 ethanol 1.4.4 Vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp cho trình lên men ethanol ……… 15 1.5 Đặc điểm tính chất hóa sinh alcohol dehydrogenase (ADH) 16 pyruvate decacboxylase (PDC) 1.5.1 Nguồn gốc vai trò ADH PDC tự nhiên …………………… 16 1.5.1.1 Lịch sử nghiên cứu ……………………………………………………… 16 1.5.1.2 Nguồn gốc vai trò enzyme ADH ………………………………… 17 1.5.2 Nguồn gốc vai trò enzyme PDC …………………………………… 18 iv Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 1.5.3 Đặc điểm cấu trúc ADH II PDC …………………………………… 20 1.5.3.1 Đặc điểm cấu trúc enzyme ADH2 ………………………………… 20 1.5.3.2 Đặc điểm cấu trúc enzyme PDC …………………………………… 21 1.5.3.3.Vai trò enzyme ADH II PDC đường sinh tổng hợp 23 ethanol Phần II: Vật Liệu phương pháp nghiên cứu…………………………………… 26 2.1 Vật liệu ……………………………………………………………………… 26 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật …………………………………………………… 26 2.1.2 Hóa chất …………………………………………………………………… 26 2.1.3 Trang thiết bị ……………………………………………………………… 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………… 28 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật …………………………………………………… 28 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử …………………………………………… 29 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số…………………………………… 29 2.2.2.2 Phương pháp nhân gen đặc hiệu (Polymerase chain reaction-PCR) …… 30 2.2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 31 2.2.2.4 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 31 2.2.2.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR ………………………………… 32 2.2.2.6 Phương pháp nối ghép gen 32 2.2.2.7 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn 32 2.2.2.8 Phương pháp tách chiết plasmid ………………………………………… 33 2.3 Phương pháp tin sinh ………………………………………………………… 34 2.4 Phương pháp lên men ethanol ……………………………………………… 35 2.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng ethanol dịch lên men …………… 36 Phần III: Kết thảo luận …………………………………………………… 37 v Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 3.1 Tách chiết DNA tổng số 37 3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu gen pdc adhB Zymomonas mobilis …………… 39 3.3 Tách dòng gen mã hóa hai enzyme alcohol dehydrogenase II pyruvate 41 decarboxylase từ Zymomonas mobilis 3.3.1 Khuếch đại gen mã hóa enzyme PDC ADH II 41 3.3.2 Kết cắt nối ghép gen PDC ADH II vào vector …………… 42 3.3.3 Biến nạp sàng lọc dòng tái tổ hợp ……………………………………… 45 3.4 Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli tái tổ hợp mang gen mã hóa PDC 54 ADH II 3.4.1 Thiết kế vector biểu mang gen pdc adhB ………………………… 54 3.4.2 Tạo chủng E coli tái tô hợp mang vector biểu chứa hai gen pdc 57 adhB 3.4.3 Nghiên cứu biểu enzyme pyruvate decarboxylase alcohol 60 dehydrogenase II chủng chủ 3.4.3.1 Đánh giá khả sinh trưởng chủng tái tổ hợp 60 3.4.3.2 Đánh giá khả tổng hợp PDC ADH II môi trường lên men 62 chứa đường glucose xylose Kết luận kiến nghị 65 Tài liệu tham khảo 66 vi Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ BẢNG THUẬT NGỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ DNA Deoxyribonucleic acid Amp Ampiclin bp dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid EtBr Da Dalton LB Môi trường Luria Broth OD Optical Density (mật độ quang học) 10 PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng Base pair (cặp bazơ nitơ) Ethidium Bromide chuỗi trùng hợp) 11 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 12 TAE Tris- Acetate-EDTA 13 TE Tris-EDTA 14 v/ph Vòng/phút 15 PDC (pdc) Pyruvate decacboxylase 16 ADH II; ADH2; Alcohol dehydrogenase adhB 17 PDCf/ PDCr Cặp mồi xuôi/ ngược PDC 18 ADHf/ADHr Cặp mồi xuôi/ ngược ADH vii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Sự đa dạng thành phần đường đơn trình thủy phân cellulose từ nguyên liệu gỗ Bảng 1.2 Những đặc điểm quan trọng vi sinh vật lựa chọn sản xuất ethanol sinh học Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng 26 Bảng 3.1 Hai trình tự mồi đặc hiệu gen pdc adhB …………………… 40 Bảng 3.2 Kết blast trình tự đoạn gen pdc tách dòng ………… 50 Bảng 3.3 Kết blast trình tự đoạn gen adhB tách dòng ………… 53 viii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Hướng tiếp cận tạo sinh vật tái tổ hợp chuyển hóa lignocellulose 11 thành ethanol Hình 1.2 Con đường chuyển hóa pentose, arabinose, glucose thành ethanol… 12 Hình 1.3 Các đường chuyển hóa xylose ………………………………… 14 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cofactor NAD+ NADH………………………… 18 Hình 1.5 Mô hình cấu trúc không gian tetramer ADH2 ………………… 20 Hình 1.6 Trung tâm hoạt động ADH2 …………………………………… 21 Hình 1.7 Mô hình cấu trúc không gian enzyme PDC …………………… 22 Hình 1.8 Cấu trúc trung tâm hoạt động PDC …………………………… 23 Hình 1.9 Con đường chuyển hóa đường C5 C6 thành ethanol …………… 24 Hình 3.1 Phổ điện di DNA tổng số vi khuẩn Zymomonas mobilis 38 Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen rDNA 16S ……… 39 Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm PCR gen PDC ADH II 41 Hình 3.4 Sơ đồ nối ghép gen đích vào vector để tạo vector tái tổ hợp ……… 43 Hình 3.5 Kết cắt kiểm tra vector pTAC-MAT enzyme giới hạn 44 Hình 3.6 Kết cắt kiểm tra sản phẩm PCR gen pyruvate decarboxylase 45 gen alcohol dehydrogenase II enzyme giới hạn Hình 3.7 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH10b … 46 Hình 3.8 Phổ điện di plasmid tách từ 10 khuẩn lạc biến nạp vector tái tổ 47 hợp mang gen mã hóa PDC Hình 3.9 Điện di sản phẩm cắt kiểm tra DNA plasmid enzyme giới hạn 48 PstI Hình 3.10 Phổ điện di plasmid tách từ 10 khuẩn lạc biến nạp vector tái 51 tổ hợp mang gen mã hóa ADH II Hình 3.11 Điện di sản phẩm cắt kiểm tra DNA plasmid enzyme giới hạn 52 Pst I Hình 3.12 Kết biến nạp sản phẩm lai ghép hai gen pdc adh II với 54 ix Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ vector vào E coli DH10b Hình 3.13 Phổ điện di plasmid tách từ 13 dòng khác …………………… 55 Hình 3.14 Kết kiểm tra dòng tái tổ hợp PCR ……………………… 56 Hình 3.15 Kết cắt kiểm tra dòng 13 (C13) enzyme giới hạn ……… 57 Hình 3.16 Biến nạp vector tái tổ hợp pHBB1807 vào E coli ATCC11303 58 Hình 3.17 Phổ điện di plasmid tách từ dòng E coli ATCC11303 sau 58 biến nạp pHBB1807 Hình 3.18 Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng plasmid làm khuôn cặp mồi 59 với mồi xuôi PDCf mồi ngược ADHr Hình 3.19 Phổ điện di cắt enzyme giới hạn kiểm tra ………………………… 60 Hình 3.20 Động học sinh trưởng chủng E coli ATCC 11303 61 Hình 3.21 Khả sinh ethanol chủng E coli tái tổ hợp 63   x Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ L Hình 3.19 Phổ điện di cắt enzyme giới hạn kiểm tra L- thang DNA chuẩn 500bp (Invitrogen), 1-pTAC-MAT/Bgl II, 2-pTAC-MAT/Pst I, 3-C13/Pst I, 4-C13/Bgl II 3.4.3 Nghiên cứu biểu enzyme pyruvate decarboxylase alcohol dehydrogenase II chủng chủ 3.4.3.1 Đánh giá khả sinh trưởng chủng tái tổ hợp Để đánh giá xem plasmid tái tổ hợp có ảnh hưởng đến chủng chủ sau biến nạp, tiến hành biến nạp plasmid không mang gen, plasmid mang gen vào chủng chủ nghiên cứu Tốc độ sinh trưởng hai chủng biến nạp hai loại plasmid khác chủng không biến nạp plasmid nghiên cứu điều kiện môi trường nuôi cấy giống Kết mức độ sinh trưởng chủng nghiên cứu thể hình 3.20 60 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ Hình 3.20 Động học sinh trưởng chủng E coli ATCC 11303 không mang plasmid (native), mang plasmid đối chứng (plasmid+) mang plasmid tái tổ hợp (rC13) Kết cho thấy tốc độ sinh trưởng chủng nghiên cứu bao gồm chủng gốc (E coli ATCC 11303), chủng E coli 11303 biến nạp plasmid đối chứng pTACMAT, chủng E coli 11303 biến nạp plasmid pTAC-MAT + pdc/adhB tương đối giống Mức độ sinh trưởng tăng lên mạnh sau 24 nuôi cấy sau tăng tăng chậm lại sau 48 ngày Điều chứng tỏ tốc độ sinh trưởng cực đại đạt khoảng sau 24 nuôi cấy chủng nghiên cứu Kết plasmid ngoại lai biến nạp vào chủng chủ không ảnh hưởng đến khả sinh trưởng chủng chủ Ngoài thấy hai gen PDC ADH II đưa vào chủng chủ không làm thay đổi khẳ sống sót mức độ sinh trưởng chủng chủ Do sử dụng chủng tái tổ hợp để tiến hành nghiên cứu lên men 61 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 3.4.3.2 Đánh giá khả tổng hợp PDC ADH II môi trường lên men chứa đường glucose xylose Do nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp phục vụ cho trình lên men ethanol tiến hành đánh giá biểu hai enzyme pyruvate decarboxlyase alcohol dehydrogenase II chủng tái tổ hợp thông qua khả sinh ethanol chúng chủng đối chứng mang plamsid không mang gen Chúng tiến hành lên men chủng E coli ATCC11303 mang plasmid pTACMAT (đối chứng) mang plasmid tái tổ hợp (rC13) Điều kiện lên men mô tả phần phương pháp nghiên cứu Môi trường lên men bổ sung đường glucose (hoặc đường xylose) Quá trình lên men thực bình tam giác dung tích 100 ml có gắn xylanh giúp cho khí thoát Trong trình lên men, 24 lại tiến hành lấy mẫu đo mật độ hấp thụ quang bước sóng 550 nm, sau dịch nuôi ly tâm 6000 vòng/phút phút để tách sinh khối thu hồi dịch lên men để xác ethanol Kết cho thấy mức độ sinh trưởng hai chủng nghiên cứu điều kiện lên men tương đối giống Với môi trường lên men chứa đường glucose, mức độ sinh tưởng tăng lên sau 24 nuôi cấy đạt cực đại sau khoảng 48 Tốc độ sinh trưởng không tăng có xu hướng giảm ngày Với môi trường lên men chứa đường xylose, mức độ sinh trưởng tăng lên sau 24 nuôi cấy đạt cực đại sau khoảng 72 Kết hoàn toàn phù hợp với công bố trước Alterthum cộng 1989 (Alterthum et al 1989) Từ kết thấy trình sinh trưởng môi trường lên men có bổ sung 12% glucose (hay 8% xylose) đệm hóa đệm phosphate 0.2 M, pH = 7.0 có thay đổi so với nuôi cấy môi trường Luria broth Sự thay đổi chủ yếu giai đoạn – 48 với glucose – 72 với xylose Trong môi trường lên men chủng nghiên cứu sinh trưởng tương đối chậm đạt cực đại sau 48 (glucose) 72 (xylose) Hàm lượng cồn xác định từ dịch lên men thời điểm khác hai chủng điều kiện phương pháp phản ứng màu Phương pháp xác định 62 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ cồn tóm tắt sau: dịch lên men trộn với dung môi TBP (tri-n-butyl phosphate) theo tỷ lệ 1:1, sau tách lấy pha TBP chứa ethanol đem phản ứng với thuốc thử dichromate Thu hồi pha dichromate xác định mật độ quang bước sóng 595nm Các thí nghiệm xác định ethanol lặp lại hai lần Kết xác định ethanol dịch lên men thể hình 3.21 A B Hình 3.21 Khả sinh ethanol chủng E coli tái tổ hợp môi trường bổ sung glucose (A) xylose (B) ĐC (đối chứng, chủng E coli 11303 mang plasmid pTAC-MAT), rC13 (chủng E coli 11303 mang plasmid pTAC-MAT + pdc/adh) Kết cho thấy ethanol tạo dịch lên men chủng tái tổ hợp, trong dịch lên men chủng chủ tương tự không mang gen pdc adhB không thấy xuất ethanol Kết enzyme pyruvate 63 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ decarboxylase alcohol dehydrogenase xuất chủng E coli tái tổ hợp, giúp chuyển hóa pyruvate thành ethanol Thông qua kết nói hai enzyme pyruvate decarboxylase alcohol dehydrogenase II biểu chủng chủ nghiên cứu 64 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tách dòng thành công hai gen mã hóa pyruvate decarboxylase alcohol dehydrogenase II nguồn gốc Zymomonas mobilis hệ vector pTAC-MAT Xác định trình tự hai đoạn gen tương ứng 1.7 1.2 kb Đã tạo vector biểu tái tổ hợp mang hai gen pdc adhB, chủng chủ biểu E coli ATCC11303 mang plasmid tái tổ hợp Đã kiểm tra biểu hai enzyme PDC ADHII chủng chủ E coli tái tổ hợp thông qua lên men ethanol sơ kiểm tra khả lên men chủng tái tổ hợp hai nguồn carbon c5 (xylose) C6 (glucose) KIẾN NGHỊ: - Nghiên cứu tối ưu hóa lên men ethanol sử dụng chủng E coli rC13 tái tổ hợp - Tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả lên men ethanol chủng E coli rC13 tái tổ hợp nguồn carbon khác nhau, đặc biệt nguồn carbon từ dịch thủy phân sinh khối thực vật 65 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Alterthum F and Ingram L O., (1989) Efficient ethanol production from glucose, lactose, and xylose by recombinant Escherichia coli, Applied and environmental microbiology 55(8), 1943-48 An H., Scopes R.K., Rodriguez M., Keshav K.F and Ingram L.O., (1991) Gel electrophoretic analysis of Zymomonas mobilis glycolytic and fermentative enzymes: Identification of alcohol dehydrogenase II as a stress protein, J Bacteriol., 173, 5975-82 Atkinson M., Eckermann G., and Lilley R., (1967) Inhibition of Alcohol Dehydrogenase from Yeast by Pyridine, Biochem J.104, 872 Auricchio F., Bruni C., (1969) The Role of Essential -SH Groups of Yeast Alcohol Dehydrogenase , Biochem Biophys Acta 185, 461 Baburina I., Dikdan G., Guo F., Tous G.I., Root B., Jordan F., (1998) Reactivity at the substrate activation site of yeast pyruvate decarboxylase: inhibition by distortion of domain interactions, Biochemistry 37 (5), 1245–55 Beall D.S., Otha K., Ingram L.O., (1991) Parametric Studies of Ethanol Production from Xylose and Other Sugars by Recombinant Escherichia coli Biotechnol Bioeng 38, 296-303 Bonnichse R., and Wassen A., (1948) Crystalline Alcohol Dehydrogenase from Horse Liver, Arch Biochem 18, 361 Bothast R.J., Nichols N.N., Dien B.S., (1999) Fermentations with new recombinant organisms, Biotechnol Prog 15, 867-75 Bringer-Meyer, S., Schimz K.-L & Sahm H., (1986) Pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis Isolation and partial characterization, Arch Microbiol 146, 105-110 10 Brock T.D., Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J (1994) Biology of microorganisms Prentice-Hall Intern Inc Englewood Cliffs, New Jersey, 909 66 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 11 Candy J.M., & Duggleby R.G., (1998) Structure and properties of pyruvate decarboxylase and sitedirected mutagenesis of the Zymomonas mobilis enzyme, Biochem Biophys Acta 1385, 323-38 12 Canettier E.V., Rocha G.J.M., Carvalho J.A and Silva J.B.A., (2007) Optimization of acid hydrolysis from the hemicellulosic fraction of Eucalyptus grandis residue using response surface methodology Bioresource Tech 98, 422-28 13 Conway T., Osman L.O., (1987) Promoter Y.A., Konnan and nucleotide J.I., Hoffmann sequences E.M of & Ingram the Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase, J Bacteriol 169, 949-54 14 Deanda K., Zhang M., Eddy C., Picataggio S., (1996) Development of an arabinose fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl Environ Microbiol 62, 4465-70 15 Deley J & Schell J., (1959) Studies on the metabolism of Acetobacter peroqdans II The enzymic mechanism of lactate metabolism, Biochem biophys Acta, 35, 154 16 Demain, A., (2005) Cellulase, Clostridia, and Ethanol, Microbiol Mol Biol Rev 69, 124–54 17 Demirbas A., (2005) Bioethanol from Cellulosic Materials: A Renewable Motor Fuel from Biomass, Energy Sources, 27, 327- 37 18 Diefenbach R.J., & Duggleby R.G., (1991) Pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis Structure and re-activation of apoenzyme by the cofactors thiamin diphosphate and magnesium ion, Biochem J 276, 439-45 19 Dien B.S., Cotta M.A., & Jeffries T.W., (2003) Bacteria engineered for fuel ethanol production: current status, Appl Microbiol Biotechnol 63, 258–66 20 Dobritzsch D., König S., Schneider G & Lu G., (1998) High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis Implications for substrate activation in pyruvate decarboxylases”, J Biol Chem 273, 20196-204 21 Doelle M.B., Millichip R.J., Doelle H.W., (1989) Production of ethanol from corn using inoculum cascading of Zymomonas mobilis, Process Biochem 24, 137-40 67 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 22 Dyda F., Furey W., Swaminathan S., Sax M., Farrenkopf B., Jordan F., (1993) Catalytic centers in the thiamin diphosphate dependent enzyme pyruvate decarboxylase at 2.4-A resolution, Biochemistry 32(24), 6165-70 23 Eliasson A., Christensson C., Wahlbom C.F., Hahn-Hägerdal B., (2000) Anaerobic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1, XYL2, and XKS1 in mineral medium chemostat cultures, Appl Environ Microbiol 66,3381-86 24 Erik G.B., Mikko H., Tore B., Tomas B., and Olle E., (2009) Molecular dynamics study of zinc binding to cysteines in a peptide mimic of the alcohol dehydrogenase structural zinc site", Phys Chem Chem Phys (PCCP) 11(6), 975–83 25 Gottschalk G., (1986) Bacterial metabolism, 2nd edn Springer, New York Berlin Heidelberg, p 237 26 Hahn-Hägerdal B., Pamment N., (2004) Microbial pentose metabolism, Appl Biochem Biotechnol 113-116, 1207-09 27 Hahn-Hägerdal B., Wahlbom C.F., Gardonyi M., van Zyl W.H., Cordero O.R.R., Jönsson L.J., (2001) Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose utilization, Adv Biochem Eng Biotechnol 73, 53-84 28 Hamelinck C.N., Hooijdonk G.V., Faai, A.P.C., (2005) Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term, Biomass and Bioenergy 28, 384-410 29 Haq A and Dawes E.A., (1971) Pyruvic Acid Metabolism and Ethanol Formation in Erwinia amylovora”, Journal of General Microbiology 68, 295-306 30 Hayes J., and Velick S., (1954) Yeast Alcohol Dehydrogenase: Molecular Weight, Coenzyme Binding and Reaction Equilibria, J Biol Chem 207, 225 31 Hellgren M., (2009) Enzymatic studies of alcohol dehydrogenase by a combination of in vitro and in silico methods, Ph.D thesis Stockholm, Sweden: Karolinska Institutet p.70 32 Herrera S., (2004) Industrial biotechnology - a chance at redemption, Nature Biotechnol 22, 671-75 68 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 33 Hoppner T.C & Doelle H.W (1983) Purification and kinetic characteristics of pyruvate decarboxylase and ethanol dehydrogenase from Zymomonas mobilis in relation to ethanol production, European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 17, 152-57 34 Ingram L.O., Conway T., Clark D.P., Sewell G.W., Preston J.F., (1987) Genetic engineering of ethanol production in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 53, 2420-25 35 Ingram L.O., Gomez P.F., Lai X., Moniruzzaman M., Wood B.E., Yomano L.P & York S W., (1998) Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol Bioeng 58, 204-14 36 Inui M., Kawaguchi H., Murakami S., Vertés A.A., Yukawa H., (2004) Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for fuel ethanol production under oxygen-deprivation conditions”, J Mol Microbiol Biotechnol, 8, 243-54 37 Jones D.T & Woods D.R., (1986) Acetone-butanol fermentation revisited Microbiological Reviews 50, 484-524 38 Karhumaa K., Sanchez R.G., Hahn-Hägerdal B., Grauslund M.F.G (2007) Comparison of the xylose reductase-xylitol dehydrogenase and the xylose isomerase pathways for xylose fermentation by recombinant S cerevisiae, Microbial Cell Factories, v.6 39 Keung W., Fong W., (1988) Guinea Pig Liver Alcohol Dehydrogenase: Isolation and Characterization of Two Distinct Classes of Isozymes, Comp Biochem Physiol 89, 85 40 Kim I.S., Barrow K.D., Rogers P.L (2000), Nuclear magnetic resonance studies of acetic acid inhibition of rec Zymomonas mobilis ZM4 (pZB5), Appl Biochem Biotechnol 84, 357- 70 41 King T.E., & Chendelin V.H., (1954) Oxidations in Acetobacter suboxydans, Biochem et Biophys Acta, 14, 108-16 69 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 42 Kirk L A., Doelle H W., (1992) The effect of potassium and chloride ions on the ethanolic fermentation of sucrose by Zymomonas mobilis 2716 Applied Microbiology Biotechnology 37, 88-93 43 Krull L H and Inglet G I (1980) Analysis of neutal carbohydrates in agricultural residues by gas-liquid chromatography J Agric Food Chem 28, 917-19 44 Larroy C., Fernández M., González E., Parés X., and Biosca J., (2002a) Characterization of the Saccharomyces cerevisiae YMR318C (ADH6) Gene Product as a Broad Specificity NADPH-Dependent Alcohol Dehydrogenase: Relevance in Aldehyde Reduction, Biochem J 361, 163 45 Larroy C., Parés X., and Biosca J (2002b) Characterization of a S cerevisiae NADP(H)-Dependent Alcohol Dehydrogenase (ADHVII), a Member of the Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Family” , Eur J Biochem 269, 5738 46 Lau M.W., Gunawan C., Balan V., Dale B (2010) Comparing the fermentation performance of Escherichia coli KO11, Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST) and Zymomonas mobilis AX101 for cellulosic ethanol production, Biotechnology for biofuels 3, 11 47 Leite A.R., Guimaraes W.V., Araujo E.F., Silva D.O (2000) Fermentation of sweet whey by recombinant Escherichia coli KO11, Brazilian Journal of Microbilogy 31, 212-15 48 Lertwattanasakul N., Sootsuwan K., Limtong S., Thanonkeo P., and Yamada M (2007), “Comparison of the Gene Expression Patterns of Alcohol Dehydrogenase Isozymes in the Thermotolerant Yeast Kluyveromyces marxianus and Their Physiological Functions” , Biosci Biotechnol Biochem 71, 1170 49 Lin Y., Tanaka S (2006) Ethanol fermentation from biomass resources: Current state and prospects, Appl Microbiol Biotechnol 69, 627-42 50 Lobell M., Crout D.H.G., (1996) Pyruvate Decarboxylase: A Molecular Modeling Study of Pyruvate Decarboxylation and Acyloin Formation, J Am Chem Soc 118 (8), 1867-73 70 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 51 Lowe S.E & Zeikus J.G., (1992) Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi”, J Gen Microbiol 138, 803-07 52 Lynd L.R., and Wang M.Q., (2004) A product-nonspecific framework for evaluating the potential of biomass-based products to displace fossil fuels, J Ind Ecol 7, 17-32 53 Magonet E., Hayen P., Delforge D., Delaive E., and Remacle J., (1992) Importance of the Structural Zinc Atom for the Stability of Yeast Alcohol Dehydrogenase” , Biochem J 287, 361 54 Millichip R.J, Doelle H.W., (1989) Large – scale ethanol production from Milo (Sorghum) using Zymomonas mobilis, Process Biochem 24, 141-45 55 Mohagheghi A., Evans K., Chou Y.C., Zhang M (2002) Cofermentation of glucose, xylose, and arabinose by genomic DNA- integrated xylose/arabinose fermenting strain of Zymomonas mobilis AX101”, Appl Biochem Biotechnol Lett 18, 985-90 56 Neale A.D, Scopes R.K., Wettenhall, R.E & Hoogenraad, N.J (1987a) Nucleotide sequence of the pyruvate decarboxylase gene from Zymomonas mobilis, Nucleic Acids Res 15, 1753-61 57 Neale A.D., Scopes R.K., Wettenhall R.E & Hoogenraad N.J (1987b) Pyruvate decarboxylase of Zymomonas mobilis: isolation, properties, and genetic expression in Escherichia coli, J Bacteriol 169, 1024-28 58 Negelein E, Wulff HJ (1937), Biochem Z 293 – 351 59 Neidhardt F.C., Ingraham J.K.L., Schaechter M., (1990) Physiology of the bacterial cell A molecular approach ASM, Washington, 507 60 Ohta K., Beall D.S., Mejia J.P., Shanmugam K.T., & Ingram L.O., (1991a) Genetic improvement of Escherichia coli for ethanol production: chromosomal integration of Zymomonas mobilis genes encoding pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase II”, Appl Environ Microbiol 57, 893-900 71 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 61 Ohta K., Beall D.S., Mejia J.P., Shanmugam K.T & Ingram L.O., (1991b) Metabolic engineering of Klebsiella oxytoca M5A1 for ethanol production from xylose and glucose Appl Environ Microbiol 57, 2810-15 62 Park K., and Kwak I., (2009) Alcohol Dehydrogenase Gene Expression in Chironomusriparius Exposed to Di(2-ethylhexyl) Phthalate , Comp Biochem Physiol C 150, 361 63 Pereira E., Aracava Y., Aronstam R., Barreiro E., and Albuquerque, E., (1992) Pyrazole, an Alcohol Dehydrogenase Inhibitor, Has Dual Effects on NormalMethyl-D-Aspartate Receptors of Hippocampal Pyramidal Cells - Agonist and Noncompetitive Antagonist”, J Pharmacol Exp Ther 261, 331 64 Reynen M & Sahm H., (1988) Comparison of the structural genes for pyruvate decarboxylase in different Zymomonas mobilis strains”, J Bacteriol 170, 3310-13 65 Reysenbach A.L., Ravenscroft N., Long S., Jones D.T & Woods D.R., (1986) Characterization, biosynthesis and regulation of granulose in Clostridium acetobutylicum, Applied and Environmental Microbiology 52, 185-90 66 Rogers P.L.K., Lee J., Skotnicki M.L., Tribe D.E., (1982) Ethanol production by Zymomonas mobilis, Advances Biochem Eng 23, 37-84 67 Sachan D., and Cha Y., (1994) Acetylcarnitine Inhibits Alcohol Dehydrogenase , Biochem Biophys Res Commun 203, 1496 68 Seo H-B., Kim H-J., Lee O-K., Ha J-H., Lee H-Y., Jung K-H., (2009) Measurement of ethanol concentration using solvent extraction and dichromate oxidation and application to bioethanol production process, J Ind Microbiol Biotechnol 36, 285-92 69 Shiao G., Kathardekar V., and Viola R., (1994) Inactivation of Yeast Alcohol by Nitrilopropionamides , J Enzym Inhib 8, 133 70 Shore J & Theorell H., (1966) A Kinetic Study of Ternary Complexes in the Mechanism of Action of Liver Alcohol Dehydrogenase , Arch Biochem Biophys 116, 255 72 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 71 Shore J & Theorell H., (1966) Substrate Inhibition Effects in the Liver Alcohol Dehydrogenase Reaction , Arch Biochem Biophys 117, 375 72 Silva G.P., Araujo E.F., Silva D.O., Guimaraes W.V., (2005) Ethanol fermentation of sucrose, sugarcane juice and molasses by Escherichia coli strain KO11 and Klesbsiella oxytoca strain P2 Brazillian Journal of Microbilogy 36,395-404 73 Sprenger G.A., (1996) Carbohydrate metabolism in Zymomonas mobilis: a catabolic highway with some scenic routes, FEMS Microbiol Lett 145, 301-307 74 Stephenson M.P & Dawes E.A (1971) Pyruvic acid and formic acid metabolism in Sarcina ventriculi and the role of ferredoxin”, J Gen Microbiol 69, 331-43 75 Theorell H., McKee J.S., (1961) Mechanism of action of liver alcohol dehydrogenase", Nature 192, 47–50 76 Theorell H., Chance B., and Yonetani T., (1966) Effect of Crystallization Upon the Reactivity of Horse Liver Alcohol Dehydrogenase” , J Mol Biol 17, 513 77 Toivari M.H., Aristidou A., Ruohonen L., Penttilä M., (2001) Conversion of xylose to ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae: Importance of xylulokinase (XKS1) and oxygen availability, Metab Eng 3, 236-49 78 Underwood S.A., Buszko M.L., Shanmugam K.T., Ingram L.O., (2004) Lack of protective osmolytes limits final cell density and volumetric productivity of ethanologenic Escherichia coli KO11 during xylose fermentation Applified environmental microbiology 70, 2734-40 79 Vallee B., and Hoch F (1955) Yeast Alcohol Dehydrogenase, A Zinc Metalloenzyme, J Am Chem Soc 77, 821 80 Vallee B., and Hoch F., (1955) Zinc, A Component of Yeast Alcohol Dehydrogenase , Proc Natl Acad Sci USA 41, 327 81 Walfridsson M., Hallborn J., Penttilă M., Kerănen S & Hahn-Hăgerdal B., (1995) Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase”, Appl Environ Microbiol 61, 4184-90 73 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 82 Watabiki T., Tokiyasu T., Ishida, N., and Ogawa K., (1989) Double Staining Procedure for Histochemical Localization of Alcohol and Aldehyde Dehydrogenase Activities in the Mouse Liver, Acta Histochem 22, 401 83 Wheals, A E.; Basso, L C.; Alvesand, D M G and Amorim, H V (1999), Fuel ethanol after 25 years, Trends in Biotechnol, 17, 482-487 84 Wiselogel A., Tyson S., Johnson D., (1996) Biomass feedstock resources and composition In: Wyman CE (ed) Handbook on bioethanol: production and utilization, Applied Energy Technology Series, Washington, D.C., 105-18 85 Wyman C.E (1999) Biomass ethanol: Technical progress, opportunities, and commercial challenges, Annu Rev Energy Environ 24, 189–226 86 Zaldivar J., Nielsen J., Olsson L., (2001) Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration, Appl Microbiol Biotechnol 56, 17-34 87 Zhang M., Eddy C., Deanda K., Finkelstein M., Picataggio S., (1995a) Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis”, Science 267, 240 -243 88 Zhang M., Franden M.A., Newman M., Mcmillan J., Finkelstein M., Picataggio S., (1995b), Promising ethanologens for xylose fermentation scientific note, Appl Biochem Biotechnol 51, 527-36 74 Vũ Thị Thu Hà ... oxytoca tái tổ hợp cho trình lên men ethanol …… 13 1.4.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp cho trình lên men 13 ethanol 1.4.4 Vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp cho trình lên men ethanol. .. suất tạo ethanol cao đường lên men thứ (con đường XI) Như vậy, dựa vào yêu cầu sản xuất dây chuyền sản xuất mà có lựa chọn phù hợp việc tạo chủng nấm men tái tổ hợp có khả lên men xylose tạo ethanol. .. từ chủng tự nhiên vào chủng vi sinh vật có khả lên men cồn lại thiếu hụt enzyme thủy phân - Đưa gen quan trọng đường chuyển hóa tạo ethanol từ chủng có khả lên men cồn vào chủng vi sinh vật có