Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Lý Thu tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Lê Quang Hòa thầy giáo phịng Sau Đại học, thầy cô giáo Viện CN Sinh học & CN Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi thời gian học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nơng nghiệp giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian tơi thực khóa luận Cuối tơi xin gửi tới bố mẹ, anh chị bạn bè, người quan tâm, ủng hộ chỗ dựa cho suốt thời gian làm khóa luận này, sống Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành giúp đỡ quý báu Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Hòa Nguyễn Thị Hòa -i- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thơng qua vi khuẩn Agrobacterium KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN : Deoxirionucleic Acid Bt : Bacillus thuringensis CCC : Chiều cao CCĐB : Chiều cao đóng bắp Cry : Crystal CS : Cộng CTAB : Cetyltrimethylammonium Bromide ĐC : Đối chứng FAO : Food and Agriculture Organization GMC : Genetically Modified Corn GMO : Genetically Modified Organism OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction T-DNA : Transfer-DNA TGST : Thời gian sinh trưởng Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid Vir : virulence Nguyễn Thị Hòa - ii - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Bản đồ Ti- plasmid dạng octopin Hình 2.2 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật 12 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 16 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pADT2 35 Hình 3.1 Kết điện di kiểm tra mẫu ADN tổng số gel agarose 0,8 % 46 Hình 3.2 Kết phân tích PCR gen Cry1A(c) T2 dòng VN106 48 Hình 3.3 Kết phân tích PCR gen Cry1A(c) T2 dịng CH9 48 Hình 3.4 Kết đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu hệ T2 50 Hình 3.5 Đánh giá khả kháng sâu dịng ngơ CH9.13.159.1 chuyển gen phương pháp thử sâu in vitro 53 Hình 3.6 So sánh số tiêu nơng sinh học dịng ngơ chuyển gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 với dòng ngơ đối chứng (chưa chuyển gen) 55 Hình 3.7 Các dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 trồng nhà lưới cách ly côn trùng 55 Hình 3.8 Các T2 trồng nhà lưới cách ly 56 Hình 3.9 Kết phân tích PCR gen Cry1A(c) T3 dịng VN106 58 Hình 3.10 Kết phân tích PCR gen Cry1A(c) T3 dịng CH9 58 Hình 3.11 Kết lai Southern blot dịng ngơ CH9 chuyển gen Cry1A(c) hệ T3 59 Hình 3.12 Kết đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ CH9 chuyển gen kháng sâu hệ T3 .61 Hình 3.13 Đánh giá khả kháng sâu đục thân thân dòng mang gen kháng sâu hệ T3 63 Hình 3.14 So sánh số tiêu nơng sinh học dịng ngơ CH9 chuyển gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T3 với dịng ngơ đối chứng (chưa chuyển gen) 64 Hình 3.15 Các dịng ngơ CH9 mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T3 trồng nhà lưới cách ly côn trùng 65 Nguyễn Thị Hòa - iii - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 17 Bảng 1.2 Các gen thị sinh hóa .18 Bảng 2.1 Danh sách dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T1 sử dụng làm vật liệu nghiên cứu .34 Bảng 2.2 Trình tự đoạn mồi sử dụng nghiên cứu 38 Bảng 3.1 Kết PCR phân tích dịng ngơ chuyển gen T2 .47 Bảng 3.2 Kết đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu hệ T2 49 Bảng 3.3 Đánh giá mức độ gây độc dịng ngơ mang gen 51 Bảng3.4 Đánh giá số đặc tính nơng sinh học dịng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 53 Bảng 3.5 Các dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 56 Bảng 3.6 Kết PCR phân tích dịng ngơ chuyển gen T3 .57 Bảng 3.8 Kết đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu hệ T3 60 Bảng 3.9 Đánh giá khả kháng sâu đục thân dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T3 62 Bảng3.9 Đánh giá đặc tính nơng sinh học dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T3 .63 Nguyễn Thị Hòa - iv - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i KÝ HIỆU VIẾT TẮT ii DANH MỤC HÌNH VẼ iii MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, vai trò vị trí ngơ hệ thống trồng .4 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Vai trị ngơ kinh tế 1.1.3 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam 1.1.4 Khái quát tình hình sâu hại ngơ Việt Nam 1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chế chuyển gen vào thực vật 1.2.1 Giới thiệu chung Agrobacterium tumefaciens 1.2.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid .8 1.2.3 Cấu trúc chức đoạn T-ADN .9 1.2.4 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens .10 1.2.5 Tương tác T-ADN genome tế bào thực vật 12 1.3 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật 13 1.3.1 Hệ vector hai nguồn 14 1.3.2 Hệ vector liên hợp .15 1.3.3 Các gen thị chọn lọc gen thông báo hệ thống vector biến nạp 16 1.4 Những nghiên cứu Bacillus thuringiensis Cry 19 1.4.1 Những nghiên cứu chung Bacillus thuringiensis 19 1.4.2 Những nghiên cứu gen Cry 19 1.4.3 Cấu trúc chức protein tinh thể độc 20 Nguyễn Thị Hòa -v- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium 1.4.4 Một số nghiên cứu gen Cry1A(c) 22 1.5 Thực trạng nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Sinh học chọn tạo giống ngô .23 1.5.1 Hệ thống tái sinh ngô .23 1.5.2 Hệ thống chuyển gen ngô 26 1.5.3 Một số đặc tính cải thiện ngô kĩ thuật di truyền 30 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Vật liệu 34 2.1.1 Vật liệu thực vật 34 2.1.2 Vật liệu di truyền .34 2.3 Phương pháp thí nghiệm .35 2.3.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 35 2.3.2 Phương pháp phân tích dịng ngơ chuyển gen .37 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 45 3.2 Kết phân tích PCR có mặt gen Cry1A(c) dịng ngơ chuyển gen hệ T2 .46 3.3 Đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 48 3.4 Đánh giá khả kháng sâu dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 phương pháp thử sâu in vitro 50 3.5 Đánh giá khả sinh trưởng, phát triển đặc tính nơng học quan trọng dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2 .53 3.6 Kết phân tích PCR có mặt gen Cry1A(c) dịng ngơ chuyển gen hệ T3 .56 3.7 Phân tích Southern blot gen Cry1A(c) dịng ngơ chuyển gen hệ T3 58 Nguyễn Thị Hòa - vi - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngô chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium 3.8 Đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T3 59 3.9 Đánh giá khả kháng sâu đục thân dịng ngơ chuyển gen hệ T3 điều kiện thử sâu nhân tạo nhà lưới cách ly 61 3.10 Đánh giá khả sinh trưởng, phát triển đặc tính nơng học quan trọng dịng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T3 .63 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 4.1 Kết luận .66 4.2 Đề nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Nguyễn Thị Hòa - vii - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium MỞ ĐẦU Ngô (Zea mays L.) ba lương thực quan trọng giới So với lúa mì lúa gạo ngơ đứng thứ ba diện tích, thứ hai suất thứ sản lượng Với giá trị kinh tế cao khả thích ứng rộng, ngơ trồng hầu hết vùng trái đất Năm 2012, diện tích trồng ngơ giới đạt 174,64 triệu với tổng sản lượng đạt 838 triệu Trong Mỹ nước có diện tích lớn với 35,5 triệu ha, sản lượng đạt 274 triệu (James, 2012) Nhu cầu ngô giới dự báo tăng lên 50% với 852 triệu vào năm 2020 vượt qua gạo lúa mì (Pingali & Padney, 2010) Tại Việt Nam, ngô lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, đối tượng chủ lực cơng xóa đói giảm nghèo, đặc biệt tỉnh vùng núi Năm 2012, diện tích gieo trồng ngơ nước đạt gần 1,2 triệu với sản lượng 4,6 triệu tấn, suất đạt 40,09 tạ/ha (Tổng cục thống kê, 2012) Tuy nhiên hàng năm nước ta phải nhập ngô với lượng lớn, 1,614 triệu năm 2012 với trị giá 500 triệu USD (Bộ Công thương, 2012) Theo chiến lược Bộ Nông nghiệp & PTNT đến năm 2020, sản lượng ngô Việt Nam cần đạt – triệu tấn/năm để đảm bảo cung cấp đủ nhu cầu nước bước tham gia xuất Tuy nhiên sản xuất ngô phải đối mặt với tình hình sâu bệnh dịch hại ngày tăng Hiện nay, nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây nhiễm mơi trường gây độc hại cho sức khỏe người, vật nuôi Để cải thiện tình hình này, kỹ thuật tiên tiến bảo vệ trồng nhằm xây dựng nông nghiệp sạch, bền vững nghiên cứu Việc tạo giống trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops, GMCs) có khả kháng sâu bệnh côn trùng nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật quan tâm nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao suất trồng đem lại lợi ích tối đa cho nơng nghiệp Nguyễn Thị Hịa -1- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium Cây ngô chuyển gen thương mại hóa vào năm 1996, đến năm 2012 diện tích trồng ngơ biến đổi gen đạt 55,1 triệu chiếm 31,6% tổng diện tích trồng ngơ tồn giới Trong số đó, ngơ chuyển gen kháng sâu biểu protein Cry có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) chiếm khoảng 7,5 triệu (4%) (James, 2012) Tại Việt Nam, nghiên cứu chuyển gen đối tượng ngô thực iện Di truyền Nông nghiệp từ năm 2002 Cho đến nay, dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) tạo phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium giống ngô chuyển gen kháng sâu ới mục đích chọn tạo iệt Nam, nghiên cứu đánh giá có mặt tính ổn định gen chuyển dịng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) cần thiết Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn trên, thực đề tài: “Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium” Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá có mặt, tính ổn định gen chuyển Cry1A(c) dịng ngơ chuyển gen kháng sâu (thế hệ T2, T3) thông qua tiêu: - Phân tích PCR gen Cry1A(c) - Phân tích Southern blot gen Cry1A(c) - ác định diện protein Cry1A(c) - Đánh giá khả kháng sâu phương pháp thử sâu invitro điều kiện lây nhiễm nhân tạo nhà lưới cách ly côn trùng - Đánh giá số đặc tính nơng học quan trọng dịng ngơ chuyển gen Nội dung nghiên cứu: - Phân tích sinh học phân tử (PCR) gen kháng sâu Cry1A(c) dòng ngơ mang gen hệ T2, T3 - Phân tích sinh học phân tử (lai Southern blot) gen kháng sâu Cry1A(c) Nguyễn Thị Hòa -2- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thơng qua vi khuẩn Agrobacterium dịng ngô mang gen hệ T2, T3 - Đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2, T3 - Đánh giá khả kháng sâu đục thân dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2, T3 phương pháp thử sâu invitro - Đánh giá khả kháng sâu đục thân dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2, T3 điều kiện lây nhiễm nhân tạo nhà lưới cách ly côn trùng - Đánh giá khả sinh trưởng, phát triển, đặc tính nơng học quan trọng dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) hệ T2, T3 Nguyễn Thị Hòa -3- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium Bảng 3.8 Kết đánh giá diện protein cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu hệ T3 Số phân tích Số protein Cry1A(c) (+) VN106.7.6.1 VN106.21.12.3 Tổng số CH9 (đối chứng) CH9.13.159.1 25 25 CH9.13.159.10 23 23 CH9.13.159.15 19 19 Tổng số 67 67 STT Tên dòng T2 Dòng VN106 N106 (đối chứng) Dòng CH9 Kết bảng 3.8 cho thấy: số dòng N106 được xác định có mặt protein Cry1A(c) 2/8 cây, điều chứng tỏ gen chuyển nạp chưa kết hợp ổn định hệ gen ngô Tuy nhiên thuộc dịng CH9 tỷ lệ 100% Vì vậy, dịng CH9.13.159 mà chúng tơi thu nhận nghiên cứu thể tính ổn định gen chuyển Cry1A(c) hệ Sau hình ảnh kết đánh giá diện protein Cry1A(c) dòng CH9 hệ T3 Nguyễn Thị Hòa - 60 - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thơng qua vi khuẩn Agrobacterium Hình 3.12 Kết đánh giá diện protein Cry1A(c) dịng ngơ CH9 chuyển gen kháng sâu hệ T3 Ghi chú: que thử xuất vạch - khơng có protein Cry1A(c) vạch - dương tính với protein Cry1A(c) ĐC: đối chứng âm (cây CH9 khơng chuyển gen)); Số 1-13 dịng CH9 chuyển gen (số 1: CH9.13.159.1.6; số 2: CH9.13.159.1.1; số 3: CH9.13.159.10.1; số 4: CH9.13.159.10.9; số 5: CH9.13.159.10.10; số 6: CH9.13.159.15.1; số 7: CH9.13.159.15.3; số 8: CH9.13.159.15.10; số 9: CH9.13.159.1.3; số 10: CH9.13.159.1.4; số 11: CH9.13.159.1.10; số 12: CH9.13.159.15.4; số 13: CH9.13.159.15.9) Để đánh giá mức độ biểu gen chuyển dịng ngơ mang gen kháng sâu hệ T3, tiếp tục tiến hành đánh giá khả kháng sâu đục thân dòng ngô điều kiện nhà lưới cách ly côn trùng 3.9 Đánh giá khả n ng kháng sâu đục thân dịng ngơ chuyển gen hệ T3 điều kiện thử sâu nhân tạo nhà lƣới cách ly Trong biến nạp gen nói chung biến nạp gen thực vật nói riêng, việc tạo cá thể mang gen quan tâm yếu tố cần có, song biểu gen cá thể mang chúng yếu tố quan trọng định đến hiệu quả trình biến nạp Thông thường, biểu gen quan tâm cá thể biến nạp gen phụ thuộc vào: cấu trúc vector (đoạn khởi động, đoạn kết thúc ), số lượng gen chuyển vị trí mà định vị Trong thí nghiệm chúng tơi, chuyển gen dương tính với PCR dịng VN106 CH9 hệ T3 đánh giá điều kiện gây áp lực sâu nhân Nguyễn Thị Hòa - 61 - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngô chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium tạo nhà lưới cách ly côn trùng Khi ngơ từ 35-40 ngày tuổi, có 7-10 lá, tiến hành thả ổ ấu trùng sâu đục thân lên nõn Tiến hành thả sâu lần, lần cách tuần, lần 10-15 ấu trùng/cây Mật độ thả sâu cuối cùng: 30-50 ấu trùng/cây Sau đo đếm số thân, nhận thấy mức độ kháng sâu dòng chuyển gen khác Các thuộc dịng VN106 có số DLTB thấp (DLTB=0-1), bị sâu hại nhiều, thuộc dịng CH9 có số DLTB cao (3≤DLTB≤5), không bị sâu hại (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Đánh giá khả kháng sâu đục thân dịng ngơ mang gen kháng sâu cry1A(c) hệ T3 STT Dòng T3 Số bị hại Số không bị hại (DLTB = 0-1) 1