BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER D15#26LCC1 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢƠNG MAI NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TÁI TỔ HỢP TRONG ASPERGILLUS NIGER D15#26LCC1 VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm Mã số: 62 54 02 05 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TÔ KIM ANH TS LÊ QUANG HÒA Hà Nội - 2012 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Những số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố Hà Nội, ngày…….tháng………năm 2012 Nguyễn Thị Phương Mai i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Tô Kim Anh – Viện trƣởng – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt cấp kinh phí cho suốt trình nghiên cứu Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa GS.TS Đặng Thị Thu – Phòng Hóa Sinh – Vi sinh Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt cho thực nghiên cứu Bên cạnh đó, xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trƣởng môn Hóa sinh – Vi sinh Sinh học phân tử thầy, cô giáo vá cán phòng Hóa sinh – Vi sinh Sinh học phân tử tận tình giúp đỡ, dạy bảo động viên trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tuấn Anh – giảng viên môn Hóa sinh-Vi sinh Sinh học phân tử, Th.s Lê Tuân - cán nghiên cứu môn Hóa sinh-Vi sinh Sinh học phân tử học viên hƣớng dẫn tận tình giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu môn Tôi xin đƣợc cảm ơn TS Trƣơng Quốc Phong – Trƣởng phòng thí nghiệm Proteomic, cán học viên Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội động viên, hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực nghiên cứu Cuối cùng, xin cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Cộng đồng Hà Tây gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày…… tháng…….năm 2012 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phƣơng Mai ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT viii BẢNG VIẾT TẮT CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ix DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LACCASE 1.1.1 NGUỒN THU LACCASE 1.1.1.1 Laccase tự nhiên 1.1.1.2 Laccase tái tổ hợp 1.1.2 CẤU TRÖC CỦA LACCASE 1.1.3 CƠ CHẾ XÖC TÁC CỦA LACCASE 1.1.3.1 Xúc tác chuyển hóa hợp chất phenol 1.1.3.2 Xúc tác chuyển hóa hợp chất khác 10 1.1.4 ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE 11 1.1.4.1 Khối lƣợng phân tử 11 1.1.4.2 Tính đặc hiệu chất 12 1.1.4.3 Các số động học phản ứng laccase 12 1.1.4.4 pH tối ƣu độ bền pH 14 1.1.4.5 Nhiệt độ tối ƣu độ bền nhiệt 15 1.1.4.6 Các chất kìm hãm 15 iii 1.2 ỨNG DỤNG CỦA LACCASE 16 1.2.1 Laccase phân hủy hợp chất mạch vòng 16 1.2.2 Ứng dụng công nghiệp giấy 17 1.2.3 Ứng dụng laccase công nghiệp dệt nhuộm 17 1.2.4 Laccase công nghiệp thực phẩm 18 1.2.5 Laccase sản xuất bioethanol 19 1.2.6 Các ứng dụng khác laccase 19 1.3 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ NẤM MỐC 20 1.3.1 Ảnh hƣởng trạng thái nấm mốc 20 1.3.2 Ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng 20 1.3.2.1 Ảnh hƣởng nguồn cacbon nồng độ cacbon 20 1.3.2.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 21 1.3.2.3 Ảnh hƣởng nguồn khoáng 22 1.3.2.4 Ảnh hƣởng chất cảm ứng 23 1.3.2.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ pH 24 1.3.2.6 Ảnh hƣởng thông khí 25 1.4 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 25 1.4.1 Lên men gián đoạn 26 1.4.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed-batch) 27 1.4.3 Lên men liên tục 28 1.4.4 Động học trình sinh tổng hợp laccase 29 1.4.4.1 Động học phát triển nấm mốc 29 1.4.4.2 Động học trình tạo sản phẩm hệ thống lên men 30 1.4.5 Sinh tổng hợp laccase nhờ hệ thống biểu A niger D15#26- pAN52-4 32 1.5 TINH CHẾ LACCASE .34 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 iv 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 36 2.1.1 Các mẫu vật nghiên cứu 36 2.1.2 Vi sinh vật 36 2.1.3 Các loại thiết bị 37 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.2.1 Xác định sinh khối nấm mốc 38 2.2.2 Xác định hoạt độ laccase 38 2.2.3 Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến 39 2.2.4 Xác định đƣờng khử theo phƣơng pháp DNS 40 2.2.5 Xác định protein phƣơng pháp Lowry 40 2.2.6 Điện di biến tính protein gel polyacrylamide (SDS – PAGE) 41 2.2.7 Điện di không biến tính phát laccase 41 2.2.8 Xác định hàm lƣợng ethanol 41 2.2.9 Xác định hàm lƣợng phenol tổng số phƣơng pháp Folin Ciocalteau 42 2.2.10 Thu bào tử nấm mốc đĩa thạch 42 2.2.11 Phân lập sàng lọc chủng sinh laccase 43 2.2.12 Phƣơng pháp sàng lọc dòng biểu laccase 43 2.2.13 Phƣơng pháp nuôi cấy tối ƣu hóa điều kiện nuôi A niger D15#26lcc1 1.8B 43 2.2.14 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B 44 2.2.15 Tinh chế laccase tái tổ hợp 45 2.2.16 Khảo sát đặc tính enzyme 45 2.2.17 Thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thuật 46 2.2.18 Nghiên cứu sử dụng laccase chuyển hóa lignocellulose 47 2.2.18.1 Xác định hàm lƣợng lignin theo phƣơng pháp biến tính Komarov 47 2.2.18.2 Khảo sát vai trò khử độc dịch thủy phân bã mía laccase 48 v CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 50 3.2 SÀNG LỌC CÁC DÕNG A NIGER D15#26 lcc1 SINH TỔNG HỢP LACCASE 53 3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN TĂNG TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE TRONG A niger D15#26lcc1 1.8B .57 3.3.1 Ảnh hƣởng nồng độ glucose 57 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ CuSO4 60 3.3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống cấp 61 3.3.4 Ảnh hƣởng pH 62 3.3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 64 3.4 TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP LACCASE TỪ A niger D15#26lcc1 1.8B TRONG LÊN MEN GIÁN ĐOẠN 66 3.4.1 Chọn miền khảo sát 66 3.4.2 Thiết lập mô hình 67 3.4.3 Tối ƣu hóa trình tổng hợp laccase 71 3.5 KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI TỔNG HỢP LACCASE 72 3.5.1 Ảnh hƣởng chế độ sục khí đến sinh tổng hợp laccase 72 3.5.2 Động thái trình sinh tổng hợp laccase từ A niger D15#26lcc1 1.8B hệ thống lên men gián đoạn 74 3.6 THỬ NGHIỆM SINH TỔNG HỢP LACCASE TRONG LÊN MEN HAI GIAI ĐOẠN 75 3.7 THỬ NGHIỆM LÊN MEN FED-BATCH .78 3.8 TINH CHẾ LACCASE .81 3.9 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE TÁI TỔ HỢP 83 3.9.1 Ảnh hƣởng pH tới laccase 83 3.9.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới enzyme 84 3.9.3 Các số động học phản ứng enzyme 85 vi 3.10 KHẢO SÁT ỨNG DỤNG LACCASE TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ LIGNOCELLULOSE 87 3.10.1 Tiền xử lí hóa nhiệt kết hợp với laccase 87 10.2 Vai trò laccase khử độc dịch thủy phân cho mục tiêu lên men ethanol 88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 KẾT LUẬN 92 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC 104 vii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TT Các từ Giải thích từ thuật ngữ viết tắt thuật ngữ viết tắt ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) BSA Bovine serum albumin DMP 2,6-dimethoxyphenol DNS 2,3 – dinitro salycilic EPR Cộng hƣởng thuận từ E0 Thế oxi hóa khử FC Folin Ciocalteau FPLC Fast protein liquid chromatography HBT 1-hydroxybenzotriazole 10 kb 11 kDa Kilo dalton 12 mV Milivol 13 PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon– Hydrocacbon mạch vòng 14 RBBR 15 SDS – PAGE 16 TCA Kilo base Remazol Brilliant Blue R Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Trichloroacetic acid viii TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Anh, T K (2010) "Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme tái tổ hợp thủy phân lignocellulose phục vụ sản xuất cồn nhiên liệu " Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ, Bộ Khoa học Công nghệ Hà Nội pp Anh, T K., D T Thu, N T X Sam, T D Man, L Q Hoa, T Q Phong, D T Ha, N Q Viet, L D Khuong, L Tuan, N T P Mai and P T Thuy (2011) "Sacchrification and detoxication of sugar cane bagasse lignocellulose for bioethanol fermentation by an inhouse enzyme mixture" Tạp chí khoa học công nghệ 49 (1A), pp 439 – 445 Mai, L T., N T Hiền, P T Thủy, N T Hằng and L T L Chi (2009) Các phƣơng pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Thu, Đ T., N T X Sâm and T K Anh (1997) Thí nghiệm Hóa sinh công nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TIẾNG ANH Archibald, F S., R Bourbonnais, L Jurasek, M G Paice and I D Reid (1997) "Kraft pulp bleaching and delignification by Trametes versicolor" Journal of Bioscience and Bioengineering 53, pp 215-236 Arias, M E., M Arenas, J Rodrı´guez, J Soliveri, A S Ball and M H ´ndez (2003) "Kraft pulp biobleaching and mediated oxidation of a nonphenolic substrate by laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335" Applied and Environmental Microbiology 69, pp 1953-1958 Assavanig, A., B Amornkitticharoen, N Ekpaisal, V Meevootisom and T W Flegel (1992) "Isolation, characterization and function of laccase from Trichoderma" Applied Microbiology Biotechnology 38, pp 198-202 Bailey, M J., B Adamitsch, J Rautio, N V Weymarn and M Saloheimo (2007) "Use of a growth-associated control algorithm for efficient production of a heterologous laccase in Trichoderma reesei in fed-batch and continuous cultivation" Enzyme and Microbial Technology 41, pp 484–491 Baldrian, P and J Gabriel (2002) "Copper and cadmium increase laccase activity in Pleurotus ostreatus" FEMS Microbiology Letters 206, pp 69-74 10 Banci, L., S Ciofi-Baffoni and M Tien (1999) "Lignin and Mn peroxidase-catalyzed oxidation of phenolic lignin oligomers" Biochemistry 38, pp 3205-3210 11 Bar, M (2001) Kinetics and physco-chemical properties of white-rot fungal laccases Department of Microbiology and Biochemistry, University of the Free State, Bloemfontein 12 Berka, R M., P Schneider, E J Golightly, S H Brown, M Madden, K M Brown, T Halkier, K Mondorf and F Xu (1997) "Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of Myceliophthora thermophila and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae" Applied and Environmental of Microbiology 63, pp 3151-3157 94 13 Bhargava, S., K S Wenger and M R Marten (2003a) "Pulsed addition of limitingcarbon during Aspergillus oryzae fermentation leads to improved productivity of a recombinant enzyme" Biotechnol Bioeng 82, pp 111 – 117 14 Blaich, R and K Esser (1975) "Function of enzymes in wood destroying fungi II Multiple forms of laccase in white rot fungi" Archives of Microbiology 103, pp 271–277 15 Bocking, S P., M G Wiebe, G D Robson, K Hansen, L H Christiansen and A P JTrinci (1999) "Effect of branch frequency in Aspergillus oryzae on protein secretion and culture viscosity" Biotechnol Bioeng 65, pp 638 – 648 16 Bohlin, C., L J Jonsson, R Roth and W H V Zyl (2006) "Heterologous Expression of Trametes versicolor Laccase in Pichia pastoris and Aspergillus niger" Applied Biochemistry and Biotechnology 06, pp 129–132 17 Bouex, P., M Sabourin, S Chaignepain, M Castroviejo and P Laquel-Robert (2002) "Purification and characterization of an endo-exonuclease from Podospora anserina mitochondria" Biochim Biophys Acta 1574(1), pp 72-84 18 Bourbonnais, R and M G Paice (1990) "Oxidation of non-phenolic substrates: An expanded role for laccase in lignin biodegradation" FEBS Lett 267, pp 99-102 19 Bourbonnais, R., M G Paice, B Freiermuth, E Bodie and S Borneman (1997) "Reactivities of various Mediators and Laccases with Kraft Pulp and Lignin model compounds" Applied and Environmental of Microbiology 63(12), pp 4627-4632 20 Bourbonnais, R., M G Paice, I D Reid, P Lanthier and M Yaguchi (1995) "Lignin oxidation by laccase isozymes from Trametes versicolor and role of the mediator 2,2' Azinobis (3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonate) in Kraft Lignin Depolymerization" Applied and Environmental of Microbiology 61(5), pp 1876-1880 21 Bulter, T., M Alcalde, V Sieber, P Meinhold, C Schlachtbauer and F Arnold (2003) "Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution " Applied and Environmental of Microbiology 69, pp 987-995 22 Camarero, S., O Garc´ıa, T Vidal, J Colom, J C d R´o, A Gutiérrez, J M Gras, R Monje, M J Mart´ınez and Á T Mart´ınez (2004) "Efficient bleaching of non-wood highquality paper pulp using laccase-mediator system" Enzyme and Microbial Technology 35, pp 113–120 23 Campos, R., A Kandelbauer, K Robra, A Cavaco-Paulo and G M Gübitz (2001) "Indigo degradation with purified laccases from Trametes hirsuta and Sclerotium rolfsii" Journal Biotechnology 89, pp 131–139 24 Cassland, P and L J Jonsson (1999) "Characterization of a gene encoding Trametes versicolor laccase A and improved heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae by decreased cultivation temperature" Applied Microbiol Biotechnol 52, pp 393-400 25 Chandel, A K., R K Kapoor, A Singh and R C Kuhad (2007) "DetoxiWcation of sugarcane bagasse hydrolysate improves ethanol production by Candida shehatae NCIM 3501" Bioresource Technology 98, pp 1947-1950 26 Chefetz, B., Y Chen and Y Hadar (1998) "Purification and characterization of laccase from Chaetomium thermophilium and its role in humification" Applied and Environmental of Microbiology 64, pp 3175-3179 95 27 Cheng, K K., B Y Cai, J A Zhang, H Z Ling, Y J Zhou, J P Ge and M Xu (2008) "Sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate for ethanol production by axit recovery process" Biochemical Engineering Journal 38, pp 105–109 28 Chenga, K.-K., B.-Y Caib, J.-A Zhanga, H.-Z Lingb, Y.-J Zhoua, J.-P Geb and J.M Xu (2008) "Sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate for ethanol production by acid recovery process" Biochem Eng J 38, pp 105–109 29 Claus, H (2003) "Laccases: structure, reactions, distribution" 13th International Conference on Invertebrate Dioxygen Binding Proteins Mainz, Germany PergamonElsevier Science Ltd pp 30 Colao, M C., S Lupino, A M Garzillo, V Buonocore and M Ruzzi (2006) "Heterologous expression of lccl gene from Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme" Microb Cell Fact 5, pp 31 31 Coll, P M., J M Fernandezabalos, J R Villanueva, R Santamaria and P Perez (1993) "Purification and characterization of a phenoloxidase (Laccase) from the lignindegrading basidiomycete PM1 (Cect-2971)" Applied and Environmental of Microbiology 59, pp 2607-2613 32 Collins, P J., M J J Kotterman, J A Field and A W Dobson (1996) "Oxidation of Anthracene and Benzo[a]pyrene by Laccases from Trametes versicolor" Appied and Environmental of Microbiology 62(12), pp 4563–4567 33 D’Souza, T M., K Boominathan and C A Reddy (1996) "Isolation of laccase gene specific sequences from white rot and brown rot fungi by PCR" Applied and Environmental of Microbiology 62, pp 3739-3744 34 Degan, F D., B R Dumas and K Breddam (1992) "Applied and Environmental Microbiology" Purification and Characterization of Two Serine Carboxypeptidases from Aspergillus niger and Their Use in C-Terminal Sequencing of Proteins and Peptide Synthesis 58, pp 2144-2152 35 Dubé, E., F Shareck, Y Hurtubise, C Daneault and M Beauregard (2008) "Homologous cloning, expression, and characterisation of a laccase from Streptomyces coelicolor and enzymatic decolourisation of an indigo dye" Applied Microbiology and Biotechnology 79, pp 597–603 36 Durão, P., I Bento, A Fernandes, E Melo, P Lindley and L Martins (2006) "Perturbations of the T1 copper site in the CotA laccase from Bacillus subtilis: structural, biochemical, enzymatic and stability studies" Journal Biology Inorganic Chemistry 11, pp 514-526 37 Eggert, C., U Temp and K E L Eriksson (1996b) "The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and characterization of the laccase" Applied and Environmental of Microbiology 62, pp 1151-1158 38 Eugenio, M E., J M Carbajo, J A Martín, A E González and J C Villar (2009) "Laccase production by Pycnoporus sanguineus under different culture conditions" Journal of Basic Microbiology 49(5), pp 433–440 39 Faraco, V., C Ercole, G Festa, A Piscitelli and G Sannia (2008) "Heterologous expression of heterodimeric laccase from Pleurotus ostreatus in Kluyveromyces lactis" Applied Microbiology Biotechnology 77, pp 1329-1335 96 40 Felby, C., L S Pedersen and B R Nielsen (1997) "Enhanced autoadhesion of wood fibers using phenol oxidases" International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of Wood 51( 3), pp 281-286 41 Fenice, M., G G Sermanni, F Federici and A D'Annibale (2003) "Submerged and solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panus tigrinus on olive mill wastewater-based media" Journal of Biotechnology 100, pp 77-85 42 Filazzola, M T., F Sannino, M A Rao and L Gianfreda (1999) "Effect of various pollutants and soil-like constituents on laccase from Cerrena unicolor" Journal of Environmental Quality 28, pp 1929-1938 43 Fleissner, A and P Dersch (2010) "Expression and export: recombinant protein production systems for Aspergillus" Appl Microbiol Biotechnol 87, pp 1255-1270 44 Folin, O and V Ciocalteu (1927) "On tyrosine and tryptophane determinations in proteins" Biological Chemistry 73(2), pp 627-650 45 Galhaup, C., H Wagner, B Hinterstoisser and D Haltrich (2002) "Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens" Enzyme Microbiology Technology 30, pp 529–536 46 Gellissen, G and C P Hollenberg (1997) "Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis: a review" Gene 190, pp 87-97 47 Germann, U A., G Muller, P E Hunziker and K Lerrh (1988) "Characterization of two allelic forms of Neurospora crassa laccase Amino- and carboxyl-terminal processing of a precursor" Journal Biol Chem 263, pp 885-896 48 Gibson, D T and V Subramanian (1984) "Microbial degradation of aromatic hydrocarbons " pp 181–252 In D T Gibson (ed.), Microbial degradation of organic compounds Marcel Dekker, Inc., New York 49 Givaudan, A., A Effosse, D Faure, P Potier, M L Bouillant and R Bally (1993) "Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice Rhizosphere evidence for laccase activity in nonmotile strains of Azospirillum lipoferum" Fems Microbiology Letters 108, pp 205-210 50 Gorman, M J., N T Dittmer, J L Marshall and M R Kanost (2008) "Characterization of the multicopper oxidase gene family in Anopheles gambiae" Insect Biochemistry and Molecular Biology 38, pp 817-824 51 Guillen, F., V Gomez-Toribio, M J Martinez and A T Martinez (2000) "Production of hydroxyl radical by the synergistic action of fungal laccase and aryl alcohol oxidase" Archives of Biochemistry and Biophysics 383, pp 142-147 52 Guo, M., F Lu, M Liu, T Li, J Pu, N Wang, P Liang and C Zhang (2008) "Purification of recombinant laccase from Trametes versicolor in Pichia methanolica and its use for the decolorization of anthraquinone dye" Biotechnology Letters 30, pp 2091– 2096 53 Han, M., H Choi and H Song (2005) "Purification and Characterization of Laccase from the White Rot Fungus Trametes versicolor" The Journal of Microbiology 43(6), pp 555-560 97 54 Heizkill, M., L Bech, T Halkier, P Schneider and T Anke (1998) "Characterization of laccase and peroxidase from wood-rotting fungi (family Coprinaceae)" Applied and Environmental of Microbiology 64(5), pp 1601-1606 55 Hess, J., C Leitner, C Galhaup, K D Kulbe, B Hinterstoisser, M Steinwender and D Haltrich (2002) "Enhanced formation of extracellular laccase activity by the white-rot fungus Trametes multicolor" Appl Biochem Biotechnol 98, pp 229–242 56 Hofrichter, M., T Vares, M Kalsi, S Galkin, K Scheibner, W Fritsche and A Hatakka (1999 ) "Production of Manganese Peroxidase and Organic Acids and Mineralization of 14C Labelled Lignin (14C-DHP) during Solid-State Fermentation of Wheat Straw with the White Rot Fungus Nematoloma frowardii" Applied and Environmental of Microbiology 65(5), pp 1864–1870 57 Hombergh, V d., V d Vondervoort and T LF (1997b) "Aspergillus as a host for heterologous protein production: the problem of proteases" Trends in Biotechnology 15, pp 256–263 58 Janusz, G., J Rogalski, M Barwińska and J Szczodrak (2006) "Effects of culture conditions on production of extracellular laccase by Rhizoctonia praticola" Pol J Microbiol 55(4), pp 309-319 59 Jing, D., P Li, F Stagnitti and X Xionga (2007) "Optimization of laccase production from Trametes versicolor by solid fermentation" Canadian Journal of Microbiology 53(2), pp 245-251 60 Johansen, C L., L Coolen and J H Hunik (1998) "Influence of morphology on product formation in Aspergillus awamori during submerged fermentation" Biotechnology Progress 14, pp 233–240 61 Johnson, D L., J L Thompson, S M Brinkmann, K A Schuller and L L Martin (2003) "Electrochemical characterization of purified Rhus vernicifera laccase: voltammetric evidence for a sequential four-electron transfer" Biochemistry 42, pp 10229-10237 62 Jolivalt, C., A Raynal, E Caminade, B Kokel, F L Goffic and C Mougin (1999) "Transformation of N ',N '-dimethyl-N-(hydroxyphenyl)ureas by laccase from the white rot fungus Trametes versicolor" Applied Microbiology and Biotechnology 51, pp 676-681 63 Jonsson, L., M Saloheimo and M Penttila (1997) "Laccase from the white-rot fungus Trametes versicolor: cDNA cloning of lcc1 and expression in Pichia pastoris" Curr Genet 32, pp 425-430 64 Jung, H C., F Xu and K C Li (2002) "Purification and characterization of laccase from wood-degrading fungus Trichophyton rubrum LKY-7" Enzyme and Microbial Technology 30, pp 161-168 65 Junghanns, C., M Moeder, G Krauss, C Martin and D Schlosser (2005) "Degradation of the xenoestrogen nonylphenol by aquatic fungi and their laccases" Microbiology 151, pp 45-57 66 Jurado, M., A Prieto, Á Martínez-Alcalá, Á T Martínez and M J Martínez (2009) "Laccase detoxification of steam-exploded wheat straw for second generation bioethanol" Bioresource Technology 100, pp 6378–6384 98 67 Kiiskinen, L L., K Kruus, M Bailey, E Ylosmaki, M Siika-Aho and M Saloheimo (2004) "Expression of Melanocarpus albomyces laccase in Trichoderma reesei and characterisation of the purified enzyme" Microbiology 150, pp 3065-3074 68 Kiiskinen, L L and M Saloheimo (2004) "Molecular Cloning and Expression in Saccharomyces cerevisiae of a Laccase Gene from the Ascomycete Melanocarpus albomyces" Applied and Environmental Microbiology 70, pp 137 - 144 69 Kiiskinen, L L., L Viikar and K Kruus (2002) "Purification and characterisation of a novel laccase from the ascomycete Melanocarpus albomyces" Applied Microbiology and Biotechnology 59, pp 198-204 70 Ko, E M., Y E Leem and H T Choi (2001) "Purification and characterization of laccase isozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum" Applied Microbiology and Biotechnology 57, pp 98-102 71 Kunamneni, A., F J Plou, A Alcalde and A Ballesteros (2008) "Laccases and their applications: A patent review" Recent Patent Biotechnol 2, pp 10-24 72 Kurtz, M B and S P Champe (1982) "Purification and characterization of the conidial laccase of Aspergillus nidulans" Journal of Bacteriology 151(3), pp 1338 1345 73 Kwon, S I., C D V Dohlen and A J Anderson (2001) "Gene sequence analysis of an opportunistic wheat pathogen, an isolate of Fusarium proliferatum " Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique 79, pp 1115 - 1121 74 Laemmli, U K (1970) "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4" Nature 227, pp 680 - 685 75 Lantz, M S and P Ciborowski (1994) "Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases" Methods in Enzymology 235, pp 563–594 76 Larsson, S., P Cassland and L J Jonsson (2001) "Development of a Saccharomyces cerevisiae Strain with Enhanced Resistance to Phenolic Fermentation Inhibitors in Lignocellulose Hydrolysates by Heterologous Expression of Laccase" Applied and Environmental of Microbiology 3, pp 1163 – 1170 77 Lee, I Y., K H Jung, C H Lee and Y H Park (1999) "Enhanced production of laccase in Trametes vesicolor by the addition of ethanol" Biotechnology Letters 21, pp 965-968 78 Lee, Y., C Park, B Lee, E J Han, T H Kim, J Lee and S Kim (2006) "Effect of nutrients on the production of extracellular enzymes for decolorization of reactive blue 19 and reactive black 5" Journal of Microbiology and Biotechnology Advances 16, pp 226231 79 Li, K., F Xu and K.-H Eriksson (1999) "Comparison of fungal laccases and redox mediators in oxidation of a nonphenolic lignin model compound" Applied and Environmental of Microbiology 65, pp 2654-2660 80 Linke, D., H Bouws, T Peters, M Nimtz, R G Berger and H Zorn (2005) "Laccases of Pleurotus sapidus: Characterization and Cloning" Journal of Agricultural and food chemistry 53, pp 9498 - 9505 81 Lowry, O H., N J Rosebrough, A L Farr and R J Randall (1951) "Protein measurement with the Folin phenol reagent" The Journal of Biological Chemistry 193(1), pp 265–275 99 82 Madzak, C., M C Mimmi, E Caminade, A Brault, S Baumberger, P Briozzo, C Mougin and C Jolivalt (2006) "Shifting the optimal pH of activity for a laccase from the fungus Trametes versicolor by structure-based mutagenesis" Protein Engineering, Design and Selection 19, pp 77–84 83 Madzak, C., L Otterbein, M Chamkha, S Moukha, M Asther, C Gaillardin and J M Beckerich (2005) "Heterologous production of a laccase from the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica" FEMS Yeast Res 5, pp 635-646 84 Mansur, M., M E Arias, J L Copa-Patino, M Flardh and A E Gonzalez (2003) "The white-rot fungus Pleurotus ostreatus secretes laccase isozymes with different substrate specificities" Mycologia 95, pp 1013-1020 85 Mansur, M., T Suarez, J B Fernandezlarrea, M A Brizuela and A E Gonzalez (1997) " Identification of a laccase gene family in the new lignin-degrading basidiomycete CECT 20197" Applied and Environmental of Microbiology 63, pp 2637-2646 86 Mcneil, B and L M Harvey (2008 ) Practical Fermentation Technology, Strathclyde Fermentation Centre, Strathclyde University, UK 87 Medeiros, M B., A V Bento, A L L Nunes and S C Oliveira (1999) "Optimization of some variables that affect the synthesis of laccase by Pleurotus ostreatus" Bioprocess Engineering 21, pp 483-487 88 Minussi, R C., M A Miranda, J A Silva, C V Ferreira, H Aoyama, S Marangoni, D Rotilio, G M Pastore and N Durán (2007 ) "Purification, characterization and application of laccase from Trametes versicolor for colour and phenolic removal of olive mill wastewater in the presence of 1-hydroxybenzotriazole " African Journal of Biotechnology 6(10), pp 1248-1254 89 Monod, M., S Capoccia, B Léchenne, C Zaugg, M Holdom and O Jousson (2002) "Secreted proteases from pathogenic fungi" Int J Med Microbiol 292, pp 405–419 90 Necochea, R., B Valderrama, S Diaz-Sandoval, J L Folch-Mallol, R VazquezDuhalt and G Iturriaga (2005) "Phylogenetic and biochemical characterisation of a recombinant laccase from Trametes versicolor" FEMS Microbiol Lett 244, pp 235-241 91 Nicotra, S., M R Cramarossa, A Mucci, U M Pagnoni, S Riva and L Forti (2004) "Biotransformation of resveratrol: synthesis of trans-dehydrodimers catalyzed by laccases from Myceliophtora thermophyla and from Trametes pubescens" Biocatalysts in Synthetic Organic Chemistry 60, pp 595-600 92 Nyanhongo, G S., J Gomes, G Gubitz, R Zvauya, J S Read and W Steiner (2002) "Production of laccase by a newly isolated strain of Trametes modesta" Bioresource Technology 84, pp 259-263 93 O’Callaghan, J., M M O’Brien, K McClean and A D W Dobson (2002) "Optimisation of the expression of a Trametes versicolor laccase gene in Pichia pastoris" Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 29, pp 55 - 59 94 O’Donnell, D., L Wang, J Xu, D Ridgway, T Gu and M Moo-Young (2001) "Enhanced heterologous protein production in Aspergillus niger through pH control of extracellular protease activity" Biochemical Engineering Journal 8, pp 187 - 193 100 95 Olivieri, G., A Marzocchella, P Salatino, P Giardina, G Cennamo and G Sannia (2006) "Olive mill wastewater remediation by means of Pleurotus ostreatus" Biochemical Engineering Journal 31, pp 180-187 96 Palmieri, G., P Giardina, C Bianco, A Scaloni, A Capasso and G Sannia (1997) "A novel white laccase from Pleurotus ostreatus" The Journal of Biological Chemistry 272, pp 31301-31307 97 Perry, C R., S E Matcham, D A Wood and C FThurston (1993) "The Structure of Laccase Protein and Its Synthesis by the Commercial Mushroom Agaricus bisporus" Journal of General Microbiology 139, pp 171-178 98 Pham, T A., J G Berrin, E Record, K A To and J.-C Sigoillot (2010 ) "Hydrolysis of softwood by Aspergillus mannanase: Role of a carbohydrate-binding module" Journal of Biotechnology 148, pp 163–170 99 Piscitelli, A., P Giardina, C Mazzoni and G Sannia (2005) "Recombinant expression of Pleurotus ostreatus laccases in Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae" Appl Microbiol Biotechnol 69, pp 428-439 100 Prosser, J I (1982) Growth of fungi Microbial Population Dynamics M J Bazin Boca Raton, CRC Press: 125-166 101 Record, E., P J Punt, M Chamkha, M Labat, C A M J J v d Hondel and M Asther (2002) "Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme" European Journal of Biochemistry 269, pp 602-609 102 Rose, S H and W H v Zyl (2008) "Exploitation of Aspergillus niger for the Heterologous Production of Cellulases and Hemicellulases" The Open Biotechnology Journal 2, pp 167-175 103 Ryan, D R., W D Leukes and S G Burton (2005) "Fungal bioremediation of phenolic wastewaters in an airlift reactor" Biotechnol Prog 21, pp 1068–1074 104 Sa´nchez, C s F n., T Tzanov, G M Gu¨bitz and A C Paulo (2002) "Voltammetric monitoring of laccase-catalysed mediated reactions" Bioelectrochemistry 58 pp 149 – 156 105 Saloheimo, M., M.-L Niku-Paavola and J Knowles (1991) "Isolation and structural analysis of the laccase gene from the lignin-degrading fungus Phelbia radiata" J Gen Microbiol 137, pp 1537-1544 106 Sankpal, N V., A P Joshi, I I Sutar and B D Kulkarni (1999) "Continuous production of gluconic acid by Aspergillus niger immobilized on a cellulosic support: study of low pH fermentative behaviour of Aspergillus niger" Process Biochemistry 35(34), pp 317 - 325 107 Sen, S and G N Demirer (2003) "Anaerobic treatment of real textile wastewater with a fluidized bed reactor" Water Research 37, pp 1868-1878 108 Sharma, R., M Katoch, P S Srivastava and G N Qazi (2009) "Approaches for refining heterologous protein production in filamentous fungi" World Journal of Microbiology and Biotechnology 25, pp 2083-2094 109 Shin, K S and C J Kim (1998) "Properties of laccase purified from nitrogen limited culture of white-rot fungus Coriolus hirsutus" Biotechnology Techniques 12(2), pp 101 104 101 110 Shleev, S V., O Morozova, O Nikitina, E S Gorshina, T Rusinova, V A Serezhenkov, D S Burbaev, I G Gazaryan and A I Yaropolov (2004) "Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes" Biochimie 86, pp 693-703 111 Soden, D M and A D W Dobson (2001) "Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajor-caju" Microbiology-Sgm 147, pp 1755-1763 112 Soden, D M., J O’Callaghan and A D W Dobson (2002) "Molecular cloning of a laccase isozyme gene from Pleurotus sajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host" Microbiology 148, pp 4003 - 4014 113 Srinivasan, C., T M Dsouza, K Boominathan and C A Reddy (1995) "Demonstration of laccase in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium Bkm-F1767" Applied and Environmental Microbiology 6, pp 4274-4277 114 Takemori, T., Y Ito, M Ito and M Yoshama (1992) "Flavor and taste improvement of cacao nib by enzymatic treatment" Japan Kokai Tokkyo Koho JP 04126037 A2, pp 115 Thakker, G D., C S Evans and K K Rao (1992) "Purification and characterisation of laccase from Monocillium indicum Saxena" Applied Microbiol Biotechnology 37, pp 321-323 116 Thiruchelvam, A T and J A Ramsay (2007) "Growth and laccase production kinetics of Trametes versicolor in a stirred tank reactor" Applied Microbiol Biotechnol 74, pp 547–554 117 Thurston, C F (1994) "The structure and function of fungal laccases." Microbiol 140, pp 19-26 118 Vandertol-Vanier, H A., R Vazquez-Duhalt, R Tinoco and M A Pickard (2002) "Enhanced activity by poly(ethylene glycol) modification of Coriolopsis gallica laccase" J Ind Microbiol Biotechnol 29, pp 214–220 119 Wang, G D., Q J Li, B Luo and X Y Chen (2004) "Explanta phytoremediation of trichlorophenol and phenolic allelo chemicals via an engineered secretory laccase" Nat Biotechnol 22, pp 893-897 120 Wang, L P., D Ridgway, T Y Gu and M Moo-Young (2005) "Bioprocessing strategies to improve heterologous protein production in filamentous fungal fermentations" Biotechnology Advances 23, pp 115-129 121 Wong, K K Y., K D Anderson and R P Kibblewhite (1999) "Effect of the laccasemediator system on the handsheet properties of two high kappa kraft pulps" Enzyme Microbiol Technol 25, pp 125-131 122 Xavier, A M R B (2007) "Trametes versicolor growth and laccase induction with by-products of pulp and paper industry" Electronic Journal of Biotechnology ISSN 10(3), pp 445 - 451 123 Xu, F (1996) "Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: Correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition" Biochemistry 35, pp 7608-7614 124 Xu, F., J J Kulys, K Duke, K Li, K Krikstopaitis, H W Deussen, E Abbate, V Galinyte and P Schneider (2000) "Redox Chemistry in Laccase-Catalyzed Oxidation of NHydroxy Compounds " Applied and Environmental of Microbiology 66, pp 2052-2056 102 125 Yaver, D S and E J Golightly (1996) "Cloning and characterization of three laccase genes from the white-rot basidiomycete Trametes villosa: genomic organization of the laccase gene family" Gene 181, pp 95–102 126 Yaver, D S., M J Overjero, F Xu, B A Nelson, K M Brown, T Halkier, S Bernauer, S H Brown and S Kauppinen (1999) "Molecular characterization of laccase genes from the basidiomycete Coprinus cinereus and heterologous expression of the laccase Lcc1" Applied and Environmental of Microbiology 65, pp 4943–4948 127 Yaver, D S., F Xu, E J Golightly, K M Brown, S H Brown, M W Rey, P Schneider, T Halkier, K Mondorf and H Dalbøge (1996) "Purification,characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa" Applied and Environmental of Microbiology 62, pp 834–841 128 Yoshida, H (1883) "Chemistry of lacquer (urushi)" Journal Chemical Soccien 43, pp 472–486 127 http://seq.yeastgenome.org/vectordb 103 PHỤ LỤC Phụ lục Mẫu phân lập (A) Mẫu bùn sở nhuộm Vạn Phúc (B) Mẫu bùn nhà máy giấy Vạn Điểm (C) Mẫu rơm mục Hà Tây Phụ lục Thành phần môi trường phân lập tuyển chọn nấm + MT1 (MEA – Môi trƣờng phân lập nấm)(g/l): Dịch chiết malt 20g, Chloramphenicol100mg, Agar 20g, H2O 1000ml,pH 6,5 + MT2(Basal – Môi trƣờng lỏng sinh tổng hợp laccase) (g/l): Glucose 10g; Asparagine 4g; MgSO4.7H2O 0,5g; CaCl2 0,1g; K2HPO4 0,6g; KH2PO4 0,5g; NaMoO4.2H2O 0,02mg; ZnCl2 2,5mg; CuSO4.5H2O0,4mg; MnCl2.H2O 0,09mg; H3BO3 0,07mg; FeCl3 1mg; Thiamine 0,1mg; Chloramphenicol100mg; Aga 20g; H2O 1000ml; pH 5,5 [TLTK] + MT3 (PDA – Môi trƣờng sinh tổng hợp laccase) (g/l): m mục Hà Tây of two laccase genes from +MT4 (g/l) – Môi trƣờng thu bào tử A niger D15#26lcc1: NaNO3 85mM; KCl 75mM; KH2PO4 136mM; MgSO4 1M; glucose 5%; agar 1% 1ml nguyên tố vi lƣợng (1000X bao gồm: ZnSO4 288 mM, H3BO4 62 mM, MnCl2 198 mM, FeSO4 278 mM, CoCl2 238 mM, CuSO4 250 mM, Na2MoO4 242 mM, EDTA 372 mM) pH + MT5 (g/l) – Môi trƣờng sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp : MgSO4 7H2O 0,05%; NaNO3 1%; KH2PO4 0.05%; glucose 2,5%; pepton 1%; CuSO4 0,075% 1ml nguyên tố vi lƣợng 1000X bao gồm: ZnSO4 288 mM; H3BO4 62 mM; MnCl2 198 mM; FeSO4 278 mM; CoCl2 238 mM; CuSO4 250 mM; Na2MoO4 242 mM; EDTA 372 mM) pH 104 Phụ lục Đồ thị đường chuẩn Tyrosine để xác định nồng độ protease phương pháp Anson cải tiến 0.45 y = 0.0827x - 0.0891 R² = 0.9925 0.4 0.35 OD 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.25 0.5 0.75 Nồng độ Tyrosine (mg/ml) 1.25 Phụ lục Đồ thị đường chuẩn glucose phương pháp DNS 1.4 y = 0.6112x + 0.0113 R² = 0.999 1.2 OD 540 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 1.5 Nồng độ glucose (mg/ml) 105 2.5 Phụ lục Đồ thị đường chuẩn BSA để xác protein phương pháp Lowry 0.4 y = 0.9651x + 0.0819 R² = 0.9915 0.35 0.3 OD 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Nồng độ BSA (mg/ml) 0.3 Phụ lục Kết phân tích phương sai mô hình (ANOVA) 106 0.35 Phụ lục Phương trình hồi quy biểu diễn phụ thuộc laccase tái tổ hợp vào yếu tố môi trường Phụ lục Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để biểu laccase tái tổ hợp 107 Phụ lục Đường chuẩn vanillin 0.35 y = 0.2527x + 0.0758 R² = 0.9684 0.3 OD 765 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ vanillin (mg/mL) 108 1.2 ... trên, tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp từ A niger D15#26lcc1 khảo sát khả ứng dụng” * Mục tiêu nghiên cứu: - Nghiên cứu kỹ thuật lên men laccase Trametes... công trình nghiên cứu kỹ thuật lên men thu nhận laccase tái tổ hợp T versicolor 06 biểu A niger D15#26lcc11.8B bao gồm lên men gián đoạn, lên men hai pha lên men bán liên tục, hoạt độ laccase tích... 25 1.4 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP LACCASE 25 1.4.1 Lên men gián đoạn 26 1.4.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed-batch) 27 1.4.3 Lên men liên tục