1/ Đặ t v ấ n đề : Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn, đang phát triển trên cơ sở các kó thuật mới mẻ: kó thuật di truyền, kó thuật dung hợp tế bào; kó thuật nuôi cấy mô; kó thuật nuôi cấy tế bào; kó thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu này đang chuẩn bò cho một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành kinh tế-kó thuật. Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng từ lâu bởi các nhà trồng hoa và các nhà chọn giống muốn nhân nhanh những giống đặc cấp, cải thiện hiệu quả của từng thời kì chọn lọc. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa những năm 70. Hiện nay, trong cả nước đã có vài chục phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào. Phần lớn các phòng thí nghiệm đang tiến hành những nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu là vi nhân giống trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn có những khả năng đóng góp cho nnhững nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong cải biến di truyền (chọn dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển gen) và trong công nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học. Đề tài “Các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật” giúp cho người viết có được những kiến thức cơ bản về nuôi cấy mô tế bào thực vật, về các hướng nghiên cứu và ứng dụng đã được tiến hành thành công tại các phòng thí nghiệm. 2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu : Đối tượng nghiên cứu: là mô và tế bào thực vật, thành phần môi trường và các chất kích thích sinh trưởng. Phạm vi nghiên cứu: chỉ đề cập đến các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. 3/ Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu được lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài. Mặc dù đề tài được chuẩn bò khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ suất, rất mong được sự góp ý của q thầy hướng dẫn và các bạn đồng nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn. 4/ Cấu trúc tiểu luận: Phần 1: Vi nhân giống in vitro. Phần 2: Tạo cây đơn bội và ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn. Phần 3: Chọn dòng tế bào thực vật. Phần 4: Dung hợp protoplast và lai tế bào sôma. Phần 5: Chuyển gen ở thực vật. Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở Việt Nam. - 1 - PHẦN MỞ ĐẦU DUNG MỤC LỤC Trang Phần mở đầu 1 Phần nội dung 3 Phần 1: Vi nhân giống in vitro………………………………………………………………………………………………… . 3 Phần 2: Tạo cây đơn bội và ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn………………. ………. 4 I. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo 4 1. Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy 4 2. Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro 4 II. Tái sinh cây 5 III.Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn .5 Phần 3: Chọn dòng tế bào thưcï vật…………………………………………………………………………………………… 6 I. Cơ sở khoa học 6 II. Vật liệu và phương pháp chọn dòng 7 III. Chọn dòng chòu bệnh .8 IV. Chọn dòng chống chòu các stress của môi trường 11 V. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao 13 Phần 4: Dung hợp protoplast và lai tế bào sôma………………………………………………………………… 15 I. Dung hợp protoplast và lai nhân .15 II. Lai tế bào chất .18 Phần 5: Chuyển gen ớ thực vật………………………………………………………………….………………………………….21 I. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật 21 II. Các phương pháp chuyển gen 22 1. Chuyển gen bằng Agrobacterium 22 2. Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus .23 3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp .23 4. Phương pháp bắn gen .23 5. Phương pháp vi tiêm .24 Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thưc vật ở Việt Nam…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 25 KẾT LUẬN ….27 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………………………………………………28 - 2 - . Phần 1: VI NHÂN GIỐNG IN VITRO. Vi nhân giống in vitro gọi tắt là vi nhân giống là hệ thống sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây. Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những quyết đònh sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình của D.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn đònh về di truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân. Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi trường thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng. Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây đònh nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp. Sự phát triển nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi được nhân lên sau 3 đến 4 tuần. Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển sang môi trường mới và qui trình cứ thế được lặp lại. Trong một số trường hợp, rễ có thể tạo ngay trên môi trường nhân, trong một số trường hợp khác, chồi nhân phải chuyển sang môi trường có auxin hoặc không có auxin để tạo rễ. Đây là phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bò thay đổi về mặt di truyền. Hiện nay nhờ phát triển những môi trường và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã được tăng lên nhiều (5 8 – 5 15 chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong môi trường lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor. Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưng thường kéo theo sự biến dò sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ những thay đổi về di truyền. Vi nhân giống có những ưu việt sau: -Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất. -Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m 2 nền có thể để được tới 18.000 cây. -Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các cây giống sạch bệnh. -Thuận tiện và là hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4 o C trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đền 95%. Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây. Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu cầu thực tiễn. - 3 - PHẦN NỘI DUNG Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân còn cao (2500 – 3000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật q hiếm và có giá trò kinh tế cao. Trên thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ hạt. Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa hồng, cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông…. Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây còn có thể rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai. Phần 2: TẠO CÂY ĐƠN BỘI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC TIỄN. Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoặc môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong quá trình nuôi cấy, hạt phấn phân chia, tạo mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây. I.Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo. 1.Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt phấn nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của Dunwell (1976) cho thấùy tỉ lệ phôi cao nhận được khi sử dụng những nụ hoa hình thành sớm và cây phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt phấn cao hơn. Ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấùn của các cây khoai tây nhò bội tạo từ cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ. Ngoài ra xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 – 10 o C) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs, 1977). 2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro. Thành phần cacbonhydrat trong môi trường hết sức quan trọng, đặc biệt là đường sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% đến 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến 6%, thậm chí 12%. Trong các chất hữu cơ, các axit như glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi ở một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá. Các dòch chiết tự nhiên như dòch chiết khoai tây, dòch chiết nấm và một số chất khác như vitamin C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn. Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhưng lại ức chế tạo phôi. Vì thế trong trường hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thường có tác dụng ở giai - 4 - đoạn nuôi cấy ban đầu. Cytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy. Trong một số ít trường hợp ethylen kích thích tạo mô sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch. Bổ sung vào môi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm tăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn. Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Đối với thuốc lá mật độ tối ưu là 10 5 hạt/ml môi trường. Đối với các cây khác mật độ dao động từ 10 4 đến 10 5 . nh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần 300-500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28 o C là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và hạt phấn của hầu hết các giống cây. II.Tái sinh cây. Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ, thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một số loài cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Một số trường hợp phải dùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh cây. Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang môi trường có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là BAP và kinetin. Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc. Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc thường có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngoài ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li- Ping, 1978). Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số loài cây có cả cây nhò bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhò bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy. III.Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn. Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghóa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệu để tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lương bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Như đã nói trên, ở một số lòai cây có thể nhận được cây nhò bội ngay trong quá trình nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn, nhưng trong trường hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lưỡng. Các dòng thuần có ý nghóa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng được sử dụng tạo các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) và - 5 - rút ngắn thời gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo được ứng dụng trong sản xuất lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa…. Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc lá cho năng suất cao và chất lượng tuyệt hảo đã được tạo ra bằng phương pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978). Nhiều giống lúa mới như Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã được tạo bằng phương pháp nuôi cấy hạt phán. Ngoài ra các dòng đơn bội kép còn được sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập bản đồ phân tử. Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các cặp NST, ngoài ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác đònh kiểu di truyền các tính trạng lặn. Các cây đơn bội còn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch. Cây đơn bội cũng được dùng trong lai khác lòai để rút ngắn thời gian ổn đònh về NST. Nuôi cấy bao phấn có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến. Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn Bao phấn hoặc Giống mới hạt phấn Nuôi cấy bao phấn Cây đơn bội Lưỡng bội hóa Cây lưỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng Phần 3: CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV). I.Cơ sở khoa học. Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính toàn năng. Mỗi loài thực vật có khả năng tái sinh khác nhau. Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng. Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghóa. Cũng như cây trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một - 6 - loại là kết quả của sự thay đổi gen, được gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại không liên quan đến thay đổi gen, được gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngoài gen không di truyền được. Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tượng phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào. Hiện tượng này gọi là hiện tượng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ tế bào nuôi cấy là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh từ protoplast là “protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) đưa ra một đònh nghóa có tính chất khái quát hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả những thay đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào. II.Vật liệu và phương pháp chọn dòng. Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể là tế bào cho đến các mô phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các phương pháp nuôi cấy đối với từng loại cây. Vật liệu thường dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mô sẹo được dùng để chọn các dòng chống chòu như chòu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chòu muối (McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986). Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phương pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên môi trường chọn lọc chứa một nồng độ nhất đònh của chất chọn lọc, các mô và tế bào đột biến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phương pháp chọn lọc từng bước tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất đònh của tác nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn. Ngoài ra cũng có thể sử dụng kết hợp cả hai phương pháp. Sự ổn đònh của mô chọn lọc là khả năng phát triển bình thường liên tục trên môi trường chọn lọc hoặc khi chuyển môi trường chọn lọc và sau một thời gian dài cấy trên môi trường không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã được chọn lọc. Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm là đơn giản nhưng nguyên liệu này có một số nhược điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mô chọn lọc còn có nhiều tế bào bình thường nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây mang đặc điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong một cây có thể có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình thường. Để khắc phục nhược điểm này có thể giảm kích thước của mô: mô càng nhỏ càng tốt. Trọng lượng mô thường dùng là 100-150 mg, nhưng có thể giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987). Tế bào nuôi cấy dòch lỏng đã được nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV (Kishinami & Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phương pháp chọn lọc trực tiếp và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tượng. Sử dụng tế bào dòch lỏng để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào được tiếp xúc đồng đều với tác nhân chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả năng tái sinh cây bò giảm đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể - 7 - mất hẳn. Hầu hết các dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dòch lỏng đều không nhận đïc cây (Dix, 1990). Vì thế hệ thống tế bào dòch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng có khả năng tổng hợp và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trường hợp này thì tế bào dòch lỏng đáp ứng được mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp. Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt trong CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát triển đồng đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được hiện tượng khảm. Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã được chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast. Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghóa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bò hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã được công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu lý tưởng cho CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tượng quan trọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế bào và chuyển gen. Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dòch lỏng và protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu CDTBTV. Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phôi từ hạt (Kueh & Bright, 1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs (1985) đã chọn được dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs (1989) cũng nhận được dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá. Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo , tế bào dòch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để làm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi tách bằng tia cực tím (UV) hoặc N-methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG). Phương pháp tương tự cũng được một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng. N-ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981). Ngoài ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất gây đột biến trước khi đưa vào nuôi cấy và chọn lọc. III.Chọn dòng chòu bệnh: Mặc dù phương pháp truyền thống có thể tạo được các dòng hoặc giống chòu bệnh nhưng trong một vài trường hợp không thể chọn được các dòng chòu bệnh bằng những phương pháp này hoặc chọn được nhưng tốn nhiều công sức và thời gian. Việc gây nhiễm bệnh nhân tạo cho một số lượng lớn cây để tạo chọn giống chòu bệnh là cả một vấn đề, ngoài ra gây nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công. Không những thế bằng phương pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùng một loại bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai - 8 - ngược mất rất nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển được các gen lặn hoặc nhiều gen một lúc. Đặc biệt đối với các loài cây chỉ nhân vô tính thì chuyển gen không thể thực hiện được bằng lai tạo. Đột biến thực nghiệâm có thể tạo được giống cây chòu bệnh nhưng tần số xuất hiện các đột biến đơn gen rất thấp (10 -4 – 10 -6 ), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tương đối cao. Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc phục được nhiều vấn đề trong chọn dòng chòu bệnh như: qui mô thí nghiệm, thời gian chọn lọc, khống chế được điều kiện gây nhiễm. Ngoài ra có thể nhận được các đột biến đơn gen và đột biến lặn. Nếu tần số đột biến đơn gen trong trường hợp đột biến thực nghiệm là 10 -4 – 10 -6 thì ở quần thể cây tái sinh (R o ) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981). Tuy nhiên chọn dòng chòu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần nghiên cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng lây nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh). Để chọn dòng chòu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc tố gây bệnh (ĐTGB). Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm là protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bò nhiễm đồng đều và phân biệt được tế bào chòu bệnh với tế bào không bò nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển trên cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bò lây nhiễm liên tục, sau đó nuôi vấy và chọn lọc. Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào sạch virus sinh trưởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh trưởng chậm hơn và có màu vàng. Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae (Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs, 1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs, 1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chòu bệnh. Prasad và cs (1984) đã chọn được dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương bằng phương pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bò nhiễm nấm. Sun & cs (1986) đã nuôi mô sẹo từ phôi lúa cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn được các dòng kháng bệnh. Một số tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô trong điều kiện in vitro và nhận được những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung & cs, 1987). Ngoài ra có thể đưa các cây tái sinh từ mô hoặc tế bào trồng trên đất bò nhiễm nấm, nhưng hướng này chưa được tiến hành nhiều. - 9 - Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã được dùng nhiều trong chọn dòng chòu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dòng có ưu điểm là các tế bào có thể bò nhiễm đồng đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế có thể sử dụng các nguyên liệu một cách đa dạng. Ngoài ra còn có sự tương quan thuận giữa kháng ĐTGB trong điều kiện in vitro và in vivo. Chọn các dòng kháng ĐTGB đã được tiến hành thành công đối với protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dòch lỏng (Connell & Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey, 1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985). Sử dụng ĐTGB đối với tế bào còn mở ra nhiều triển vọng chọn được các đột biến kháng bệnh hiếm (Carlson, 1973). Bên cạnh những ưu điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chòu bệnh cần lưu ý một số vấn đề như xác đònh cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiều trường hợp cây bò bệnh nhưng không phát hiện có độc tố hoặc xác đònh được trong cây có độc tố gây bệnh nhưng độc tố lại không có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983). Một vấn đề nữa là trong nhiều trường hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại không có khả năng kháng bệnh. Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù có những đặc điểm có thể không thể hiện ở cây tái sinh, nhưng nếu ta tái sinh được số lượng cây nhiều đến mức cần thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm mong đợi. Điều này đã được khẳng đònh bằng công trình của Thanutong & cs (1983). Các tác giả đã nhận được 10-20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria. ĐTGB dùng trong chọn dòng chòu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết. ĐTGB thô dưới dạng dòch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn được sử dụng nhiều để chọn dòng chòu bệnh. Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã được công bố khi sử dụng ĐTGB thô như khoai tây kháng P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã nhận được dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên. Ngoài phương pháp chọn dòng chòu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào, mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể chọn được dòng chòu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chòu bệnh theo phương pháp này. Giống mía chòu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và giống lhoai lang “Sarlet” chòu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã được chọn và đưa vào sản xuất. Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo hướng này có nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các giống chòu bệnh đïc đưa vào sản xuất nhưng có một số mặt hạn chế của phương pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh trong điều - 10 - [...]... của công nghệ sinh học, Khoa học phổ thông, Xuân 1997 7 Nguyễn Như Khanh, 2006: Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục 8 Trần Thế Thông: Công nghệ sinh học với nông nghiệp, Khoa học phổ thông, Xuân 1997 9 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006: Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục 10 Công nghệ sinh nghesinhhoc/chuong15 học : http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/cong 11 Tạp chí sinh học, tập... 1994: Công nghệ gen và Công nghệ sinh học ứng dụng trong y dược học hiện đại, NXB Y học 2 Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật 3 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục 4 Lê Đình Lương, 2001: Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật 5 Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Nông nghiệp 6 Nguyễn Lân Dũng: Thế kỷ 21- thế kỷ vàng của công. .. có ý nghóa trong nông nghiệp, công nghiệp và y học Đặc biệt là sự phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố đỏ và chất diệt khuẩn Shikonin ở Nhật (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng công nghiệp hoá việc thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy Viện Công nghệ sinh học Canada và các phòng nghiên cứu của hãng Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine... tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thò Xuân, 1988; Phan Thò Bảy và cs, 1995) - 26 - KẾT LUẬN Tóm lại, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật có những ưu điểm : -Tạo được hàng loạt cá thể phù hợp, giữ nguyên được tính trạng của cây mẹ -Rút ngắn rõ rệt thời gian chọn giống -Tái sinh, phục chế được các giống cây q bò nhiễm... -Tái sinh cây biến nạp -Chứng minh sự có mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh - 21 - Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học của hệ thống chuyển gen như : -Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng -Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genôm -Mô thực vật là hỗn hợp các... thành công bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào 1978 (Lê Thò Muội và cs, 1978; Lê Thò Xuân và cs, 1978) Tiếp đó là thành công về nuôi cấy protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thò Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thò Muội, 1980, 1981) Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh và muộn hơn nữa là tại Đại học Nông nghiệp 1 (ĐHNN1), Hà Nội và viện Khoa học. .. trung ương /RQTƯ) mà cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Nghệ Tónh, Cần Thơ, ) Từ giữa những năm 80 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển mạnh Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lónh vục nhân giống khoai tây (Viện công nghệ sinh học/ CNSH, ĐHNN1, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNN1, viện DTNN, viện KHKTNNVN,... một năm và chỉ cần có một cây hồng gốc, so với phương pháp cũ như giâm cành thì người đó chỉ có thể sản xuất được tối đa 50 cây mà thôi Như vậy, với công nghệ mới này năng suất của người công nhân nông nghiệp đã tăng lên 2.500 lần- không có lónh vực kó nghệ nào có thể sánh nổi Kó thuật sản xuất giống trong phòng thí nghiệm còn là biện pháp hữu hiệu để xây dựng những chương trình chọn lọc tối ưu Kó thuật... sự thể hiện của gen biến nạp sau khi xử lý tế bào và ở cây tái sinh Phần 6: SỰ PHÁT TRIỂN VÀ THÀNH TỰU CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975) Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào đầu tiên được xây dựng tại viện Sinh học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) do tiến só Lê Thò Muội đứng đầu - 25 - Bước... hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine sử dụng trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell Report, 1989) Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm Các chất này rất khó tổng hợp và hiện nay nguồn cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng nguồn cung cấp hoặc . 1/ Đặ t v ấ n đề : Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn, đang phát triển trên cơ sở các kó thuật mới. (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng công nghiệp hoá việc thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy. Viện Công nghệ sinh học Canada và các phòng nghiên cứu