BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CÁC GEN nrLSU VÀ ATP6 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT GVHD: SVTH: MSSV: Khóa: ThS Lao Đức Thuận CN Vũ Tiến Luyện Nguyễn Thị Bích Thảo 1153010755 2011-2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi tới thầy Lao Đức Thuận anh Vũ Tiến Luyện - người tận tình, kiên nhẫn quan tâm hướng dẫn em suốt trình làm đề tài để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Người tạo điều kiện cho em học tập, trau dồi kiến thức rút nhiều học khoảng thời gian vừa qua Em xin cảm ơn bạn nhóm đề tài tập thể phòng thí nghiệm sinh học phân tử, trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh giúp đỡ, tạo điều kiện suốt thời gian thực đề tài Trên hết, xin cảm ơn bố mẹ gia đình yêu thương giúp đỡ Bình Dương, ngày 05 tháng 05 năm 2015 Danh mục bảng biểu Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng phản ứng PCR Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bảng 3.1 Các đặc tính vật lý mồi LR0R/LR5 ATP6-C1A/ATP6-C2A Bảng 3.2 Thông tin trình tự tham chiếu dùng để xây dựng liệu vùng trình tự nrLSU Atp6 Bảng 3.3 Kết kiểm tra DNA quang phổ kế khảo sát mẫu nấm ký sinh côn trùng tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform Bảng 3.4 Kết kiểm tra DNA quang phổ kế khảo sát mẫu nấm ký sinh côn trùng tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform bổ sung β-mercaptoethanol CTAB Bảng 3.5 Hiệu chỉnh nucleotide vị trí (1) đến (10) Bảng 3.6 Tổng hợp kết hiệu chỉnh trình tự mẫu nấm ký sinh côn trùng Bảng 3.7 Kết chiều dài trình tự trước sau hiệu chỉnh Bảng 3.8 Kết thông số mô hình tiến hóa tốt Bảng 3.9 Tổng hợp kết định danh mẫu nấm từ liệu phân tử hình thái Danh mục hình ảnh Hình 1.1 Cordyceps sinensis Hình 1.2 Cấu trúc rDNA Hình 1.3 Vị trí mồi khuếch đại gen nrLSU Hình 2.1 Hình thái giải phẫu nấm mẫu DL004 Hình 2.2 Hình thái giải phẫu nấm mẫu DL0075 Hình 2.3 Hình thái nấm mẫu DL0077 Hình 3.1 Vị trí mồi xuôi ATP6-C1A gióng cột với trình tự gen Atp6 Hình 3.2 Vị trí mồi ngược ATP6-C2A gióng cột với trình tự gen Atp6 Hình 3.3 Kết gióng cột mồi xuôi LR0R với trình tự gen nrLSU Hình 3.4 Kết gióng cột mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU Hình 3.5 Kết Annhyb cặp mồi ATP6-C1A ATP6-C2A trình tự gen Atp6 Hình 3.6 Kết Annhyb cặp mồi LR0R LR5 trình tự gen nrLSU Hình 3.7 Kết kiểm tra mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A BLAST GenBank Hình 3.8 Kết kiểm tra mồi LR0R/LR5 BLAST GenBank Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu DL004, DL0075, DL0077 với cặp mồi LR0R/LR5 tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu DL004, DL0075, DL0077 với cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi LR0R/LR5 theo phương pháp Phenol:Chloroform có sử dụng β - mercaptoethanol CTAB Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A theo phương pháp Phenol:Chloroform có sử dụng β - mercaptoethanol CTAB Hình 3.13 Trình tự DNA mạch xuôi ngược chưa hiệu chỉnh gen Atp6 giao diện Chromas lite Hình 3.14 Mô tả sai khác mucleotide hai mạch xuôi ngược gen Atp6 Hình 3.15 Vị trí sai lệch hai kết giải trình tự đầu mạch xuôi Atp6 Hình 3.16 Kết BLAST trình tự gen Atp6 mạch xuôi hiệu chỉnh Hình 3.17 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU xây dựng phương pháp Maximum Likelihood với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại NJ/MP/ML) Hình 3.18 Cây phả hệ phân tử gen Atp6 xây dựng phương pháp Maximum Likelihood với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại NJ/MP/ML) Hình 3.19 Cây phả hệ phân tử gen nrLSU-Atp6 xây dựng phương pháp Maximum Likelihood với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại, NJ/MP/ML) Danh mục chữ viết tắt ATP: Adenosine triphosphate BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Bp: Base-pair Nu: Nucleotide DNA: Deoxyribonucleotide triphosphate RNA: Ribonucleic acid ITS: Internal transcribed spacer SSU: Small subunit LSU: Large subunit MP: Maximum parsimony ML: Maximum likelihood NJ: Neighbor-joining rDNA: Ribosomal DNA CTAB: Cetyl Trimethylammonium Bromide MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1.1.1 Đặc điểm chung .3 1.1.2 Sự phân bố thành phần loài 1.1.3 Ứng dụng nấm Cordyceps 1.2 NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI 1.2.1 Đặc điểm nhận dạng định danh 1.2.2 Định danh phân tử 1.2.3 Gen MT-Atp6 (Mitochondrially encoded ATP synthase 6) 1.2.4 DNA ribosome gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit) 1.3 TÁCH CHIẾT DNA VÀ KỸ THUẬT PCR 11 1.3.1 Tách chiết DNA 11 1.3.2 Kỹ thuật PCR 12 1.3.3 Giải trình tự 12 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC .13 1.5 PHẢ HỆ PHÂN TỬ[11] 15 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1.1 Phần mềm khảo sát in silico 20 2.1.2 Vật liệu sử dụng thực nghiệm 20 2.2 TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 23 2.2.1 Khai thác thu thập tài liệu 24 2.2.2 Khảo sát in silico 24 2.2.3 Thực nghiệm 25 2.2.4 Giải trình tự 28 2.2.5 Hiệu chỉnh trình tự .28 2.2.6 Xây dựng phát sinh loài phần mềm MEGA6.0 28 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỒI 30 3.2 CƠ SỞ DỮ LIỆU CỤC BỘ TRÌNH TỰ nrLSU VÀ ATP6 NHÓM NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 38 3.3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 44 3.4 KẾT QUẢ HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ 47 3.5 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 52 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 60 4.2 ĐỀ NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Cordyceps nấm ký sinh côn trùng biết đến sử dụng phổ biến thuốc cổ truyền Trung Quốc kể nước Châu Á Đại diện tiêu biểu chi Cordyceps sinensis, chứa chất có hoạt tính cao ứng dụng y dược kháng khối u, đáp ứng miễn dịch, chống oxi hóa, chống tăng đường huyết, hiệu bảo vệ thận, nâng cao hoạt động tình dục sinh sản,… Chi nấm Cordyceps có 400 loài phát Trong đó, chúng định danh chủ yếu phương pháp truyền thống thông qua định danh hình thái gồm đặc tính: thể, sinh bào tử, hình thái sinh sản… Tuy nhiên, việc định danh hình thái chi Cordyceps gặp nhiều khó khăn hạn chế việc phân loại, chi Cordyceps có thành phần loài phong phú Đặc biệt, nhóm tồn hình thức sinh sản vô tính hữu tính Ngoài ra, kiểu hình chi Cordyceps bị ảnh hưởng điều kiện môi trường khác tạo nên dị hình thái dễ nhầm lẫn cho nhà nấm học phân loại Trong năm gần đây, tiến sinh học phân tử ứng dụng tin sinh học, đóng góp nhiều cho việc giải khó khăn Chẳng hạn việc sử dụng gen thuộc nhóm gen giữ nhà (house-keeping gen) để xây dựng phát sinh loài mang lại hiệu (Sung et al., 2007) Trong đó, gen nrLSU-rRNA mã hóa RNA 25S-28S ribosome (tiểu phần lớn ribosome) có nhiều vùng bảo tồn đa dạng Ngoài ra, nrLSU-rRNA bao gồm vùng domain D1, D2, D3, gọi vùng biến động (D-divergence region) chứa nhiều thông tin truyền, có độ bảo tồn cao khuếch đại cặp mồi phổ quát thích hợp cho nghiên cứu cấp độ loài chí vượt qua mức độ loài Hơn nữa, nrLSU-rRNA coi thị phân tử (marker) để phân loại xác định tên loài phạm vi rộng Cùng với gen Atp6 mã hóa cho enzym ATPase ty thể tiểu phần số phức hợp F1-F0 ATPase Mà ATPase enzyme có vai trò quan trọng tham gia vào trình tạo ATP từ ADP ty thể, với diện kênh gradient Trang proton qua màng, tạo tổ hợp vận chuyển điện tử chuỗi hô hấp, cung cấp lượng cho tế bào sử dụng Vì vậy, kết hợp gen ribosome nrLSU (Artjariyasripong et al., 2001, Sung et al., 2001, Stensrud et al., 2005) với gen Atp6 giúp cải thiện khả phân nhánh phát sinh loài (Sung et al., 2007) dẫn đến tăng thêm mức độ xác việc định danh loài Nên gen nrLSU Atp6 gen mục tiêu sử dụng nghiên cứu phát sinh loài để tìm độ tương quan mức độ di truyền loài Xuất phát từ vấn đề đề xuất đề tài: “Hỗ trợ định danh mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa phân tích phát sinh chủng loài gen nrLSU Atp6” Trang 49 Yang Z., Rannala B., 2012, „Molecular phylogenetics: principles and practice‟, Nature reviews, 303 - 314 50 Zhou X., Gong Z., Su Y., Lin J., Tang K., 2008, „Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products‟, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 279 - 291 Website 51 http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MT-ATP6 52 http://sites.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm 53 http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR 54 http://vi.wikipedia.org/wiki/Ribosome 55 http://www.bioinformatics.org/sms/iupac.html 56 http://www.biology-online.org/dictionary/Housekeeping_genes 57 http://www.clarku.edu/faculty/dhibbett/protocols_folder/primers/primers.htm 58 http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MT-ATP6 59 http://www.my-immunity.com/cordyceps.html 60 http://www.scbt.com/datasheet-202966-b-mercaptoethanol.html 61 www.applichem.com Trang 66 PHỤ LỤC Hình 3.20 Cây phả hệ phân tử cục gen nrLSU đƣợc xây dựng phƣơng pháp Neighbor Joining với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.21 Cây phả hệ phân tử cục gen nrLSU đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Parsimony với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.22 Cây phả hệ phân tử cục gen nrLSU đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Likelihood với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.23 Cây phả hệ phân tử cục gen Atp6 đƣợc xây dựng phƣơng pháp Neighbor Joining với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.24 Cây phả hệ phân tử cục gen Atp6 đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Parsimony với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.25 Cây phả hệ phân tử cục gen Atp6 đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Likelihood với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.26 Cây phả hệ phân tử cục gen nrLSU-Atp6 đƣợc xây dựng phƣơng pháp Neighbor Joining với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.27 Cây phả hệ phân tử cục gen nrLSU-Atp6 đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Parsimony với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) Hình 3.28 Cây phả hệ phân tử cục gen nrLSU-Atp6 đƣợc xây dựng phƣơng pháp Maximum Likelihood với sở liệu (Các số hiển thị giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại) ... ký sinh côn trùng dựa phân tích phát sinh chủng loài gen nrLSU Atp6 Trang PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1.1.1 Đặc điểm chung Cordyceps nấm ký sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi... việc định danh loài Nên gen nrLSU Atp6 gen mục tiêu sử dụng nghiên cứu phát sinh loài để tìm độ tương quan mức độ di truyền loài Xuất phát từ vấn đề đề xuất đề tài: Hỗ trợ định danh mẫu nấm ký sinh. .. việc định danh loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng số nấm khác với loài sinh vật khác với phạm vi rộng rãi[43][44] Hơn nữa, định danh phân tử có vai trò quan trọng hỗ trợ cho phương pháp định