BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN LDLR VÀ ApoB CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CĨ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ CBHD: PGS TS Lê Huyền Ái Thúy SVTH: Nguyễn Thanh Duy MSSV: 1153010123 Khóa: 2011 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN LDLR VÀ ApoB CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CĨ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ CBHD: PGS TS Lê Huyền Ái Thúy SVTH: Nguyễn Thanh Duy MSSV: 1153010123 Khóa: 2011 GVHD ký xác nhận: ……………………… Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! LỜI CẢM ƠN ! Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại học Mở TP.HCM tận tình dạy bảo em năm vừa qua Đồng thời, Quý Thầy Cô người truyền đạt kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời Đặc biệt này, em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới PGS TS Lê Huyền Ái Thuý ThS Trương Kim Phượng người tận tình hướng nghiên cứu, hướng dẫn, quan tâm, động viên giúp đỡ bước em trình thực chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp Em xin chân thành cảm ơn ThS Lao Đức Thuận tạo điều kiện cho em thực chuyên đề Khóa Luận Tốt Nghiệp phịng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường Đại học Mở TP.HCM Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán Khoa Xét Nghiệm số khoa khác Bệnh Viện Đa Khoa Xuyên Á Các bác, anh chị người hết lòng hỗ trợ em trình thu thập mẫu bệnh phẩm bệnh viện Cũng dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến bạn em phịng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử hết lịng giúp đỡ em thực chun đề Khố Luận Tốt Nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình người thân đặc biệt bố mẹ em Mọi người dõi theo, ủng hộ, quan tâm động viên em nhiều trình thực chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp Sinh viên Nguyễn Thanh Duy ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang ii Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ! A Adenine ApoA Apolipoprotein A ApoB – 100 Apolipoprotein B 100 ApoB – 48 Apolipoprotein B 48 ApoB Apolipoprotein B ApoC Apolipoprotein C ApoE Apolipoprotein E ARMS Amplification-Refractory Mutation System AS - PCR Allele - Specific PCR BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp base pair C Cytosine CHD Coronary Heart Disease DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein EtBr Ethidium Bromide FDB Familial Defective Apolipoprotein B FH Familial Hypercholesterolemia G Guanidine HDL - C High Density Lipoprotein Cholesterol HDL High Density Lipoprotein Hex Analysis Heteroduplex Analysis Hex SSCP Heteroduplex Single - Strand Conformation Polymorphism IDL Intermediate – Density Lipoproteins IDOL Inducible Degrader of the LDLR IDT Integrated DNA Technologies SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang iii Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! kbp kilo base pair kDa kilodalton LDL – C Low Density Lipoprotein Cholesterol LDL Low Density Lipoprotein LDLR Low Density Lipoprotein Receptor LDLRAP1 LDLR Adaptor Protein LXR Liver X Receptor MLPA Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplification NCBI National Center Biotechnology Information NIH National Institutes of Health NST Nhiễm Sắc Thể OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PCSK9 Proprotein Convertase Subtilin/Kexin PSM PCR-mediated Site - directed Mutagenesis RE Restriction Enzymes RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms SDS Sodium Dodecyl Sulfate SRE Steroid Response Element SREBP Steroid Response Element Binding Protein SSCP Single Strand Conformation Polymorphism T Thymine TAE Tris - acetate - EDTA TE Tris - EDTA TGGE Temperature Gradient Gel Electrophoresis Tm Melting Temperature VLDL Very Low Density Lipoprotein WHO World Health Organization SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang iv Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! DANH MỤC BẢNG ! Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi LDLR 20 Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi LDLR 21 Bảng II.3 Thành phần phản ứng PCR với mồi ApoB 21 Bảng II.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với mồi ApoB 21 Bảng III.1 Số lượng báo khoa học thu thập 25 Bảng III.2 Số dạng đột biến/loại đột biến gen LDLR 26 Bảng III.3 Số lượng đột biến điểm thuộc gen LDLR Châu Lục 27 Bảng III.4 Số lượng đột biến exon thuộc gen LDLR 29 Bảng III.5 Các phương pháp phát đột biến điểm gen LDLR 31 Bảng III.6 Số lượng cơng trình nghiên cứu dạng đột biến gen ApoB 32 Bảng III.7 Số lượng dạng đột biến thuộc gen ApoB Châu Lục 33 Bảng III.8 Số lượng đột biến exon gen ApoB 34 Bảng III.9 Các phương pháp phát đột biến gen ApoB 36 Bảng III.10 Thông tin cặp mồi LDLR 37 Bảng III.11 Thông tin thông số vật lý cặp mồi LDLR_F LDLR_R 42 Bảng III.12 Thông tin hệ mồi ApoB 44 Bảng III.13 Thông tin thông số vật lý mồi ApoB_F, ApoB_R1 ApoB_R2 52 Bảng III.14 Chỉ số đo OD mẫu huyết tương sau tách chiết 53 Bảng III.15 Kết đột biến phát exon gen LDLR số mẫu bệnh phẩm 55 Bảng III.16 Kết phân tích đột biến R3500Q gen ApoB số mẫu bệnh phẩm 59 Bảng III.17 Chỉ số sinh hóa số mẫu bệnh phẩm xuất đột biến gen LDLR ApoB 59! ! ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang v Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! DANH MỤC HÌNH ! Hình I.1 Cấu trúc hố học cholesterol [75] Hình I.2 Cấu trúc lipoprotein [30] Hình I.3 Một số apolipoprotein bề mặt lipoprotein [72] Hình I.4 Vị trí gen LDLR nhiễm sắc thể số 19 [74] Hình I.5 Các vùng chức thụ thể LDLR [5] Hình I.6 Vị trí gen ApoB nhiễm sắc thể số [73] 10 Hình I.7 Tỷ lệ phân bố số lượng đột biến theo exon gen LDLR [76] 11 Hình III.1 Số dạng đột biến/loại đột biến gen LDLR 27 Hình III.2 Số lượng đột biến điểm thuộc gen LDLR Châu Lục 28 Hình III.3 Số lượng đột biến exon thuộc gen LDLR 30 Hình III.4 Các phương pháp phát đột biến điểm gen LDLR 31 Hình III.5 Số lượng cơng trình nghiên cứu đột biến gen ApoB 33 Hình III.6 Số lượng dạng đột biến gen ApoB Châu Lục 34 Hình III.7 Số lượng đột biến exon gen ApoB 35 Hình III.8 Các phương pháp phát đột biến điểm gen ApoB 36 Hình III.9 Kết khảo sát mồi LDLR_F công cụ BLAST NCBI 38 Hình III.10 Kết khảo sát mồi LDLR_R công cụ BLAST NCBI 39 Hình III.11 Kết khảo sát mồi LDLR_F chương trình Annhyb 40 Hình III.12 Kết khảo sát mồi LDLR_R chương trình Annhyb 41 Hình III.13 Vị trí bắt cặp LDLR_F LDLR_R gen NG_009060.1 41 Hình III.14 Kích thước sản phẩm cặp mồi LDLR_F LDLR_R 42 Hình III.15 Kết khảo sát mồi ApoB_F cơng cụ BLAST NCBI 45 Hình III.16 Kết khảo sát mồi ApoB_R1 công cụ BLAST NCBI 46 Hình III.17 Kết khảo sát mồi ApoB_R2 cơng cụ BLAST NCBI 47 Hình III.18 Kết khảo sát mồi ApoB_F chương trình Annhyb 48 Hình III.19 Kết khảo sát mồi ApoB_R1 chương trình Annhyb 49 Hình III.20 Vị trí bắt cặp ApoB_F ApoB_R1 gen FJ525873.1 49 Hình III.21 Kích thước sản phẩm cặp mồi ApoB_F ApoB_R1 50 Hình III.22 Kết khảo sát mồi ApoB_R2 chương trình Annhyb 50 Hình III.23 Vị trí bắt cặp ApoB_F ApoB_R2 gen FJ525873.1 51 Hình III.24 Kích thước sản phẩm cặp mồi ApoB_F ApoB_R2 51 Hình III.25 Kết điện di sản phẩm PCR gen LDLR 54 Hình III.26 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi khuếch đại allele hoang dại số mẫu bệnh phẩm 57 Hình III.27 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi khuếch đại allele đột biến số mẫu bệnh phẩm 58 ! ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang vi Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC BẢNG .V DANH MỤC HÌNH VI MỤC LỤC VII ĐẶT VẤN ĐỀ IX I TỔNG QUAN I.1 TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL I.1.1 Định nghĩa I.1.2 Vai trò cholesterol thể I.1.3 Điều hoà cholesterol thể I.1.4 Phân tử vận chuyển cholesterol máu (Lipoprotein) I.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) I.2.1 Bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình I.2.2 Nguyên nhân I.3 TỔNG QUAN VỀ GEN LDLR VÀ PROTEIN LDLR I.3.1 Vị trí gen I.3.2 Chức protein LDLR I.3.3 Rối loạn chức protein LDLR I.4 TỔNG QUAN VỀ GEN APOB VÀ PROTEIN APOB I.4.1 Vị trí gen I.4.2 Chức protein ApoB 10 I.4.3 Rối loạn chức protein ApoB 10 I.5 CÁC DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR VÀ APOB 11 I.5.1 Đột biến gen LDLR 11 I.5.2 Đột biến gen ApoB 12 I.6 MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR VÀ APOB 12 I.6.1 Phương pháp giải trình tự (Sequencing) 12 I.6.2 Phương pháp phân biệt tính đa hình cấu hình sợi đơn DNA (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) 12 I.6.3 Phương pháp điện di gel biến tính (Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis, DGGE) 13 I.6.4 Phương pháp Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplifications (MPLA) 13 I.6.5 Phương pháp phân biệt tính đa hình dựa vào chiều dài giới hạn đoạn DNA tương đồng (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) 13 I.6.6 Phương pháp Southern Blot 13 SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang vii Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! I.6.7 Phương pháp Allele – Specific PCR (AS – PCR) 14 I.7 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU NỔI BẬT VỀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CĨ TÍNH GIA ĐÌNH 14 II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 II.1 VẬT LIỆU 17 II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 II.2.1 Khai thác liệu 17 II.2.2 Khảo sát in silico 17 II.2.3 Khảo sát thực nghiệm 17 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU 25 III.1.1 Gen LDLR 26 III.1.2 Gen ApoB 32 III.2 KHẢO SÁT IN SILICO 37 III.2.1 Gen LDLR 37 III.2.2 Gen ApoB 43 III.3 KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM 53 III.3.1 Tách chiết DNA gen người 53 III.3.2 Phản ứng PCR giải trình tự exon gen LDLR 53 III.3.3 Phân tích đột biến điểm gen LDLR 54 III.3.4 Phản ứng AS – PCR kết hợp giải trình tự phát đột biến R3500Q gen ApoB 57 III.3.5 Phân tích kết đột biến R3500Q gen ApoB 58 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 IV.1 KẾT LUẬN 62 IV.2 ĐỀ NGHỊ 63 V TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 VI PHỤ LỤC 75 PHỤ LỤC – THÔNG TIN MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM 76 PHỤ LỤC – MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR 77 PHỤ LỤC – MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN APOB 85 PHỤ LỤC – KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ EXON TRÊN GEN LDLR Ở MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM 86 PHỤ LỤC – KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ALLELE ĐỘT BIẾN R3500Q TRÊN GEN APOB TRÊN MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM 90! ! ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang viii Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015 ! ĐẶT VẤN ĐỀ ! Bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia, FH) dạng bệnh lý có tính chất di truyền trội nhiễm sắc thể thường (Palacios cộng sự, 2012) Bệnh FH với tính chất tăng bất thường hàm lượng cholesterol máu, dẫn đến tăng nguy mắc bệnh lý khác: bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease, CHD), nhồi máu tim, đột quỵ, gan nhiễm mỡ (Alves cộng sự, 2010; Sun cộng sự, 2005) Theo báo cáo tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO, 2008) tình hình cao cholesterol, tỷ lệ người trưởng thành có số hàm lượng cholesterol cao giới 39% Tại Đông Nam Á, tỉ lệ cao cholesterol nam nữ 29% (WHO, 2008) Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH thay đổi tính chất di truyền (đột biến điểm) gen có chức trình điều hịa lượng cholesterol máu (LDLR, ApoB, PCSK9, LDLRAP1), chế độ dinh dưỡng (chế độ ăn chứa nhiều lipid)… (Soufi cộng sự, 2004; Martra cộng sự, 2012) Nguyên nhân chủ yếu đột biến điểm gen điển hình: LDLR ApoB (Marduel cộng sự, 2010) Hiện nay, giới có nhiều cơng trình điển hình theo hướng nghiên cứu xác định đột biến điểm gen LDLR ApoB dựa vào kỹ thuật PCR giải trình tự, AS - PCR (Brown cộng sự, 1986; Innerarity cộng sự, 1987; Abifadel cộng sự, 2003)… Tuy nhiên, Việt Nam có cơng trình nghiên cứu tính chất đột biến gen LDLR ApoB Nhằm mục đích tìm hiểu thơng tin xác định rõ nét tính chất đột biến điểm gen LDLR ApoB bệnh nhân mắc bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình Việt Nam, cụ thể khu vực Thành phố Hồ Chí Minh Chúng tơi thực chun đề Khố Luận Tốt Nghiệp “Khảo sát tính chất đột biến điểm gen LDLR ApoB bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia, FH) phương pháp PCR kết hợp giải trình tự” SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang ix Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! PHỤ LỤC – MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Tên Đột Biến Protein G(−2)R W-12R G20R M(-42)L W(-39)X G(-41)R Q(-9)X C5W Q12X Q14X W44X D57N E31K A50S E(-11)X Fs(-4)ter9 C27W A29S F11S FsS44:D108X FsV45:D108X E80X Q81X C68R Q85X C89R C47W Q50E E59K C95S D69N S185R SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Loại Đột Biến Missense Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Missense Nonsense Nonsense Nonsense Missense Neutral Neutral Missense Frameshift Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Nonsense Nonsense Missense Nonsense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Exon 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 TLTK ! [1, 2, 11, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 29, 39, 40, 43, 44, 47, 55, 71]! Trang 77 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 E186X FsK181:S184X G176del C122Y Q104X E119X C95R D97Y C113F C113W D118N D200G C201Y E207K FS187Term236 E207del CK206–208ins CKDKSD206–207ins C92R Q154X C222X C231X D178fs C109Y G137C E140D D168G S177L C197W D221G C222Y C231Y C109R G219del C222_D227dup D227del D227delinsEDKSD T159I SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Nonsense Frameshift Frameshift Missense Nonsense Nonsense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Nonsense Nonsense Nonsense Frameshift Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Neutral 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Trang 78 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 N169N C74R E98K Q112X S135L P139R D179G S184P C143Y C155G C216Y D200Y I101F G170X S102T F105Y C152W D200N E71X C176Y H190Y D206fsX12 C228X Q233P D266V D266E E225A Fs222ter327 Q254P D266N R215W D245E FsE287: V348X FsE266:V327X FsE270:N288X E267X C255R C255W SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Neutral Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Missense Missense Frameshift Nonsense Missense Missense Missense Missense Frameshift Missense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Nonsense Missense Missense 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 Trang 79 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 E256K W305X E308K E235K D259G I268T Fs253ter327 Fs265ter267 S286R W284X S265R S285X E267K D283N C287Y C297R C297F C331W R350X E317K S284F Q307X E317X C308Y G301S Q324P C331Y A370T C343R N349T G352D C358R FS335Term348 D335E ECQDPD335–336ins FS354Term360 A349T D356H SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Missense Nonsense Missense Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Missense Missense Missense Nonsense Missense Missense Missense Missense Neutral Missense Missense Missense Missense Frameshift Missense Frameshift Frameshift Missense Missense 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 Trang 80 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 N370K G373C D354G D354A D356N Q378P D335Y C337Y Y333C A391T Q384P D386E Q384X G375S G331D C350X D339H C347Y S426C I377I L359H W401X FsV388:S402 FsE393:M408X T383I A378T D394G T413R W443X S447P A431T W422X I430T R374W N386K T392R E408K R416W SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Missense Missense Splice site Splice site Neutral Neutral Missense Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Missense Missense Nonsense Missense Missense Missense Silent Missense Nonsense Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Missense Nonsense Missense Neutral Nonsense Missense Missense Missense Missense Missense Missense 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 Trang 81 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 V429M L380H D424E L393R L405P V408M T413M R395Q L411V Q427X L490S R450R H464R I467N V502M FS437Term444 FS453Term515 FS459Term510 FS472Term513 S493fs A480P D482G P526T A501A V506M N515N I446N V523M G457R D471N T455P V482G G505D L435P FsW541:L547X P518P P497P G528D SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Silent Missense Missense Missense Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Splice site Neutral Neutral Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift Silent Silent Missense 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11 11 11 11 Trang 82 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 N564S G507V G549D N543H N570N D558Y G571E FS572Term643 R595_T597delfs R574C G592E P608T A612S A612A A606S D559H I585T L625I N619N V632V D580N FsV576:A601X I624del I582del V653F A606T A606V Q660R C625S P664L P643L C669S Q686X C667Y C660X G621E D658G C711S SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Missense Missense Missense Missense Splice site Missense Missense Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Neutral Neutral Missense Missense Missense Missense Silent Silent Missense Frameshift Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Splice site Nonsense Missense Missense Missense 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 Trang 83 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 C681X C656F S631R C654W C656Y C646R P678L FsV710:V715X R723R T684I Q749X S725fs N766fs R744Q T705I V755M V797M V758M V776M FsR736 V785I Y828C P805S N783K G823D FsS807 Nonsense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift Silent Neutral Nonsense Frameshift Frameshift Missense Missense Missense Splice site Missense Missense Frameshift Missense Missense Missense Missense Missense Frameshift 14 14 14 14 14 14 14 15 15 15 15 15 15 15 15 16 16 16 16 16 17 17 17 17 17 17 ! ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! ! Trang 84 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! PHỤ LỤC – MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN ApoB ! STT 10 11 12 Tên Đột Biến Protein R50W A3426V A3527A E3405Q L3350L L3517L R3500Q R3500W R3527Q R3531C T3540T T3552T Exon 26 26 26 26 26 26 26 26 26 26 26 TLTK [15, 16, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 33, 34, 37, 45, 51, 52, 53, 58, 59, 61, 63, 66, 62] ! ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! ! Trang 85 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! PHỤ LỤC – KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ EXON TRÊN GEN LDLR Ở MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM ! Mẫu A2 SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang 86 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! Mẫu A1 SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang 87 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! Mẫu A3 SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang 88 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! Mẫu A4 ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! ! Trang 89 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! PHỤ LỤC – KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ALLELE ĐỘT BIẾN R3500Q TRÊN GEN ApoB TRÊN MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM ! ! Mẫu A4 SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang 90 Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015! ! Mẫu A2 ! SVTH: Nguyễn Thanh Duy ! Trang 91 ... Nghiệp ? ?Khảo sát tính chất đột biến điểm gen LDLR ApoB bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia, FH) phương pháp PCR kết hợp giải trình tự? ?? SVTH: Nguyễn Thanh... QUAN VỀ BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CĨ TÍNH GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) I.2.1 Bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình Cao cholesterol máu có tính gia đình (Familia Hypercholesterolemia,. .. phát đột biến gen gây bệnh FH như: kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự, PCR – SSCP, DGGE v.v… I.6.1 Phương pháp giải trình tự (Sequencing) Giải trình tự gen phương pháp xác để phát đột biến điểm Phương