BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS CAO BẢO HIỀN SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH MSSV: 1153010315 Khóa: 2011 – 2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS CAO BẢO HIỀN SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH GVHD ký xác nhận: MSSV: 1153010315 Khóa: 2011 – 2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại học Mở TP.HCM năm vừa qua tận tình dạy bảo em, truyền đạt kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời Em kính gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Lê Huyền Ái Thúy tận tình cố vấn, truyền đạt cho em kiến thức chuyên môn bổ ích Em chân thành cảm ơn Thầy Lao Đức Thuận tạo điều kiện cho em được thực chuyên đề khóa luận tốt nghiệp phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường Đại Học Mở TP.HCM Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Trương Kim Phượng, người hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên giúp đỡ em suốt trình em học tập thực khóa luận trường Em chân thành cảm ơn Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á tạo điều kiện cho em học tập kỹ thuật, hỗ trợ hóa chất thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt chuyên đề khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cao Bảo Hiền tận tình hỗ trợ, chuyển giao kỹ thuật, giúp đỡ em trình thực chuyên đề khóa luận tốt nghiệp em Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân ủng hộ, động viên em nhiều trình thực khóa luận tốt nghiệp Sinh viên DƯƠNG NGỌC HUỲNH SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH i KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADH Arginine dehydrolase AMC Acetyl methyl carbinol AMP Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat AP Alkaline phosphatase BLAST Basic local alignment search tool Bp base pair cAMP Cyclic Andenosine monophosphate CONS Coagulase Negative Staphylococcus CFU Colony-forming unit CS cộng sự dATP deoxyadenosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate dUTP deoxyuridine triphosphate IDT Integrated DNA technologies gtt giải trình tự LDC Lysine decarboxylase MR Methyl Red NBT/BCIP Nitrobluetetrazdium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction pH Potential Hydrogen RDB Reverse Dot Blot rDNA ribosomal Deoxyribonucleic Acid SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 RNA Ribonucleic acid rRNA ribosomal Ribonucleic Acid S Semi-conserved SDS Sodium dodecyl sulfate SEs Staphylococcal enterotoxins SNP Single nucleotide polymorphism SSC Saline sodium citrate T3SS type III secretion systerm Ta annealing temperature TDH Thermostable direct hemolysin TE Tris - EDTA TLH Thermolabile hemolysin TLTK Tài liệu tham khảo Tm melting temperature TRH Thermostable – related hemolysin TSI Triple Sugar Iron VP Voges Proskauer SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng I.1 Đặc điểm vùng siêu biến động V1 – V9 Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R 27 Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R 28 Bảng III.1 Các vùng gen mục tiêu nghiên cứu phát vi khuẩn gây bệnh đường ruột 34 Bảng III.2 Kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm phát vi khuẩn gây bệnh đường ruột 35 Bảng III.3 Các trình tự gen được sử dụng nghiên cứu 36 Bảng III.4 Bảng thông tin mồi phổ quát trình tự gen 16S rRNA gen 23S rRNA 37 Bảng III.5 Bảng thông tin mẫu dò đặc hiệu số loài vi khuẩn 37 Bảng III.6 Bảng thông số vật lí mồi 16S-F, 16S-R 23S-F, 23S-R 39 Bảng III.7 Kết phân tích mức độ tương đồng cặp mồi 16S-F, 16S-R công cụ BLAST 42 Bảng III.8 Kết phân tích mức độ tương đồng cặp mồi 23S-F, 23S-R công cụ BLAST 45 Bảng III.9 Bảng số OD mẫu DNA vi khuẩn tách chiết từ mẫu thịt heo 58 Bảng III.10 Mức độ nhiễm đồng thời vi khuẩn gây bệnh đường ruột mẫu thịt heo tươi 65 Bảng III.11 Bảng kết số lượng khuẩn lạc mật độ tế bào CFU/ml 67 Bảng III.12 Bảng số liệu lượng DNA thực tế mật độ tế bào vi khuẩn mẫu thịt heo 67 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình I.1 Nguyên tắc phương pháp PCR 15 Hình I.2 Nguyên tắc phản ứng lai RDB 19 Hình III.1 Kết BLAST trình tự mồi 16S-F 41 Hình III.2 Kết BLAST trình tự mồi 16S-R 41 Hình III.3 Kết phân tích sự tương đồng trình tự mồi 16S-F trình tự 16S rDNA công cụ Bioedit 42 Hình III.4 Kết phân tích sự tương đồng trình tự mồi 16S-R trình tự 16S rDNA công cụ Bioedit 42 Hình III.5 Kết phân tích trình tự cặp mồi 16S-F, 16S-R phần mềm Annhyb 43 44 Hình III.6 Kết BLAST trình tự mồi 23S-F 44 45 Hình III.7 Kết BLAST trình tự mồi 23S-R 45 Hình III.8 Kết phân tích sự tương đồng trình tự mồi 23S-F trình tự 23S rDNA công cụ Bioedit 46 Hình III.9 Kết phân tích sự tương đồng trình tự mồi 23S-R trình tự 23S rDNA công cụ Bioedit 46 Hình III.10 Kết phân tích trình tự cặp mồi 23S-F, 23S-R phần mềm Annhyb 47 Hình III.11 Kết BLAST trình tự mẫu dò SAL 48 Hình III.12 Kết khảo sát khả bắt cặp mẫu dò SAL công cụ Annhyb 49 Hình III.13 Kết BLAST trình tự mẫu dò VPA 50 Hình III.14 Kết khảo sát khả bắt cặp mẫu dò VPA công cụ Annhyb 50 Hình III.15 Kết BLAST trình tự mẫu dò SAU 51 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH v KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình III.16 Kết khảo sát khả bắt cặp mẫu dò SAU công cụ Annhyb 52 Hình III.17 Kết BLAST trình tự mẫu dò CPE 53 Hình III.18 Kết khảo sát khả bắt cặp mẫu dò CPE công cụ Annhyb 53 Hình III.19 Kết BLAST trình tự mẫu dò CBO 54 Hình III.20 Kết khảo sát khả bắt cặp mẫu dò CBO công cụ Annhyb 55 Hình III.21 Kết BLAST trình tự mẫu dò SHI 56 Hình III.22 Kết khảo sát khả bắt cặp mẫu dò SHI công cụ Annhyb 57 Hình III.23 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu M1 M2 với cặp mồi 16S-F, 16SR 59 Hình III.24 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu M3, M4 M5 với cặp mồi 16S-F, 16S-R 59 Hình III.25 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu M6 với cặp mồi 16S-F, 16S-R 60 Hình III.26 a b Kết phản ứng lai RDB mẫu M1 61 Hình III.27 Kết BLAST trình tự gtt_M1F 62 Hình III.28 a b Kết phản ứng lai RDB mẫu M2 62 Hình III.29 a b Kết phản ứng lai RDB mẫu M3 63 Hình III.30 a b Kết phản ứng lai RDB mẫu M4 64 Hình III.31 a b Kết phản ứng lai RDB mẫu M5 64 Hình III.32 a b Kết phản ứng lai RDB mẫu M6 65 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỤC LỤC vii ĐẶT VẤN ĐỀ I TỔNG QUAN I.1 Tổng quan vi khuẩn gây bệnh đường ruột: I.1.1 Staphylococcus aureus I.1.2 Clostridium perfringens I.1.3 Clostridium botulinum I.1.4 Shigella spp I.1.5 Vibrio parahaemolyticus I.1.6 Salmonella spp I.2 Thông tin vùng gen 16S rRNA 23S rRNA: I.2.1 Vùng gen 16S rRNA I.2.2 Vùng gen 23S rRNA 10 I.3 Các phương pháp phát tác nhân vi khuẩn: 11 I.3.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống 11 I.3.2 Phương pháp sinh học phân tử đại 13 I.4 Các công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học phân tử để phát nhanh, đồng thời vi khuẩn gây bệnh đường ruột: 201 II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 II.1 Vật liệu: 23 II.1.1 Các công cụ tin sinh học được sử dụng 23 II.1.2 Mẫu thực phẩm khảo sát thực nghiệm 23 II.2 Phương pháp nghiên cứu: 23 II.2.1 Khảo sát liệu 23 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH vii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 II.2.2 Khảo sát in silico 24 II.2.3 Khảo sát thực nghiệm 25 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 III.1 Thu thập liệu: 34 III.2 Kết khảo sát in silico 36 III.2.1 Thu thập trình tự gen 16S rRNA 23S rRNA loài vi khuẩn 36 III.2.2 Thu thập đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò 36 III.2.3 Khảo sát mồi phổ quát 38 III.2.4 Khảo sát mẫu dò 47 III.3 Kết thực nghiệm: 57 III.3.1 Kết tách chiết DNA vi khuẩn đo OD 58 III.3.2 Kết điện sản phẩm PCR 59 III.3.3 Kết lai RDB 60 III.3.4 Kết xác định mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu: 66 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69 IV.1 Kết luận 70 IV.2 Đề nghị 70 V TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 VI PHỤ LỤC 79 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.15 Kết BLAST trình tự mồi 16S-F với Clostridium perfringens Hình VI.16 Kết BLAST trình tự mồi 16S-R với Clostridium perfringens SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 85 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.17 Kết BLAST trình tự mồi 16S-F với Clostridium botulinum Hình VI.18 Kết BLAST trình tự mồi 16S-R với Clostridium botulinum SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 86 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.19 Kết phân tích cặp mồi 16S-F, 16S-R với Staphylococcus aureus phần mềm Annhyb Hình VI.20 Kết phân tích cặp mồi 16S-F, 16S-R với Salmonella spp phần mềm Annhyb SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 87 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.21 Kết phân tích cặp mồi 16S-F, 16S-R với Shigella spp phần mềm Annhyb SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 88 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.22 Kết phân tích mồi 16S-F 16S-R với Clostridium botulinum phần mềm Annhyb SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 89 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Phụ lục 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẶP MỒI 23S-F, 23S-R Hình VI.23 Kết BLAST trình tự mồi 23S-F với Staphylococcus aureus Hình VI.24 Kết BLAST trình tự mồi 23S-R với Staphylococcus aureus SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 90 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.25 Kết BLAST trình tự mồi 23S-F với Vibrio parahaemolyticus Hình VI.26 Kết BLAST trình tự mồi 23S-R với Vibrio parahaemolyticus SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 91 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.27 Kết BLAST trình tự mồi 23S-F với Clostridium botulinum HìnhVI.28 Kết BLAST trình tự mồi 23S-R với Clostridium botulinum SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 92 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.29 Kết BLAST trình tự mồi 23S-F với Shigella spp Hình VI.30 Kết BLAST trình tự mồi 23S-R với Shigella spp SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 93 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.31 Kết BLAST trình tự mồi 23S-F với Clostridium perfringens Hình VI.32 Kết BLAST trình tự mồi 23S-R với Clostridium perfringens SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 94 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.33 Kết BLAST trình tự mồi 23S-F với Salmonella spp Hình VI.34 Kết BLAST trình tự mồi 23S-R với Salmonella spp SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 95 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.35 Kết phân tích cặp mồi 23S-F, 23S-R với Clostridium perfringens phần mềm Annhyb SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 96 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình VI.36 Kết phân tích cặp mồi 23S-F, 23S-R với Staphylococcus aureus phần mềm Annhyb Hình VI.37 Kết phân tích cặp mồi 16S-F, 16S-R 23S-F, 23S-R với vùng 16S rDNA 23S rDNA Salmonella enterica phần mềm Annhyb SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 97 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Phụ lục 4: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ Hình VI.38 Kết giải trình tự gtt_M1F SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 98 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Phụ lục 5: HÌNH ẢNH MẪU THỰC PHẨM TRONG THỰC NGHIỆM Hình VI.39 Mẫu thịt heo thực Hình VI.40 Cân 10g/mẫu thịt nghiệm Hình VI.41 Tăng sinh vi khuẩn Hình VI.42 Mẫu đối chứng mẫu thịt môi trường Nutrient Broth (NB) SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 99 ... NGHIỆP Đề tài: BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH –... REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI” SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Mục tiêu: Tìm hiểu ứng dụng quy trình PCR kết... 0036A) Công ty Cổ phần Công nghệ Vi t Á - Thực quy trình tách chiết DNA vi khuẩn quy trình PCR – RDB phát đồng thời số vi khuẩn gây bệnh đường ruột số mẫu thịt heo tươi được bày bán địa bàn Tỉnh