VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 12/2015 i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60 42 01 03 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VIỆT LINH HÀ NỘI, 12/2015 i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán nghiên cứu Phòng Công nghệ Phôi đặc biệt TS Nguyễn Văn Hạnh, Ths Nguyễn Thị Hiệp, Ths Nguyễn Thị Nhung nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ góp ý để hoàn thành luận văn Luận văn hoàn thành với tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ quốc gia khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng giọt noãn bào chất đơn tính lên hoạt hóa trứng phát triển phôi” mã số 106.12-2012.93 TS Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện thủ tục hành để bảo vệ luận văn Cuối xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, người sát cánh, ủng hộ suốt trình học tập thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2015 Học viên Lê Thanh Quang Số hóa Trung tâm Học liệu i – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC NỘI DUNG Số trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii PHẦN I MỞ ĐẦU PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Buồng trứng trình hình thành nang trứng 2.1.1.1 Đặc điểm buồng trứng 2.1.1.2 Quá trình hình thành phát triển nang trứng 2.1.1.3 Sự hình thành phát triển tế bào trứng 2.1.2 Sự thành thục tế bào trứng 2.1.3 Sự thụ tinh tế bào trứng động vật có vú 11 2.2Sự thành thục trứng lợn in vitro (In vitro maturation – IVM) 12 2.3 Thụ tinh ống nghiệm nuôi phôi in vitro (In vitro fertilization, In vitro Culutre – IVF, IVC) 2.3.1 Thụ tinh ống nghiệm lợn Số hóa Trung tâm Học liệu ii – ĐHTN 14 14 http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.3.2 Quá trình nuôi phôi 15 2.4 Quá trình nuôi phôi với tế bào đệm (co culture) 15 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 20 3.3 Nội dung nghiên cứu tiêu theo dõi 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 Phương pháp thu nhận chất lượng tế bào trứng Phương pháp phân loại chất lượng trứng Phương pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn in vitro (In vitro maturation - IVM) Phương pháp đo nồng độ GSH nội bào Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi thành thục in vitro (IVM) Phương pháp thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng lợn với tinh trùng đông lạnh, giải đông Phương pháp nuôi phôi Phương pháp đánh giá chất lượng phôi nang Phương pháp xử lý số liệu Số hóa Trung tâm Học liệu iii – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 Phần I Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới khả 28 thành thục tế bào trứng lợn Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới khả thành thục 28 tế bào trứng lợn Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới nồng độ Glutahinone 31 (GSH) tế bào trứng lợn Phần II Ảnh hưởng việc bổ sung tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm 34 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 ẢNH MINH HỌA 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Số hóa Trung tâm Học liệu iv – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng Ảnh hưởng nồng độ cysteine lên thành thục in vitro tế bào trứng lợn nồng độ oxy 5% Bảng Ảnh hưởng nồng độ cysteine lên thành thục in vitro tế bào trứng lợn nồng độ oxy 20 % 28 29 Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine tới nồng độ Glutathione tế bào trứng lợn sau nuôi thành thục in vitro 32 nồng độ oxy 5% Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi tới nồng độ Glutathione trứng nồng độ 20% oxy Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung tế bào đệm tới khả phân chia trứng lợn thụ tinh ống nghiệm Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới khả phát triển phôi vượt Số hóa Trung tâm Học liệu v – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 33 35 36 qua giai đoạn 2-16 tế bào Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến chất lượng phôi nang 38 40 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Tên Biểu đồ Trang Biểu đồ So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine mức nồng độ oxy khác tới khả thành thục tế bào trứng lợn Biểu đồ So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine mức nồng độ oxy khác tới nồng độ GSH tế bào trứng lợn Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phân chia phát triển phôi tới giai đoạn 2-16 tế bào trứng lợn TTON Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phân chia hình thành phôi nang trứng lợn TTON 31 34 37 39 Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi đến giai đoạn 2-16 tế bào hình thành phôi nang trứng lợn 40 TTON Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới hình thành Số hóa Trung tâm Học liệu vi – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 phôi nang chất lượng phôi nang trứng lợn TTON DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bê FM Fertilization medium Môi trường thụ tinh FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GSH Glutathione IVC In vitro Culture Nuôi phôi IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm IVM In vitro muaturation Thành thục ống nghiệm LH Luteinsing hormone Hormone thể vàng Số hóa Trung tâm Học liệu vii – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MI Metaphase I Trung kỳ I MII Metaphase II Trung kỳ II MPN Male pronuclear Tiền nhân đực MEF Mouse embryonic fibroblast Tế bào sợi thai chuột NCSU 23 NCSU 37 North Carolina State Môi trường nuôi trứng, phôi University 23 North California State Môi trường nuôi trứng, phôi University 37 NST Nhiễm sắc thể Ống dẫn trứng ODT pFF POEC PEEC PMSG TCM Porcine follicle fluid Porcine oviductal Dịch nang trứng lợn epithelial Tế bào biểu mô ống dẫn trứng cell lợn Porcine endometrial epithelial cell Pregnant mare’s serum gonadotropin Tissue Culture Medium TN Tế bào nội mạc tử cung lợn Huyết ngựa chửa Môi trường nuôi cấy Thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu viii – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang Số lần Loại tế bào đệm lặp lại thí nghiệm Số phôi Số phôi nang Tỷ lệ phôi giả định (blastocyst) nang (%) Đối chứng 275 48 (16,8 ± 3,1)b Tế bào sợi thai chuột 274 69 (24,6 ± 3,1)ab 280 69 (24,4 ± 2,2)ab 243 66 (28,5 ± 3,5)a Tế bào ống dẫn trứng lợn Tế bào nội mạc tử cung lợn Các chữ khác hàng thể khác biệt có ý nghĩa với P