VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - Nguyễn PhúTâm PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG TẠI TỈNH PHÚ THỌ Chuyên ngành vi sinh vật học Mãsố: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS PhíQuyết Tiến HÀ NỘI - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu vàkết đƣợc công bố luận văn làhoàn toàn trung thực, xác chƣa đƣợc công bố công trình khác HàNội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn PhúTâm ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS PhíQuyết Tiến chủ nhiệm đề tài VAST04.07/16-17 hết lòng giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn tới thầy, côcủa trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái vàTài Nguyên sinh vật thầy, cô Viện Công nghệ sinh học nhiệt tì nh giảng dạy cho suốt thời gian tham gia khóa học Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên, NCS Quách Ngọc Tùng vàcác cán phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học bảo nhiệt tình, giúp đỡ tạo điều kiện để thực luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, người giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện cho suốt quátrì nh học tập HàNội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn PhúTâm iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật dƣợc liệu 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh 1.1.2 Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật 1.1.3.1 Kháng ung thƣ, kháng viêm 1.1.3.2 Kiểm soát sinh học 1.1.3.3 Một số dƣợc chất khác từ xạ khuẩn nội sinh 1.1.4 Tình hì nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 1.1.4.1 Tì nh hình nghiên cứu giới 1.1.4.2 Tì nh hình nghiên cứu Việt Nam 10 1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh thực vật 12 1.3 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu15 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 15 1.3.2 Các gen tham gia vào quátrình tổng hợp kháng sinh vàcác hợp chất trao đổi thứ cấp 17 1.3.2.1 Gen chức pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa vòng thơm 17 1.3.2.2 Gen chức nrps 18 1.3.2.3 Đánh giá đa dạng gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS 18 1.3.3 Chất kháng sinh kháng sinh điều trị ung thƣ nhóm anthracycline 20 iv 1.4 Cây Màng tang vàtiềm khai thác xạ khuẩn nội sinh Màng tang 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật 24 2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 24 2.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Lấy mẫu Màng tang 25 2.2.2 Phƣơng pháp xử lýbề mặt mẫu 25 2.2.4 Khuếch đại gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS xạ khuẩn 26 2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 26 2.2.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả sinh melanin 26 2.2.5.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử vàbề mặt bào tử 27 2.2.5.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 27 2.2.6 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa phân tích trì nh tự gen 16S rDNA 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang tỉnh PhúThọ 30 3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang 32 3.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận Màng tang 32 3.2.2 Đa dạng xạ khuẩn Màng tang theo môi trƣờng phân lập 33 3.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 34 3.3 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 35 3.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 35 3.3.2 Xác định gen mãhóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 39 v 3.3.3 Khả sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 41 3.4 Đặc điểm sinh học vàphân loại chủng xạ khuẩn MPT28 42 3.4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 43 3.4.1.1 Đặc điểm hình thái vàbề mặt chuỗi bào tử 43 3.4.1.2 Đặc điểm sinh hóa 44 3.4.1.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả sinh trƣởng xạ khuẩn 45 3.4.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT28 46 3.4.2.1 Khuếch đại gen 16S rDNA 46 3.4.2.2 Giải trì nh tự đoạn gen 16S rDNA 46 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 PHỤ LỤC 57 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc số kháng sinh điển hì nh thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI vàIDA 21 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập số môi trƣờng đặc hiệu sau tuần nuôi cấy 30 Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố phận Màng tang 32 Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh Màng tang đƣợc phân lập loại môi trƣờng khác 33 Hình 3.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu 35 Hình 3.5 Hoạt tí nh kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) chủng xạ khuẩn nội sinh 37 Hình Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II số chủng xạ khuẩn nội sinh đại diện 39 Hình Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps số chủng xạ khuẩn nội sinh đại diện 40 Hình Hình thái khuẩn lạc (A) môi trƣờng ISP1 vàbề mặt chuỗi bào tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần chủng MPT28 44 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 46 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu giới loài xạ khuẩn nội sinh thực vật Bảng 1.2 Xạ khuẩn đƣợc phân lập từ dƣợc liệu 14 Bảng 1.3 Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 16 Bảng 1.4 Tần xuất xuất gen pks-I, nrps phân nhóm xạ khuẩn khác .19 Bảng 2.1 Trì nh tự cặp mồi đƣợc sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA……………………………………………………………… 28 Bảng 3.1 Đặc điểm hì nh thái chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu Màng tang .31 Bảng 3.2 Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 25 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Màng tang 36 Bảng 3.3 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn 37 Bảng 3.4 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS khả sinh anthracycline 14 chủng xạ khuẩn nội sinh 41 Bảng 3.5 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng MPT28 42 Bảng 3.6 Màu sắc khuẩn lạc chủng MPT28 nuôi cấy môi trƣờng khác 43 Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn carbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C 44 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng chủng MPT28 45 Bảng 3.9 Trì nh tự gen mãhóa 16S rDNA chủng MPT28 47 viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ ACCd Aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase ACP Acyl carrier protein AT Acyl transferase CA Citrate acid-agar DAB Deacetil baceatin DNA Deoxyribonucleotide acid DNR Daunorubicin DOX1 Doxorubicin EPI Epirubicin 10 HGT Horizontal gene transfer 11 HV Humic acid-agar 12 IAA Indol-3-acetic acid 13 IDA Idarumycin 14 KS Ketosynthase 15 MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 16 NaOCl Sodium hypochlorite 17 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 18 PKS Ppolyketide synthase 19 PKS-I Polyketide synthase I 20 PKS-II Polyketide synthase II 21 RNA Ribonucleic acid 22 RA Raffinose-histidine agar 23 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 24 VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Vi khuẩn gây bệnh có khả kháng thuốc kháng sinh vấn đề nghiêm trọng vàthu hút mối quan tâm lớn cộng đồng Vìvậy, việc nghiên cứu, lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ƣu tiên hàng đầu nhàkhoa học vàcác công ty dƣợc phẩm giới Cho đến nay, nhàkhoa học không ngừng tìm kiếm nguồn hợp chất tự nhiên khác để phát triển loại thuốc kháng sinh nhƣ loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu tác dụng phụ tới sức khỏe ngƣời bệnh số thuốc tổng hợp hóa học gây Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật nguồn tự nhiên quan trọng điều trị bệnh gây vi sinh vật vàhỗ trợ điều trị chống ung thƣ Chẳng hạn, Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) làcây bụi thuộc họ Lauraceae, Màng tang giàu tinh dầu, lƣợng tinh dầu tối đa làkhoảng 5% trọng lƣợng tƣơi Thành phần tinh dầu làcitral cóhoạt tính sinh học nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, diệt côn trùng, kháng khuẩn, chống ung thƣ Cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dƣợc chất tinh dầu lá, vỏ vàquả với 90% làcinnamaldehyde cóhoạt tí nh kháng khuẩn cao vi khuẩn Gram (+) vàvi khuẩn Gram (-) Ngoài giá trị khoa học, thành phần mang lại, dƣợc liệu môi trƣờng cho xạ khuẩn nội sinh (sống loại mô thực vật) có khả sinh tổng hợp chất kháng sinh Theo nghiên cứu, ƣớc tí nh khoảng 70% kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sử dụng y học lâm sàng đƣợc sinh tổng hợp xạ khuẩn Gần đây, số công bố cho thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuẩn nội sinh tạo dƣợc liệu số lƣợng phong phú màcòn có đa dạng chức nhƣ tính kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát sinh học Tuy nhiên, số lƣợng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Màng tang nói riêng dƣợc liệu nói chung Việt Nam hạn chế Xuất phát từ định hƣớng trên, thực nghiên cứu đề 44 A B Hình Hì nh thái khuẩn lạc (A) môi trƣờng ISP1 vàbề mặt chuỗi bào tử (B) dƣới kí nh hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần chủng MPT28 Kết bảng 3.6 vàhì nh 3.8 cho thấy chủng MPT28 thuộc nhóm xạ khuẩn màu xám, không sinh melanin vàsắc tố tan, chuỗi gồm 12-20 bào tử, cấu trúc cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử hình trụ, gai (sp) 3.4.1.2 Đặc điểm sinh hóa Việc nghiên cứu khả sử dụng nguồn carbon, nitơ nhằm đánh giá đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn, bên cạnh giúp định hƣớng tìm nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho quátrì nh lên men Kết nghiên cứu khả sử dụng nguồn carbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn carbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C Nguồn carbon Khả Nguồn nitơ Khả (1,0%, w/v) sinh trƣởng (1,0%, w/v) sinh trƣởng D-Glucose + L-Asparagin monohydrat + D-Glactose + L-Histidine monohydrat - D-Mantose + L- Phenylalanin + α-Lactose + L-Leucin + L-Arabinose + L-Tryptophan - 45 D-Glucosamine - L-Arginine + Myo-Inositol + L-Isoleucin + D-Manitol + L-Valine + D-Fructose + L-Methionin + L-Rhamnose + L-Lysin - D-Saccharnose + L-Threonine + D-Sorbitol + L-Cystein + amino hydroxy- - D-Trehalose Đối chứng âm + methyl 1,3 promo Đối chứng âm - - Ghi :(+) Sinh trưởng tốt; (-) Không sinh trưởng Kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóa cho thấy, chủng MPT28 cókhả đồng hóa đƣợc nhiều nguồn carbon nhƣ D-Glucose, D-Glactose, MyoInositol, D-Manitol, D-Fructose, D-Saccharnose, D-Sorbitol nitơ nhƣ LLeucin, L-Arginine, L-Valine, L-Threonine (Bảng 3.7) 3.4.1.3 Ảnh hưởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả sinh trưởng xạ khuẩn Nhiệt độ, pH, nồng độ muối đặc điểm có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng xạ khuẩn lên men thu nhận hợp chất có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thƣ Sinh trƣởng chủng MPT28 môi trƣờng Bennett điều kiện thínghiệm thay đổi nồng độ muối, pH vànhiệt độ đƣợc thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng chủng MPT28 Điều kiện Dải sinh trƣởng Nhiệt độ (oC) 30-37 Nồng độ muối (%) 0-3 pH ban đầu 6-11 Kết bảng 3.8 cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu thuộc nhóm ƣa ấm; sinh trƣởng tốt dải nhiệt từ 30-37 oC vàpH từ 6-11 Khi nồng 46 độ muối ≥ 3,0%, chủng MPT28 sinh trƣởng yếu không sinh trƣởng Kết phù hợp với tí nh chất điều kiện khíhậu mẫu thu thập tỉnh PhúThọ 3.4.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT28 3.4.2.1 Khuếch đại gen 16S rDNA Kết DNA tổng số chủng xạ khuẩn MPT28 (Phụ lục 2) đƣợc sử dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, kết thể hình 3.9 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% Băng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); Băng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA chủng MPT28 Kết khuếch đại gen 16S rDNA chủng MPT28 cho thấy, sản phẩm DNA phản ứng PCR cho băng rõ nét có kích thƣớc khoảng 1400 bp (Hì nh 3.9) Nhƣ vậy, sản phẩm PCR thu đƣợc thí nghiệm đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh giải trình tự gen 16S rDNA 3.4.2.2 Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng xạ khuẩn đƣợc trình bày bảng 3.9 47 Bảng 3.9 Trì nh tự gen mãhóa 16S rDNA chủng MPT28 Trì nh tự gen 16S rDNA chủng Mãsố truy cập Độ tƣơng MPT28 sau blast NCBI GenBank đồng (%) Streptomyces albogriseolus 71.1 KX454152.1 97% Streptomyces albogriseolus T8 KU324449.1 97% Streptomyces griseorubens AU2 KX156364.1 97% Streptomyces sp DB21 KX443347.1 97% Streptomyces sp NCD21 KU382328.1 97% Kết phân tí ch trì nh tự gen 16S rDNA vàso sánh với trình tự gen công bố GenBank công cụ BLAST (NCBI) cho thấy gen mã hóa 16S rDNA chủng MPT28 có độ tƣơng đồng chƣa cao so với gen tƣơng ứng chủng Streptomyces albogriseolus 71.1 (Bảng 3.9) Dựa vào kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý– sinh hóa vàphân tích trì nh tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn MPT28 đƣợc định danh làStreptomyces albogriseolus MPT28 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ 03 mẫu (rễ, thân, lá) Màng tang tỉnh Phú Thọ, phân lập đƣợc 25 chủng xạ khuẩn nội sinh Đánh giá đa dạng xạ khuẩn dựa tỷ lệ phân lập từ phận (rễ, 40%; thân, 32%; lá, 28%); môi trƣờng phân lập (cao môi trƣờng HV, SPA đạt từ 16% đến 20 %); nhóm màu xạ khuẩn (nhóm màu vàng, trắng (10 chủng, 40%) chiếm ƣu thế) Sàng lọc đƣợc 14 chủng xạ khuẩn có khả kháng loại VSV kiểm định, chủng mang gen pks-I (chiếm 57,1%), 11 chủng mang gen pks-II, nrps (chiếm 78,6%), chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline Chủng MPT28 có khả sinh kháng sinh phổ rộng, hoạt tính cao Dựa phân tích đặc điểm sinh học vàtrì nh tự gen 16S rDNA, chủng MPT28 đƣợc định danh làStreptomyces albogriseolus MPT28 4.2 Kiến nghị Tách dòng xác định trình tự gen PKS-II, NRPS chủng S albogriseolus MPT28 Nghiên cứu sâu đặc điểm hệ gen khả ứng dụng chủng S albogriseolus MPT28 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học Kĩ Thuật, Hà Nội Egorov NX (1976), Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Lê Mai Hƣơng, Trần Thị Nhƣ Hằng, Trần Huy Thái, Dƣơng Đức Huyến (2005), “Phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chủng nấm nội ký sinh thực vật phân lập từ số vƣờn thuốc phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, tr 352, 20-23 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập Việt Nam, HàNội Hoàng Hoa Long, Dorothea M, Ian TB (2013), “Vi khuẩn nội sinh Bacillus sp B55 phân lập từ Nicotiana attenuata kích thích sinh trƣởng tăng khả thích nghi chủ điều kiện tự nhiên”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 2, tr 329-333 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, HàNội Văn Thị Phƣơng Nhƣ, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập đặc tí nh vi khuẩn nội sinh lúa (Oryza sativa L.) trồng đất tỉnh Phú Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, tr.450 – 454 Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kì Sơn, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá sàng lọc xạ khuẩn nội cộng sinh quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 12(2), tr.1 – 50 Tiếng Anh Adhikari A, Basnyat R (1999), “Phenotypic characteristics of Xanthomonas campestris pv campestris from Nepal”, EJPP, 105(3), pp.303 - 305 10 Araujo WL, Marcon J, WJr M, Van Elsas JD, JWVan V, Azevedo JL (2002), “Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants”, Appl Environ Microbiol., 68, pp.4906 – 4914 11 Bacon CW, White JF (2000), Microbial endophytes, New York, Marcel Dekker 12 Berdy J (2005), “Bioactive microbial metabolites”, J Antibiot., 58, pp.1 – 26 13 Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM, Zhou S (2005), “Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of fusarium wilt pathogen from surface-sterilized banana roots”, FEMS Microbiol Lett., 247, pp.147-152 14 Castillo U, Harper JK, Strobel GA, Sears J, Alesi K, Ford E, Lin J, Hunter M, Maranta M, Ge H, Yaver D, Jensen JB, Porter H, Robison R, Miller D, Hess WM, Condron M, Teplow D (2003), “Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia”, FEMS Microbiol Lett., 234, pp.183–190 15 Chen HH, Qin S, Lee JC, Kim CJ, Xu LH, Jiang CL, Li WJ (2009a), “Streptomyces mayteni sp nov., a novel endophytic actinomycete isolated from Chinese medicinal plant”, Antonie Leeuwenhoek, 95, pp.47–53 16 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005), “Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects”, Appl Environ Microbiol., 71, pp.4951–4959 51 17 Conn VM, Walker AR, Franco CMM (2008), “Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana”, Mol Plant Microbe Interact., 21, pp.208–218 18 Coombs JT, Michelsen PP, Franco CMM (2004), “Evaluation of endophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var tritici in wheat”, Biol Control., 29, pp.359–366 19 Coppen JJW (1995), Non-Wood Forest Products 1: Flavours and Fragrances of Plant Origin, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome 20 Davis KE, Joseph SJ, Janssen PH (2005), “Effects of growth medium, inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil bacteria”, Appl Environ Microbiol., 71, pp.826–834 21 Denmain A, Davies J (1999), Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM, Washington DC 22 El-Bondkly AM, El-Gendy MM (2010), “Keratinolytic activity from new recombinant fusant AYA2000, derived from endophytic Micromonospora strains”, Can J Microbiol., 56, pp.748 – 760 23 El-Tarabily KA (2003), “An endophytic chitinase-producing isolate of Actinoplanes missouriensis, with potential for biological control of root rot of lupine caused by Plectosporium tabacinum”, Aust J Bot., 51, pp.257–266 24 El-Tarabily KA, Sivasithamparam K (2006), “Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters”, Soil Biol Biochem., 38, pp.1505– 1520 25 Gangwar M, Dogra S and Sharma N (2011), “Antagonistic bioactivity of endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants”, JALRP, 2(4), pp.154-157 26 Garrity GM, Holt JG (2001), The road map to the manual In Bergey’s manual of systematic bacteriology, Springer, pp.119-166 52 27 Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004), “Anthracyclines: Molecular Advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity”, Pharmacol Rew., 56, pp.185 – 229 28 Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010), “Sequencebased analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria”, Appl Environ Microbiol, 76(8), pp.2487 – 2499 29 Gonzalez I, Ayuso-Sacido A, Anderson A, Genilloud O (2005), “Actinomycetes isolated from lichens: evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene sequences”, FEMS Microbiol Ecol., 54, pp.401 – 415 30 Hasegawa S, Meguro A, Shimizu M, Nishimura T, Kunoh H (2006), “Endophytic actinomycetes and their interactions with host plants”, Actinomycetologica, 20, pp.72–81 31 Ho C, Jie-Pinge O, Liu Y, Hung C, Tsai M, Liao P, Wang E, Chen Y, Su Y (2010), “Compositions and in vitro anticancer activities of the leaf and fruit oils of Litsea cubeba from Taiwan”, Nat Prod Commun., 5, pp.617–620 32 Igarashi Y (2004), “Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes”, Actinomycetologica, 18, pp.63–66 33 Khieu Thi Nhan (2015) Exploring diversity and antimicrobial, antitumor activities of culturable endophytic actinomycetes associated with Dracaena cochinchinensis Lour, China 34 Kizuka M, Enokita R, Takanashi K, Okamoto Y, Otsuka T, Shigematsu Y, Inoue Y, Okazaki T (1998), “Studies on actinomycetes isolated from plant leaves”, Actinomycetologica, 12, pp.89–91 35 Küster E, Williams ST (1964), “Media for the isolation of Streptomycetes: starch casein medium”, Nature, 202, pp.928–929 36 Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY, Xu LH, Jiang CL, Li WJ (2008), “Antitumour and antimicrobial activities of 53 endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”, Lett Appl Microbiol, 47, pp.574 – 580 37 Li J, Zhao GZ, Huang HY, Qin S, Zhu WY, Zhao LX, Xu LH, Zhang S, Li WJ, Strobel G (2012), “Isolation and characterization of culturable endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua L Antonie van Leeuwenhoek, 101, pp.515-527 38 Li WR, Shi QS, Liang Q, Xie XB, Huang XM, Chen YB (2014), “Antibacterial activity and kinetics of Litsea cubeba oil on Escherichia coli”, PLOS one, 9(11), pp.1 – 39 Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), “Plant pathogenecity in the genus Streptomyces”, Plant Dis., 81, pp.836 – 846 40 Lu CH, Shen YM (2004), “Two new macrolides produced by Streptomyces sp CS”, J Antibiot., 57, pp.597–600 41 Madhurama G, Sonam D, Urmil PG, Ravindra NK (2014), “Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India”, Afr J Microbiol Res., 8(2), pp.184 – 191 42 Mahera MS, Sulaiman AA, Ismet A, Milton W (2013), “Evaluation of antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of Saudi Arabia”, Life Sci J., 10(4), pp.974 – 980 43 Merzaeva Shirokikh (2010), “The production of auxins by the endophytic bacteria of Winter Rye”, Appl Biochem and Microbiol., 3, pp.44 - 50 44 Nguyen Hai Van, Vu Thi Hanh Nguyen, Vu Thu Trang, Phi Quyet Tien, Khieu Thi Nhan, Samira Sarter, Chu Ky Son (2016), “Antimicrobial activities and interaction effects of vietnamese Litsea cubeba (Lour.) Pers essential oil and its endophytic actinobacteria”, Journal of Science and Technology, 54(4A), pp.234 – 241 45 Noosidum N, Prabaripai A, Charoenviriyaphap T, Chandrapatya A (2008), “Excito-repellency properties of essential oils from Melaleuca leucadendron L., Litsea cubeba (Lour.) Persoon, and Litsea salicifolia 54 (Nees) on Aedes aegypti (L.) mosquitoes”, J Vector Ecol., 33, pp.305–312 46 Nor Azah MA, Susiarti S (1999), Litsea cubeba (Lour.) Persoon In Plant Resources of South-East Asia, Backhuys Publishers, Leiden, pp 47 Okazaki T (2003), Studies on actinomycetes isolated from plant leave, Queensland Complete Printing Service, Nambour 48 Onuma Kaewkla, Christopher MMF (2013), “Rational approaches to improving the isolation of endophytic actinobacteria from Australian native trees”, Microb Ecol., 65, pp.384-393 49 Priham TG and Tenser HD (1974), “Streptomyces Waksman and first and second studies”, Int J Syst Bacteriol., 18, pp.279 50 Pullen C, Schmitz P, Meurer K, Bamberg DD, Lohmann S, Franc SDC, Groth I, Schlegel B, Möllmann U, Gollmick F, Gräfe U, Leistner E (2002), “New and bioactive compounds from Streptomyces strains residing in the wood of Celastraceae”, Planta, 216, pp.162–167 51 Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011), “Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plantassociated endophytic actinobacteria”, Appl Microbiol Biotechnol., 89, pp.457 – 473 52 Qin S, Zhao GZ, Klenk HP, Li J, Xu LH, Li WJ (2009d), “Nonomuraea antimicrobica sp nov., an endophytic actinomycete isolated from leaves of Maytenus austroyunnanensis”, Int J Syst Evol Microbiol., 59, pp.2453–2457 53 Quadt-Hallmann A, Benhamou N, Kloepper JW (1997), “Bacterial endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant”, Can J Microbiol., 43, pp.577-582 54 Rojas DJ, Sette LD, Araujo WL, Lopes MSG, Silva LF, Furlan RLA, Padilla G (2012), “The diversity of polyketide synthase genes from sugarcane-derived fungi”, Microb Ecol., 63, pp.565 – 577 55 55 Sacido-Ayuso A and Genilloud O (2004), “New PCR primer for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: Detection and distribution of these biosynthetic gene sequence in major taxonomic groups”, Microbial Ecology, 38, pp.10 – 14 56 Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular cloning A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork 57 Shimizu M, Suzuki T, Mogami O, Kunoh H (2005), “Disease resistance of plants induced by endophytic actinomycetes In: Tsuyumu S, Leach JE, Shiraishi T, Wolpert T (eds) Genomic and genetic analysis of plant parasitism and defense”, APS, St Paul, (3), pp.292–293 58 Shirling EG and Gottlieb D (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, Int J Syst Bacteriol., 16, pp.313 – 340 59 Smith GE (1957), “Inhibition of Fusarium oxysporum f sp lycopersici by a species of Micromonospora isolated from tomato”, Phytopathology, 47, pp.429–432 60 Sri P, Yulin L, Antonius Su, Sri B, Latifah KD (2012), “Alphaglucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medicinal, plants”, IJPSR, 4(1), pp.327 – 334 61 Strobel G, Daisy B (2003), “Endophytes as sources of bioactive products”, Microbes Infect., 5, pp.535–544 62 Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004),” Natural products from endophytic microorganisms”, J Nat Prod., 67, pp.257–268 63 Taechowisan T, Lu C, Shen Y, Lumyong S (2005), “Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity”, Microbiology, 151, pp.1691–1695 64 Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007a), “4arylcoumarin inhibits immediate-type allergy”, Food Agric Immunol., 18, pp.203–211 56 65 Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007b), “Antitumor activity of 4-arylcoumarins from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130”, J Cancer ResTrer., 30, pp.86–91 66 Tan HM, Cao LX, He ZF, Su GJ, Lin B, Zhou SN (2006), “Isolation of endophytic actinobacteria from different cultivars of tomato and their activities against Ralstonia solanaceraum in vitro”, World J Microbiol Biotechnol., 22, pp.1275 – 1280 67 Trease GE, Evans WC (1996), A textbook of Pharmacognosy, London 68 Trenser HD and Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by Streptomyces as criteria for species differentiation”, J Bacteriol, 76, pp.239 69 Tuntiwachwuttikul P, Taechowisan T, Wanbanjob A, Thadaniti S, Taylor WC (2008), “Lansai A–D, secondary metabolites from Streptomyces sp SUC”, Tetrahedron, 64, pp.7583–7586 70 Yang TS, Liou ML, Hu TF, Peng CW, Liu TT (2013), “Antimicrobial activity of the essential oil of Litsea cubeba on cariogenic bacteria”, The Journal of Essential Oil Research, 25(2), pp.120 – 128 71 Zhang W, Hu JF, Zhao QC, Shi GB (2012), “Antibacterial, antifungal and cytotoxic isoquinoline alkaloids from Litsea cubeba”, Molecules, 17, pp.12950 – 12960 72 Zhao K, Penttinen P, Guan T, Xiao J, Chen Q, Xu J, Lindstro K, Zhang L, Zhang X, Strobel GA (2011), “The Diversity and Anti-Microbial Activity of endophytic actinomycetes Isolated from Medicinal Plants in Panxi Plateau, China”, Curr Microbiol., 62, pp.182–190 73 Zhao PJ, Fan LM, Li GH, Zhu N, Shen YM (2005), “Antibacterial and antitumor macrolides from Streptomyces sp ls9131”, Arch Pharm Res., 28, pp.1228–1232 57 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy - Môi trƣờng TWYE (g/L): Cao thịt 0,25; K2HP04 0,5; agar 15,0; H2O 1000mL; pH 7,2 - Môi trƣờng STA (g/L): Tinh bột 15,0; K2HP04 0,5; MgSO4.7H2O 0,05; FeSO4.7H2O 0,01; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trƣờng HV (g/L): Humic acid 8,0; Na2HPO4 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; CaCO3 0,02; NaNO2 0,9; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trƣờng TA (g/L): Trehalose 18,0; CaCl2 0,3; Na2HPO4 0,3; CaCO3 0,02; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trƣờng SA (g/L): Sodium succinate 15,0; K2HPO4 0,6; FeSO4.7H2O 0,001; CaCl2.2H2O 0,2; KCl 0,3; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trƣờng CA (g/L): Citrate acid 12,0; K2HPO4.3H2O 0,4; CaCl2.H2O 0,05; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trƣờng SPA (g/L): peptone 12,0; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 0,1; agar 15,0; H2O 1000 mL, pH 7,2 - Môi trƣờng LBA (Luria-Bertani) (g/L): Cao nấm men 5,0; Tryptone 10,0; NaCl 10,0; agar 15,0; Nƣớc cất 1000 mL; pH= 6,57,0 - Môi trƣờng ISP1 (g/l): Tryptone 5,0, cao nấm men 3,0; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7,0 - Môi trƣờng ISP2 (g/L): cao nấm men 3,0; cao malt 10,0; dextrose 4,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 - Môi trƣờng ISP3 (g/L): Bột kiều mạch 20,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH-7,2 - Môi trƣờng ISP4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O 1,0; NaCl 1,0; (NH4)2SO4 2,0; CaCO3 2,0; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 58 - Môi trƣờng ISP5 (g/l): L-Asparagin monohydrate 1,0; glycerol 10,0; K2HPO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7,0-7,4 - Môi trƣờng ISP6 (g/L): Peptone 10,0; cao nấm men 1,0; xitrat sắt 0,5; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 - Môi trƣờng ISP7 (g/L): Glycerol 15,0; L-tyrosine 0,5; LAsparagin monohydrate 1,0; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5; MgSO4 7H2O 0,5; Nacl 0,5; agar 20; H2O 1000 mL; pH 7,2-7,4 - Môi trƣờng ISP9 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 6,8-7,0 Phụ lục 2: DNA tổng số chủng xạ khuẩn sử dụng nghiên cứu PCR Băng 1-13: DNA tổng số chủng xạ khuẩn MPT08, MPT14, MPT21, MPT22, MPT25, MPT26, MPT28, MPT29, MPT30, MPT33, MPT34, MPT35, MPT45 ... 3.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang tỉnh Ph Thọ 30 3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang 32 3.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận Màng tang 32 3.2.2 Đa dạng xạ khuẩn Màng tang. .. 1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh thực vật 12 1.3 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu15 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 15 1.3.2 Các gen tham gia vào... môi trƣờng phân lập 33 3.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 34 3.3 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 35 3.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn