1 ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, nước ta bệnh máu nói chung đặc biệt bệnh hệ thống tạo máu ngày có xu hướng gia tăng mạnh mẽ Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ sở y tế chuyên điều trị bệnh máu Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Nhi trung ương, Quân y 108, Trung tâm Huyết học Truyền máu, Bệnh viện Trung ương Huế cho thấy vòng 10 năm trở lại có 7200 ca mắc bệnh máu, bệnh liên quan đến ung thư máu chiếm tỷ lệ khoảng 70% Nguyên nhân gia tăng bệnh máu ô nhiễm môi trường, hóa chất, loại virus, chất độc từ thời chiến tranh, đặc biệt chất độc da cam phát tán hậu Điều đáng lo ngại bệnh thường phát hầu hết bệnh nhân trẻ tuổi lứa tuổi lao động gây tỷ lệ tử vong cao Hiện chưa có phương pháp điều trị hữu hiệu cho bệnh máu Phương pháp điều trị ung thư máu suy tủy xương xem tối ưu ghép tế bào gốc Khác với phương pháp truyền hoá chất xạ trị, phương pháp điều trị ghép tế bào gốc tế bào gốc tạo máu giúp kéo dài tuổi thọ đảm bảo chất lượng sống người bệnh Trong trường hợp điều trị kết hợp nhiều phương pháp, ghép tế bào gốc có vai trò cứu vớt, giúp người bệnh chịu liều lượng hoá chất tia xạ cao hơn, nâng cao tỉ lệ kéo dài thời gan lui bệnh Trong thực tế, ghép tế bào gốc đồng loại giúp chữa khỏi 90% bệnh nhân bị rối loạn máu Tuy nhiên chi phí cho ca ghép tế bào gốc cao từ 400 triệu đồng đến tỷ đồng Hơn để ghép đòi hỏi người cho người nhận phải tương hợp kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA Với mức chi phí yêu cầu phù hợp HLA vậy, thực tế có khoảng 2-3% người bệnh ung thư máu có đủ điều kiện để thực ghép tế bào gốc Do vậy, việc nghiên cứu tìm công nghệ, phương cách, loại thuốc an toàn rẻ tiền để cứu sống bệnh nhân mắc bệnh máu điều quan trọng thiết IL-11 cytokin có vai trò quan trọng trình tạo máu cytokine tạo máu tiến hành tìm hiểu nhiều mô hình hóa trị liệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả ứng dụng yếu tố kích thích tạo tiểu cầu Với kết thu thử nghiệm chuột khỉ cho kết khả quan khả kích thích tạo tiểu cầu IL-11, vào năm 1997, hãng Neumega quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration - FDA) cấp phép cho việc áp dụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu giảm bớt nhu cầu tiểu cầu trình truyền máu sau hóa trị liệu ức chế tủy bệnh nhân bị u tủy ác tính - người có nguy cao thiếu hụt tiểu cầu Tuy nhiên, giá thành cao thị trường, chưa phù hợp với người Việt nam Trên sở đó, Viện công nghệ sinh học nghiên cứu tái tổ hợp tinh chế thành công IL-11 công nghệ đại Sản phẩm IL-11 tạo cần phải đánh giá tính an toàn hoạt tính sinh học, trước sử dụng lâm sàng Chúng sử dụng sản phẩm để nghiên cứu mô hình nuôi cấy tế bào gốc sau có đánh giá tính an toàn chung, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, chí nhiệt tố nội độc tố mẫu sản phẩm Il-11 Đồng thời hoạt tính IL-11 đánh giá tế bào dòng TF-1, tế bào dòng ung thư dòng hồng cầu, mục tiêu đề tài: Áp dụng quy trình tách nuôi cấy tế bào gốc tạo máu tủy xương Đánh giá tác dụng in vitro IL-11 tái tổ hợp lên tế bào gốc tạo máu tủy xương CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tế bào gốc Tế bào gốc (Stem Cell) phát từ 60 năm nay, kể từ nghiên cứu thành công tạo cụm tế bào lách nghiên cứu sinh máu chuột (1950) Từ dựa tiến khoa học kỹ thuật; hình thái học; hóa học tế bào; miễn dịch, lai phân tử, huỳnh quang, PCR, RT-PCR, nuôi cấy tế bào người ta phân lập biết trình phát triển thể người động vật tế bào gốc toàn (totipotent stem cell) Từ đó, khái niệm tế bào gốc (TBG) tế bào có khả sinh sản, tự tái sinh biệt hóa thành tế bào gốc kế cận, phát triển thành TBG có chức riêng, cuối trở thành tế bào trưởng thành toàn thể người động vật Đặc điểm tế bào gốc toàn tế bào có khả tạo tất tế bào gốc quan thể có nhiều đặc điểm khả sinh sản biệt hóa cao, tạo thai nhi ; có khả tự tái sinh để trì nguồn gốc chúng; có số lượng khả sinh sản biệt hóa lớn, nhiên chưa có dấu ấn riêng để nhận biết tế bào gốc toàn Ở điều kiện bình thường tế bào gốc toàn trạng thái nghỉ ngơi, có kích thích từ môi trường chúng sinh sản biệt hóa nhanh để tạo tế bào gốc kế cận, tế bào gốc kế cận tế bào gốc quan riêng biệt, lúc chúng có dấu ấn riêng để nhận biết được, ví dụ tế bào gốc quan tạo máu có dấu ấn CD34+…đây dấu ấn riêng tế bào gốc tạo máu kể từ tách khỏi tế bào gốc toàn Trong thể người động vật, tế bào gốc có mặt vị trí gồm tủy xương, máu ngoại vi, máu dây rốn; quan đặc dây rốn, giác mạc, não, tim, xương, gan, da… Ở chúng vừa tế bào dạng “nghỉ ngơi”, vừa dạng tế bào thường trực để cần thiết có nhu cầu chúng sinh sản biệt hóa thành tế bào gốc kế cận, tạo tế bào chức năng, thay thường xuyên cho tế bào già 1.2 Tế bào gốc tủy xương Trong tủy xương có nhiều loại tế bào gốc khác đặc điểm tuổi tế bào, hình thái chủng loại Người ta xếp tế bào thành nhóm lớn tế bào gốc tạo máu tế bào gốc không tạo máu Tế bào gốc tạo máu tế bào tách từ tế bào gốc toàn toàn thể, tế bào gốc vạn quan sinh máu, chúng có khả tạo tất tế bào gốc đầu dòng tế bào máu, có khả tự tái sinh để trì dòng tế bào, có tế bào gốc tạo máu vạn có dấu ấn CD34+ có khả Các tế bào có dấu ấn đặc hiệu khác CD45, CD47 nhận biết Các tế bào gốc tạo máu có khả sinh sản biệt hóa thành tế bào máu trưởng thành Khả sinh sản lớn, tủy xương có từ khoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào gốc Quá trình sản sinh biệt hóa tế bào gốc tạo máu tế bào gốc đa phôi trung bì Các tế bào gốc tạo máu phát triển biệt hóa thành tế bào gốc đa dòng tủy, dòng lympho thành tế bào gốc đầu dòng dòng tế bào máu hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Từ tế bào này, chúng tiếp tục sinh sản biệt hóa thành tế bào trưởng thành có chức cụ thể như: hồng cầu, bạch cầu hạt, mono, lympho…Quá trình chia giai đoạn hay khu vực, bao gồm tủy xương, máu ngoại vi tổ chức (Hình 1) Hình 1.1: Sơ đồ phát triển tế bào gốc tạo máu Tế bào gốc phát triển nhờ trình tự tái sinh, trình sinh sản, biệt hóa trình chết theo chương trình Các hoạt động luôn điều hòa yếu tố kích thích phát triển yếu tố ức chế Khi sinh sản biệt hóa hoạt động mạnh nhờ yếu tố kích thích cytokin, chemokin, yếu tố phát triển đơn dòng, đa dòng… vượt ngưỡng bình thường yếu tố ức chế yếu tố đường chết theo chương trình tăng hoạt động Do đó, yếu tố tham gia điều chỉnh cân nội môi, cân trình sản sinh biệt hóa Các yếu tố tham gia trình phát triển bao gồm cytokin IL-3, IL-11, IL-6,… yếu tố kích thích GM-CSF, G-CSF, SF… 1.3 Một số yếu tố tham gia trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu Tác dụng cytokin giai đoạn khác trình phát triển biệt hóa dòng hồng cầu minh họa Hình 2, có vai trò IL-3, IL-11, GM-CSF Mỗi cytokin có tác dụng giai đoạn định trình phát triển biệt hóa, chúng thường có điểm tác động chung trình Các yếu tố có tác dụng dòng tiểu cầu, nhiên thời điểm tác dụng khác so với dòng hồng cầu (Hình 3) Riêng dòng bạch cầu, có vai trò IL-3, vai trò IL-11 (Hình 4) Hình 1.2: Vị trí tác dụng cytokin phát triển biệt hóa dòng hồng cầu Hình 1.3: Vị trí tác dụng cytokin phát triển biệt hóa dòng tiểu cầu Hình 1.4 : Vị trí tác dụng cytokin phát triển biệt hóa dòng bạch cầu 1.3.1 Interleukin-11 (IL-11) Với IL-11, định nghĩa ban đầu yếu tố hòa tan môi trường với tham gia chất cảm ứng IL-1α dòng tế bào đệm tủy xương, PU-34, cung cấp lâu dài cho trình nuôi cấy tế bào Hiện nay, IL-11 biết tới cytokin tạo máu với vai trò yếu tố sinh trưởng cho tế bào nguồn u tương bào (plasmacytomas), tế bào tạo máu tiềm năng, nguyên mẫu tiểu cầu, đại thực bào, đồng thời ức chế chứng phát phì với tiền tế bào mỡ Chính vậy, IL-11 có tên gọi khác yếu tố ức chế chứng phát phì Nhiều nghiên cứu tế bào mô quan IL-11 có hoạt tính bảo vệ hồi phục màng nhày hệ tiêu hóa; tác động tác nhân điều biến miễn dịch hay tham gia vào hoạt động trao đổi chất xương Trong thể người, gen hoàn chỉnh mã hóa cho IL-11 chiếm kích thước khoảng kb DNA hệ gen, định vị cánh dài nhiễm sắc thể số 19, vị trí 19q13.3-q13.4 Gen chứa vùng exon vùng intron Một điểm đặc biệt IL-11 nằm họ IL-6 trình tự DNA gen il-11 lại khó tìm thấy tương đồng cấp độ nucleotid Một vài vùng nằm đầu 5’ gen lại có trình tự nucleotid tương đồng đến 70% so sánh với gen mã hóa cho cytokin khác IL2, IL-3, IL-9 GM-CSF Interleukin-11 phân tử protein có mức độ ổn định cao trước điều kiện nhiệt độ cấu trúc không tồn acid amin cystein Dạng tiền IL-11 bao gồm 199 acid amin Đoạn peptid tín hiệu gồm 21 acid amin loại bỏ sau dịch mã để tạo nên dạng IL-11 có hoạt tính với 178 acid amin Mức độ tương đồng IL-11 người với thỏ 88%, với linh trưởng khác 94% Các vị trí acid amin 59 (methionin), 42 (lysin) 99 (lysin) vị trí cốt yếu để protein gắn kết với thụ thể Cấu trúc không gian IL-11 mô gồm chuỗi xoắn A, B, C, D (Hình 6) Tuy nhiên, vị trí asparagin để hình thành cấu trúc glycosyl hóa hay biến đổi chuỗi carbonhydrat Hơn nữa, với thành phần acid amin gồm prolin (12%), leucin (23%) acid amin tích điện dương khác (14%) làm điểm đẳng điện protein có giá trị khác với cytokin khác (pI = 11,7) Hình 1.5: Mô cấu trúc không gian IL-11 Trong thể, IL-11 tiết nhiều loại tế bào mô khác Về mức độ tiết IL-11 phát tế bào nguyên bào sợi, tế bào biểu mô phổi, tế bào sụn, tế bào dịch khớp, tế bào sừng, tế bào nội mô, nguyên bào xương, số dòng tế bào ung thư số tế bào khác Đã có nhiều nghiên cứu IL-11 không áp dụng sản 10 phẩm vào điều trị bệnh mà áp dụng vào nghiên cứu để sáng tỏ chế hay đường tác dụng interleukin thể Những hướng nghiên cứu tiến hành in vitro in vivo Trong in vitro, nghiên cứu chứng minh rằng, sinh phẩm IL-11 tác động lên nhiều dạng tế bào khác nhau, bao gồm tế bào tạo máu, tế bào gan, tế bào mỡ, đại thực bào, tế bào biểu mô ruột, tế bào khối u, tế bào tạo xương tế bào hủy xương Trong nghiên cứu dược phẩm in vivo, dạng cytokin tạo máu tiến hành tìm hiểu nhiều mô hình hóa trị liệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả ứng dụng yếu tố kích thích tạo tiểu cầu Các kết thu thử nghiệm chuột khỉ cho kết khả quan khả kích thích tạo tiểu cầu IL-11 Chính vậy, năm 1997, hãng Neumega quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (FDA) cấp phép cho việc áp dụng IL-11 tái tổ hợp để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu giảm bớt nhu cầu tiểu cầu trình truyền máu sau hóa trị liệu ức chế tủy bệnh nhân bị u tủy ác tính - người có nguy cao thiếu hụt tiểu cầu Hơn nữa, nghiên cứu gần xác nhận, IL-11 có hiệu điều trị riêng rẽ hay hiệp đồng với G-CSF bệnh nhân bị bệnh máu trắng bệnh ung thư liên quan đến tế bào máu 1.3.2 Interleukin-3 (IL-3) Trong số interleukin, IL-3 xem loại cytokin có phổ tác dụng rộng hệ thống tạo máu có nhiều chức thể Chính đa dạng chức đó, hoạt tính IL-3 nghiên cứu nhiều dòng tế bào khác Các tính chất hay hoạt tính IL-3 gắn liền với nhiều tên yếu tố kích thích tế bào bền vững, yếu tố hồng cầu người), công ty Biovision, Hoa kỳ cho thấy IL-11 có hoạt tính Trên sở đó, sử dụng mô hình tế bào gốc tạo máu tách từ tủy xương người bình thường suy tủy Vì đề tài tập trung vào 02 mục tiêu xây dựng quy trình tách nuôi cấy sau thử tác dụng sinh học .38 4.1 Phương pháp tách tế bào gốc nuôi cấy 38 Với phát triển khoa học công nghệ, việc tách nuôi cấy tế bào gốc nói chung tế bào gốc tạo máu nói riêng thực nhiều lab giới Việt nam Tách tế bào gốc thực theo nhiều cách khác nhau, tùy thuộc vào mẫu mục đích nghiên cứu/ứng dụng, phương pháp có ưu nhược điểm Chúng sử dụng phương pháp tách tế bào gốc từ tủy xương thử sử dụng mô hình tế bào gốc máu ngoại vi có sử dụng chất kích thích tủy xương Trong mô hình tách từ tế bào gốc tủy xương, dùng phương pháp tách từ ficoll 1.077 Một nhược điểm hai phương pháp tách hỗn hợp tế bào tủy/máu, khác tỷ lệ tế bào gốc hỗn hợp tế bào tách Phương pháp tách từ ficoll 1.077 làm tăng lượng tế bào đơn nhân/tế bào gốc từ tủy xương, chúng bảo quản nitơ lỏng sử dụng lâu dài tế bào dòng Vì số lượng tế bào thu thường nhiều 38 Trong quy trình tách tế bào gốc, có sử dụng 01 mẫu tế bào gốc làm giàu từ máu ngoại vi người cho có dùng chất kích thích tủy xương Với phương pháp thu nhiều tế bào gốc dành cho ghép tủy Theo Croop et al, 2000 lần gạn tách đạt 20x106 tế bào gốc CD34+/lít máu Với phương pháp số lượng tế bào gốc thu nhiều hơn, nhiên hỗn hợp tế bào thu có tế bào đơn nhân khác Các tế bào CD34+ thu khác với tế bào gốc tủy xương, kích thích chất kích thích Điều ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào thử tác dụng thuốc Kết cho thấy, tế bào thuộc nhóm chứng dương thử nghiệm cao so với nhóm chứng âm (Bảng 6) Chứng tỏ IL-11 có tác dụng phát triển tế bào gốc nuôi cấy, chúng kích thích in vivo trước Tiếc rằng, định lượng tế bào biệt hóa mẫu nuôi cấy, đánh giá chức biệt hóa tế bào IL-11 .39 Một quy trình tách khác tách riêng tế bào CD34+ theo phương pháp miễn dịch công nghệ hạt từ tách tự động Quần thể tế bào CD34+ đồng tốt thử tác dụng thuốc, chúng có nhiều lứa tuổi trung gian, đánh giá tốt phương pháp tách nêu Tuy nhiên, không thực chi phí cao chưa có phương tiện để thực .39 Tế bào gốc sau tách nuôi cấy môi trường StemPro 34 có bổ sung cytokin IL-3, GM-CSF SCF yếu tố cần thiết cho trình phát triển biệt hóa tế bào gốc dòng tế bào máu (Hình 2, 4) Kết nuôi cấy từ nguồn tế bào khác với môi trường cho trì phát triển tốt Số lượng tế bào chung tế bào CD34 tăng thời điểm thu hoạch sau 03 ngày nuôi cấy (Hình Bảng 1) Điều đó, chứng tỏ điều kiện nuôi cấy thích hợp cho phát triển 40 Heike T cộng (2002) nghiên cứu vai trò cytokin biệt hóa tế bào gốc, có yếu tố tế bào gốc (SCF), interleukin IL-3, cytokin GMCSF,…SCF yếu tố có vai trò điều hòa sinh máu giai đoạn sớm Trong nghiên cứu này, cho SCF không tác dụng tế bào gốc CD34+ tủy xương người nuôi cấy tạo cụm, phối hợp với IL-3 GM-CSF khả tăng sinh chúng lên gấp 12 lần Ngoài SCF làm tăng tế bào dòng hồng cầu nghiên cứu tạo cụm Còn IL-3 có vai trò lớn tế bào tạo máu chưa chín người, phối hợp với cytokin khác môi trường nuôi cấy có hiệu Đối với GM-CSF, có tác dụng lớn hoạt động chức bạch cầu khác 40 Sato et al, 1993 nghiên cứu vai trò CSF tái ổ hợp tế bào gốc máu ngoại vi với độ tinh khiết tách 94.5% CSF nghiên cứu riêng rẽ phối hợp với IL3 tế bào gốc dòng hồng cầu tạo cụm tăng lên 13 lần sau ngày nuôi cấy Nếu phối hợp với yếu tố khác GM-CSF, IL-3, Il-6, G-CSF phát triển tế bào gốc dòng hồng cầu tăng lên đến 57 lần Nếu xét đến tế bào CD34 có nhiều lứa tuổi khác Quá trình phát triển biệt hóa thực môi trường đánh giá biến động chúng môi trường nuôi cấy dấu ấn quan trọng thử tác dụng IL-11 40 Như vậy, việc tách tế bào gốc dùng cho nghiên cứu tiến hành nhiều cách Trong phương pháp tách qua ficoll có nhiều ưu điểm, khả thi lựa chọn cho việc tách sử dụng tế bào gốc nuôi cấy in vitro 41 Việc bảo quản tế bào dòng nói chung tế bào gốc nói riêng sử dụng phổ biến nghiên cứu y học ứng dụng lâm sàng Theo Chung C Doan cộng sự, 2012 tế bào gốc bảo quản nitơ lỏng không ảnh hưởng có ý nghĩa đến phát triển, biệt hóa tế bào sau đông nuôi cấy Quy trình bảo quản thấy thay đổi Các tế bào gốc thực đươc nhiều lần, tiết kiệm chi phí đặc biệt trường hợp lấy mẫu 41 4.2 Tác dụng IL-11 lên tế bào gốc tủy xương bình thường 41 Để đánh giá tác dụng sinh học IL-11 lên phát triển tế bào gốc tạo máu, sử dụng chứng âm, IL-11 chứng dương IL-11 thử nghiệm Kết thể phát triển tổng số tế bào, hình thái tế bào tế bào CD34+ .41 Số lượng tế bào tăng lên sau nuôi cấy so với trước nuôi cấy mẫu chưa thử thuốc Kết phù hợp với nghiên cứu hãng cung cấp môi trường nuôi cấy Trong trình nuôi cấy, với đầy đủ chất dinh dưỡng chất kích thích phát triển biệt hóa loại tế bào Một số tế bào chết đi, song số tế bào sinh nhiều hơn, làm tổng số tế bào tăng nhiều Mặc dù số lượng tế bào gốc CD34+ thu không nhiều từ 1/1000-1/10000 tế bào tách được, chúng tăng sinh tốt môi trường nuôi cấy .41 Về hình thái, tế bào tách chủ yếu tế bào đơn nhân (theo phương pháp ficoll 1.077), khó phát tế bào gốc nuôi cấy, số tế bào tăng lên, đồng thời có tế bào trung gian (Hình 9) Với đặc điểm tế bào nuôi cấy hình, cho thấy hình ảnh tủy đồ với lứa tuổi khác từ non đến tế bào trưởng thành Điều hiểu tế bào phát triển tiếp tục biệt hóa trình nuôi cấy 42 Tế bào CD34+ tăng cao nhóm chứng dương IL-11 thử nghiệm IL-11 so với chứng âm, đặc biệt tăng nhiều nhóm thử nghiệm Sự thay đổi có ý nghĩa thống kê p