LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý đào tạo sau Đại học, Thầy giáo, Cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện cho trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo, bạn đồng nghiệp Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện phụ sản Trung ương tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập trình thu thập số liệu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan TS Lương Thị Lan Anh, người thầy tận tình, trực tiếp hướng dẫn, bảo trình học tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ủng hộ, giúp đỡ động viên trình hoàn thành khóa học Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Lê Phương Thảo LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia kỹ thuật lai phân tử (Reverse hybridization)” đề tài thực hiện, tất số liệu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Nếu sai, xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Lê Phương Thảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Thalassemia 1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Đối tượng nghiên cứu .36 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.4 Cách thức tiến hành nghiên cứu .39 2.5 Hạn chế sai số nghiên cứu 47 2.6 Đạo đức nghiên cứu 47 2.7 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 48 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49 3.1 Một số đặc điểm đối tượng nghiên cứu 49 3.2 Phát đột biến gen gây bệnh Thalassemia phương pháp Reverse hybridization 50 3.3 Đánh giá giá trị phương pháp 57 CHƯƠNG BÀN LUẬN 66 4.1 Đặc điểm đối tượng tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 66 4.2 Phát đột biến gen gây bệnh Thalassemia kỹ thuật Reverse hybridization tỷ lệ loại đột biến 71 4.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật Reverse hybridization chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 77 KẾT LUẬN 83 Các đột biến gen phát kỹ thuật Reverse hybridization 83 Giá trị kỹ thuật Reverse hybridization chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 83 KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC .1 DANH MỤC VIẾT TẮT NST Nhiễm sắc thể DNA Deoxyribo Nucleotid Acid PCR Polymerase Chain Reaction SEA (Phản ứng khuếch đại chuỗi) South East Asia THAI FIL MED Hb Thailand Filipino Mediterranean Hemoglobin Α (Huyết sắc tố) alpha Β beta HBA Hemoglobin alpha HBB Hemoglobin beta ARMS-PCR MLPA Amplification Refractory Mutation System Polymera Chain Reaction Multiplex Ligation-dependent Probe NOR Amplification Normal (Bình thường) HET Heterozygous (Dị hợp tử) HOM ĐCTN Homozygous (Đồng hợp tử) Đình thai nghén MCV Thể tích trung bình hồng cầu MCH Lượng hemoglobin trung bình hồng cầu DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Bảng 1.1 Thành phần globin thời kỳ xuất Hb bình thường Bảng 1.2 Một số đột biến không đoạn tạo Hb bất thường [16], [20] Bảng 1.3 Kiểu gen thể bệnh α-thalassemia .13 Bảng 1.4 Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp người Việt Nam [11] 18 Bảng 1.5 Các đột biến đoạn thalassemia chẩn đoán gapPCR .23 Bảng 1.6 Các đột biến gen β globin mồi đặc hiệu 26 Bảng 1.7 Các dạng đột biến phát β-Globin StripAssaySEA 30 Bảng 1.8 Các dạng đột biến phát α-Globin StripAssay 31 Bảng 2.1 Các số nghiên cứu 38 Bảng 2.2 Chỉ dẫn cách đánh giá đột biến Teststrip .44 Bảng 2.3 Các bước sàng lọc đột biến vùng gen α globin 46 Bảng 2.4 Các bước sàng lọc đột biến vùng gen β globin 46 Bảng 3.1 Đặc điểm dân tộc thai phụ 49 Bảng 3.2 Tuổi thai thời điểm chọc hút dịch ối đối tượng nghiên cứu 49 Bảng 3.3 Tiền sử đẻ Thalassemia 49 Bảng 3.4 Tiền sử phù thai .50 Bảng 3.5 Tỷ lệ phát đột biến 50 Bảng 3.6 Phân bố loại đột biến 50 Bảng 3.7 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh α -thalassemia .52 Bảng 3.8 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia 53 Bảng 3.9 Kiểu gen thai chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia 54 Bảng 3.10 Kiểu gen trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh βthalassemia 54 Bảng 3.11 Kết chẩn đoán trước sinh cho 11 gia đình có đầu mắc HbH β-thalassemia thể nặng 55 Bảng 3.12 Đối chiếu kết phân bố kiểu gen thai từ phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR Reverse hybridization 57 Bảng 3.13 Đối chiếu kết xác định dạng đột biến cụ thể .57 Bảng 3.14 So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc αthalassemia) 59 Bảng 3.15 So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc βthalassemia) 60 Bảng 4.1 So sánh đặc diểm phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR Reverse hybridization chẩn đoán Thalassemia 80 DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Hình 1.1 Sự phân bố gen globin NST sản phẩm Hb Hình 1.2 Vị trí gen α globin NST 16 Hình 1.3 Sự xếp gen chức cụm gen α Hình 1.4 Cơ chế hình thành đoạn 3.7kb 4.2kb gen α Hình 1.5 Một số đột biến đoạn gen α globin 10 Hình 1.6 Vị trí gen β globin NST 11 .14 Hình 1.7 Năm đột biến xẩy (đóng khung) vị trí đầu intron thứ gen  globin 17 Hình 1.8 Chẩn đoán đột biến đoạn α+-thalassemia multiplex gap-PCR 24 Hình 1.9 Chẩn đoán đột biến đoạn α0-thalassemia multiplex gapPCR .24 Hình 1.10 Chẩn đoán β-thalassemia ARMS-PCR 25 Hình 1.11 Các vị trí đột biến Teststrip β-Globin StripAssay SEA 32 Hình 1.12 Các vị trí đột biến Teststrip α-Globin StripAssay 33 Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu .39 Biểu đồ 3.1 Các loại đột biến gây bệnh α-thalassemia 51 Biểu đồ 3.2 Các loại đột biến gây bệnh β-thalassemia 52 Hình 3.1 Đồng hợp tử đột biến SEA 61 Hình 3.2 Dị hợp tử đột biến SEA 62 Hình 3.3 Không phát đột biến gen .63 Hình 3.4 Đồng hợp tử đột biến CD17 64 Hình 3.5 Dị hợp tử đột biến kép CD41/42 / CD26 65 Hình 4.1 Sơ đồ sàng lọc trước sinh bệnh Thalassemia 69 ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia dạng bệnh huyết sắc tố - hemoglobin (HST Hb) phổ biến giới Bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân đột biến gen gây giảm không tổng hợp protein globin tham gia cấu tạo Hb, dẫn đến thiếu hụt Hb hồng cầu Trên giới, ước tính 7% dân số mang gen bệnh năm có khoảng 300.000 ÷ 500.000 trẻ sinh với thể đồng hợp tử nặng bệnh Tại Việt Nam, có khoảng triệu người mang gen bị bệnh Thalassemia, hàng năm có thêm 100.000 trẻ mang gen bệnh 1.700 trẻ mắc bệnh nặng đột biến gen sinh Bệnh chia làm loại alpha thalassemia (α-thalassemia) beta thalassemia (β-thalassemia) tùy thuộc vào loại đột biến xảy gen α (quy định tổng hợp chuỗi alpha globin, nằm nhiễm sắc thể số 16) hay gen β (quy định tổng hợp chuỗi beta globin, nằm nhiễm sắc thể số 11) Theo thống kê, có 300 đột biến gen α 200 đột biến gen β có liên quan đến bệnh Thalasemia , Cá thể đồng hợp tử mang alen đột biến αthalassemia loại SEA/ SEA gây bệnh Hb Bart’s, thể nặng bệnh α-thalassemia Thai nhi mắc Hb Bart’s thường bị phù rau thai, thai chết lưu tử cung chết sớm sau sinh Thể đặc biệt phổ biến nước Đông Nam Á Việt Nam, Thái Lan, Philippines Bệnh nhân β-thalassemia thể nặng hay gọi thể Cooley, đồng hợp tử dị hợp tử kép đột biến khác nhau, thường có biểu thiếu máu nặng dần sau ÷ tháng tuổi, phụ thuộc vào truyền máu thải sắt suốt đời Người bệnh Thalassemia thể ẩn người có kiểu gen dị hợp tử mang alen đột biến, có thiếu máu nhược sắc huyết đồ lại biểu lâm sàng Phương pháp điều trị chủ yếu bệnh Thalassemia truyền máu, thải sắt, cắt lách điều trị biến chứng cần , , Quá trình tốn mà hiệu không cao Vì thế, bệnh trở thành gánh nặng không cho bệnh nhân gia đình mà cho toàn xã hội [9] Đối với trường hợp gia đình có bố mẹ người mang gen bệnh tiền sử sinh Thalassemia biện pháp sàng lọc chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia có ý nghĩa quan trọng phương pháp phòng ngừa hiệu Ở Việt Nam, để chẩn đoán bệnh Thalassemia sử dụng phương pháp multiplex PCR (PCR đa mồi) để sàng lọc đột biến: đột biến đoạn lớn gen α globin như: SEA (South East Asia), THAI (Thailand), FIL (Philippin), -α4.2, -α3.7 đột biến điểm HbQs, HbCs đột biến phổ biến gen β globin gây 95% trường hợp β-thalassemia bao gồm: CD17 (AAG>TAG), CD41/42 (-TCTT), -28 (A>G), CD71/72 (+A), IVS 1.1 (G>T), IVS 1.5 (G>C), IVS 2.654 (C>T) CD26 (GAG>AAG) , xác định kiểu gen kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction) giải trình tự vùng gen globin Các phương pháp dễ dàng áp dụng cho việc phát đột biến đơn lẻ biết, lại khả xác định lúc nhiều đột biến Hiện nay, kỹ thuật lai phân tử kỹ thuật dùng để chẩn đoán thay phương pháp Kỹ thuật Reverse hybridization (lai phân tử ngược) cải tiến sở kỹ thuật lai phân tử phát lúc nhiều đột biến khác gen Kỹ thuật Reverse hybridization ứng dụng hiệu xác định đồng nhiễm genotype virus sinh u nhú người (HPV) Tuy nhiên, Việt Nam, kỹ thuật chưa áp dụng chẩn đoán bệnh Thalassemia Đây quy trình mới, có nhiều ưu điểm so với phương pháp áp dụng, tiến hành nghiên cứu: “Chẩn đoán trước sinh bệnh khả vận chuyển oxy đến tổ chức thể Tuy nhiên, thai tồn giai đoạn đầu nhờ lượng nhỏ huyết sắc tố phôi thai Portland (ζ2γ2) Portland (ζ2β2) Tuy nhiên, lượng Hb tổng hợp không đủ cho phát triển bình thường thai nhi, đặc biệt tháng cuối thai kỳ Do hậu thiếu máu từ giai đoạn đầu phôi thai, thai nhi mắc Hb Bart’s thường có biểu nhiều bất thường bẩm sinh liên quan đến tim, xương, hệ tiết niệu, hệ thần kinh, thai nhi thường chết bụng mẹ sau sinh Hơn nữa, thai nhi bị phù dẫn tới biến chứng cho người mẹ tiền sản giật, xuất huyết, thiếu máu, hay nhiễm trùng huyết [83], [84], [85], [86] Do tỷ lệ người mang gen bệnh α-thalassemia chung toàn giới cao (miền bắc Thái Lan Lào 30 ÷ 40%; nam Trung Quốc 8,53%; Malaysia 4,5%; Philippin 5%) [71], [72], [73], đặc biệt, người mang gen α 0-thalassemia phổ biến khu vực Đông Nam Á - nguyên nhân dẫn tới hội chứng phù thai Hb’s Bart bệnh Hb H nước Đông Nam Á Bên cạnh đó, mức độ nghiêm trọng hội chứng Hb Bart’s thai nhi thân người mẹ, việc chẩn đoán trước sinh sớm thai mắc Hb Bart’s có vai trò quan trọng, từ có thái độ xử trí kịp thời thai, tránh tình trạng phù thai xuất giai đoạn muộn biến chứng xảy sản phụ α globin StripAssay (Viennalab, Austria) dựa sở phương pháp Reverse Hybridization Bộ kit đáp ứng tiêu chuẩn ISO, tất sản phẩm đánh dấu CE (Conformité Européene) IVD (In Vitro Diagnostics) Theo khuyến cáo nhà sản xuất, nồng độ DNA mẫu cần từ ÷ 10ng/μl, sản phẩm PCR kiểm tra điện di, vạch băng hiển thị giúp xác định xác sản phẩm PCR cần lai, phương pháp có độ đặc hiệu cao Nhiều nghiên cứu tác giả giới chứng tỏ Globin StripAssay phương pháp đơn giản, nhanh, hiệu việc phát đột biến gen gây bệnh Thalassemia [51], [57], [58], [59], [60] Hiện nay, kit Globin StripAssay ứng dụng nhiều nước giới như: Áo, Iran, Singapore, Thái Lan… Vì thế, kết phương pháp đáng tin cậy có ý nghĩa chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia, qua có tư vấn kịp thời thai phụ gia đình Trong 48 thai xác định người lành mang gen bệnh bình thường, có trường hợp siêu âm có hình ảnh phù thai Như vậy, 10 trường hợp có phù thai siêu âm, có 8/10 trường hợp (80%) xác định thai mắc Hb Bart’s Như biết, có nhiều nguyên nhân gây phù thai như: miễn dịch, nhiễm trùng, bệnh lý di truyền Tuy nhiên, Đông Nam Á, bệnh Hb Bart’s nguyên nhân gây phù thai tháng cuối thai kỳ, chiếm tỷ lệ 60 ÷ 90%, đồng hợp tử đoạn gen SEA [91], [92] Nếu siêu âm dấu hiệu gợi ý trường hợp phù thai Hb Bart’s, thai mắc β-thalassemia không phát thấy bất thường siêu âm Các thai mắc β-thalassemia thể nặng không bị lưu thai hay tử vong sau sinh, em bé mắc β-thalassemia thể nặng thường có biểu thiếu máu sau sinh, phải truyền máu thường xuyên có nhiều biến chứng nặng nề Điều không ảnh hưởng đến thân người bệnh gia đình, mà gánh nặng cho toàn xã hội Do đó, việc chẩn đoán trước sinh kỹ thuật di truyền phân tử quan trọng việc xác định trường hợp thai mắc β-thalassemia thể nặng, góp phần cho đời đứa trẻ khỏe mạnh Việc có ý nghĩa đặc biệt gia đình có tiền sử đẻ mắc β-thalassemia thể nặng (13/28 trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia), tránh gánh nặng tâm lý cho thân thai phụ gia đình họ Trong 22 trường hợp thai sàng lọc βthalassemia xác định người lành mang gen bệnh không phát đột biến, có 12 thai sinh khỏe mạnh chưa phát thấy dấu hiệu bệnh thiếu máu Hy vọng nghiên cứu sau này,thời gian nghiên cứu dài hơn, tiến hành theo dõi dọc tất trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia KẾT LUẬN Các đột biến gen phát kỹ thuật Reverse hybridization - Tỷ lệ phát nhiều đột biến gen gây bệnh 69,6% - Với α-thalassemia: đột biến dạng SEA chiếm tỷ lệ cao (88,9%), sau -α3.7 (6,7%) -(α)20.5 (4,4%) Đặc biệt phát trường hợp mang đột biến -(α)20.5 (4,4%) đột biến gặp người Việt Nam - Với β-thalassemia: có đột biến phát bao gồm: CD17, CD41/42, CD26, CD95, CD71/72 IVS 1.1 Chiếm tỷ lệ cao CD17 CD41/42 (đều 29,4%) - Trong 92 thai phụ, có 61 trường hợp có nguy Hb Bart's, HbH 28 β-thalassemia Phát 22 thai (23,9%) mắc bệnh thể nặng (trong 16 thai mắc Hb Bart's thai β-thalassemia), 36 thai (39,1%) người lành mang gen đột biến 34 thai không phát đột biến (tỷ lệ 37%) Giá trị kỹ thuật Reverse hybridization chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia - Trong 14 mẫu dịch ối tiến hành sàng lọc đột biến phương pháp ARMS-PCR Reverse hybridization, kết giống 100% - Reverse hybridization chứng tỏ phương pháp có nhiều ưu điểm: nhanh chóng, dễ thực đáng tin cậy giúp sàng lọc 90% đột biến gây bệnh Thalassemia giới, đặc biệt vùng Đông Nam Á - Trong tương lai, với việc tăng thêm đầu dò với đột biến cho lai (Teststrip) Reverse hybridization, tin tưởng kỹ thuật trở thành phương pháp tốt việc phát người mang gen chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia Việt Nam KIẾN NGHỊ - Nên sàng lọc bệnh Thalassemia cho tất thai phụ đến khám thai - Đề xuất ứng dụng kỹ thuật Reverse hybridization chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia phát người mang gen bệnh Thalassemia Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Cappellini M.D., Cohen A., Eleftheriou A et al (2008), Guidelines for the Clinical Management of Thalassaemia, second edition, Thalassemia International federation Nguyen Khac Han Hoan (2005) Thalasemie and a model of prevention in Viet Nam, The university of Sydney, Sydney Sand A.M and Al-zzanie H.F (2013) Molecular study on β-thalassemia patient in Iraq Aizeopublisher.net, 4, 160-165 John S.Waye and David H.K Chui (2001) The α globin gene cluster: genetics and disorders Clin Invest Med., 24(2), 103-109 John Old (2013), Prevention of Thalassemias and other haemoglobin disorders, 2nd edition, Thalassemia International Federation Felicia L Trachtenberg and Lauren Mednick (2012) Beliefs about chelation among Thalassemia patients, Heath and Quality of life outcomes Kamal Mansi, Talal Aburjaii, Mohamed Albashtawy et al (2013) Biochemical factors relevant to kidney funtions among Jordanian children with β-thalassemia major treated with deferoxamin International Journal of Medicine and Medical Sciences, 5(8), 374-379 Dudley J Pennell, James E Udelson, Arai A.E (2013) Cardio vascular function and treatment in β-thalassemia major: a consensus statement from the American Heart Association Circulation, 128, 281-308 Borgna-Pignatti C and Gamberini M.R (2011) Complications of thalassemia major and their treatment Expert Rev Hematol, 4(3), 353-366 10 Old J.M (2003) Screening and genetic diagnosis of haemoglobin disorders Blood reviews, 17(1), 43-53 11 M.L Saovaros Svasti, Tran Minh Hieu, Thongperm Munkongdee et al (2002) Molecular analysis of beta-thalassemia in South Viet Nam American Journal of Hematology, 71, 85-88 12 R M Schultz and M.N Liebman (1992), Protein II: Structure Function relationship of protein families, Text book of biochemitry with clinical correlation, New York, 91-134 13 Bạch Quốc Tuyên, Nguyễn Công Khanh (1991), Bệnh huyết cầu tố di truyền, Bài giảng Huyết học - Truyền máu, Nhà xuất Y học, Hà Nội 14 Trịnh Văn Bảo (2011), Di Truyền Y Học, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, 99-104 15 http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBA1 16 Douglas R Higgs (2013) The Molecular Basic of α-Thalassemia Cold Spring Harb Perspect Med., 3(1), 101-171 17 Renzo Galanello (2011) α-thalassemia Genetics of Medicine, 13(2), 8388 18 Sammer A Bleibel, Robert J Leonard, Jennifer L Jones-Crawford et al (2000) Emedicine 19 Martin H Steinberg, Bernard G Forget, Douglas R Higgs (2009), Disorders of Hemoglobin Second edition, Cambridge University Press, New York 20 Rugless M.J et al (2008) A large deletion in the human α-globin cluster caused by a replication error is associated with unexpectedly mild phenotype Hum Mol Genet, 17, 3084-3093 21 David H.K Chui and John S Waye (1998) Hydrops Fetalis Caused by α-Thalassemia: An Emerging Health Care Problem Bloodjournal, 91(7), 34-35 22 H.H Jr Kazazian, C.E Dowling, P.G Waber et al (1986) The spectrum of beta thalassemia genes in China and Southeast Asia The American Society of Hematology, 68, 964-966 23 Nguyễn Công Khanh (1985), Một số đặc điểm lâm sàng huyêt học bệnh β-thalassemia người Việt Nam, Luận án Phó Tiến sỹ khoa học Y dược, Trường Đại học Y Hà Nội 24 Nguyễn Công Khanh (1993) Tần suất bệnh hemoglobin Việt Nam Y học Việt Nam, 8, 11-16 25 Nguyễn Đắc Lai, Lê Thị Sửu, Thái Quý cộng (1985) Sự lưu hành bệnh huyết sắc tố số dân tộc người miền Bắc miền Trung Việt Nam Y học Việt Nam, 16-21 26 Niehuis R.W and Wolfe A (1987), Disorders of Hemoglobin, Hematology of infancy and childhood, Saunders company, New York 27 http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBB 28 Antonio Cao, Vilma Gabutti, Giuseppe Masera et al (1992) Điều trị thải sắt, Chuyên đề thalasemia Y học Việt Nam (người dịch Tạ Thu HòaNguyễn Công Khanh), 95-100 29 Trần Văn Bé cộng (1997), Sử dụng Desferal bệnh Thalassemia, Chuyên đề thalasemia Y học Việt Nam, 92-98 30 Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực (1984) Một số đặc điểm bệnh Beta Thalassemia Y học thực hành, 1, 20-23 31 A Beauder (1996), Genetics and disease, Harrison principles of internal Medicine, USA, 365-409 32 Old J and Henderson S (2010) Molecular diagnostics for haemoglobinopathies Expert Opin Med Diagn, 4(3), 225-240 33 Harteveld C L., Kleanthous M., Traeger-Synodinos J (2009) Prenatal diagnosis of haemoglobin disorders: present and future strategies Clin Biochem, 42(18), 1767-1779 34 Fabry M and Old J M (2009), Laboratory methods for diagnosis and elevation of haemoglobin disorders, Disorders of Hemoglobin, 2nd Edition, Cambrige University Press, Cambrige, 658-686 35 Old J.M (2010), Prenatal Diagnosis of Haemoglobinopathies, Genetic Disorders and the fetus Sixth Edition, Blackwell Publishing, Oxford, 646-679 36 Bowden D K., Vickers M A., Higgs D R (1992) A PCR-based strategy to detect the common severe determinants of a-thalassaemia Brit J Haemat, 81,104-108 37 Baysal E., Huisman T H J (1994) Detection of common deletional αthalassaemia-2 determinants by PCR Am J Hematol., 46, 208 38 Liu Y T., Old J M., Fisher C A et al (1999) Rapid detection of athalassaemia deletions and a-globin gene triplication by multiplex polymerase chain reactions Brit J Haemat, 108, 295-299 39 Chong S S., Boehm C D., Higgs D R et al (2000) Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of αthalassemia Blood, 95, 360-362 40 Dimovski A J., Efremove D G., Jankovic L et al (1993) A β thalassaemia due to a 1605 bp deletion of the 5’ β-globin gene region Brit J Haemat, 85, 143-147 41 Lynch J R., Brown J M., Best S et al (1991) Characterisation of the breakpoint of a 3.5 kb deletion of the β-globin gene Genomics, 10, 509-511 42 Craig J E., Kelly S J., Barnetson R et al (1992) Molecular characterisation of a novel 10.3 kb deletion causing β-thalassaemia with unusually high Hb A2 Brit J Haemat, 82, 735-744 43 Waye J S., Eng B., Chui D H K et al (1994) Filipino β-thalassaemia due to a large deletion: identification of the deletion endpoints and polymerase chain reaction (PCR)-based diagnosis Hum Genet, 94, 530-532 44 Old J M., Varawalla N Y., Weatherall D J (1990) The rapid detection and prenatal diagnosis of beta thalassaemia in the Asian Indian and Cypriot populations in the UK Lancet, 336, 834-837 45 Thein S L., Hesketh C., Brown K M et al (1989) Molecular characterisation of a high A2 β thalassaemia by direct sequencing of single strand enriched amplified genomic DNA Blood, 73, 924-930 46 Craig J E., Barnetson R A., Prior J et al (1994) Rapid detection of deletions causing thalassemia and hereditary persistence of fetal hemoglobin by enzymatic amplification Blood, 83, 1673-1682 47 John Old, Cornelis L Harteveld, Joanne Traeger-Synodinos (2012), Prevention of Thalassaemias and Other Haemoglobin Disorders, 2nd edition, Thalassemia International Federation 48 Newton C R., Graham A., Heptinstall L E (1989) Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Research, 17, 2503-2516 49 Old J M., Khan S N., Verma, et al (2001) A multi-centre study to further define the molecular basis of beta-thalassemia in Thailand, Pakistan, Sri Lanka, Mauritius, Syria, and India, and to develop a simple molecular diagnostic strategy by amplification refractory mutation system polymerase chain reaction Hemoglobin, 25, 397 50 Yong-Chui Wee, Kim-Lian Tan, Elizabeth Geogre et al (2009) Molecular characterisation of Haemoglobin Constant Spring and Haemoglobin Quong Sze with a Combine-Amplification Refractory Mutation System Malaysian Journal of Medical Sciences, 16(3), 167-174 51 Puehringer H., Najmabadi H., Law H.Y et al (2007) Validation of a reverse-hybridization StripAssay for the simultaneous analysis of common alpha-thalassemiapoint mutations and deletions Clin Chem Lab Med, 45(5), 605-610 52 Lê Thị Hảo (2001) Nghiên cứu ứng dụng di truyền sinh học phân tử phát đột biến gen gây bệnh β-thalassemia Việt Nam, Báo cáo khoa học, Trường Đại học Y dược TP Hồ chí Minh, TPHCM 53 Department of molecular and clinical genetics - Royal Prince Alfred Hospital -Australia Beta thalassemia protocols (2005) 54 Saiki R K., Walsh P S., Levenson C H et al (1989) Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes Proceedings of the National Academy of Sciences, 86, 6230-6234 55 Sutcharitchan P., Saiki R., Fucharoen S et al (1995) Reverse dotblot detection of Thai beta-thalassaemia mutations Brit J Haematol, 90, 809-816 56 Giambona A., Lo Gioco P., Marino M et al (1995) The great heterogeneity of thalassemia molecular defect in Sicily Human Genetics, 95, 526-530 57 Hossein Najmabadi, Shahram Teimourian, Talayeh Khatibi et al (2001) Amplification Refractory Mutation System (ARMS) and Reverse hybridization in the detection of beta-thalassemia mutations Arch Irn Med., 4(4), 165-170 58 Abdulalimov E R., Asadov C D., Mamedova T A et al (2014) The comparative characteristic of two methods of detection of mutation of beta-globin gene Klin Lab Diagn., 1, 56-59 59 E George, L K Teh, R Rosli et al (2012) Beta Thalassaemia Mutations in Malays: A Simplified Cost-effective Strategy To Identify the Mutations Malaysian Journal of Medicine and Health Sciences, (1), 40-49 60 Pranee Winichagoon, Vannarat Saechan, Roongrat Sripanich et al (1999) Prenatal Diagnosis of β-thalassaemia by Reverse Dot-blot Hybridization Prenatal Diagnosis, 19, 428-435 61 Nguyễn Khắc Hân Hoan, Phạm Việt Thanh, Trương Đình Kiệt cộng (2011) Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia 290 trường hợp thai Tạp chí nghiên cứu y học, 3, 34-35 62 Lý thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Ngô thị Tuyết Nhung cộng (2015) Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán trước sinh bệnh Beta Thalassemia Bệnh viện Nhi Trung ương từ 2008-2015 Tạp chí y học Việt Nam, 434, 170-177 63 Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai cộng (2010) Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán trước sau sinh bệnh alpha Thalassemia bệnh viện Nhi Trung ương Tạp chí Nhi khoa, 3(3,4), 337-342 64 Ali Ayçiçek, Ahmet Koç, Zeynep Canan Özdemir et al (2011) Betaglobin gene mutations in children with beta-thalassemia major from Şanlıurfa province, Turkey Turk J Hematol, 28, 264-268 65 Guvenc B., Yildiz S M., Tekinturhan F et al (2010) Molecular characterization of alpha-Thalassemia in Adana, Turkey: A single center study Acta Haematol., 123(4), 197-200 66 Mohammad S R., Sirous Zeinali, Abdolreza A et al (2011) βthalassemia mutations found during year of prenatal diagnoses in fars province, Iran Hemoglobin, 35(4), 331-337 67 Douglas Wilson R (2006) Early amniocentesis: risk assessement Prenatal diagnosis, 35, 423-432 68 Trần Danh Cường (2006), Một số nhận xét dấu hiệu gợi ý siêu âm trường hợp thai nhi có bất thường nhiễm sắc thể, Hội nghị khoa học chuyên đề chẩn đoán trước sinh, Sở y tế Hà Nội 69 Nguyễn Thị Hoàng Trang (2011), Đánh giá kết chọc ối phân tích nhiễm sắc thể thai nhi Bệnh viện Phụ sản Trung Ương năm 2006-2011, Luận văn thạc sỹ Y học, Hà Nội 70 Zang lin, Zhang Xiao-hong et al (2010) Prenatal cytogenetic diagnosis study of 2782 cases of high risk pregnant women Chinese Medical Journal, 123(4), 423-443 71 Rahimah Ahmad et al (2013) Distribution of a Thallassemia Gene Variants in Diverse Ethnic Populations in Malaysia: Data from the Institue for Medical Research Int J Mol Sci., 14, 1859-1861 72 X M Xu et al (2004) The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassemia in Guangdong Province: implications for the future heath burden and population screening J Clin Pathol, 57, 517-522 73 Wibhasiris Srisuwan et al (2013) Diagnosis of thalassemia carriers commonly found in Nothern Thailand via a combination of MCV or MCH and PCR-based methods Bulletin Chiang Mai Associated Medical Sciences, 46, 22-32 74 Fucharoen S and Winichagoon (1992) Thalassemia in Southeast Asia: problems and strategy for prevention and control Southeast Asia Journal of Tropical Medicine and Public Health, 23(4), 647-655 75 Schu-Rern Chern, Chih-Ping Chen (2000) Molecular prenatal diagnosis of Thalassemia in Taiwan International Journal of Gynecology & Obtetrics, 69, 103-106 76 Jin Ai Mary A., Juan Loong K., Kim Lian T et al (2009) Thalassemia intermedia in HbH-CS disease with compound heterozygosity for βthalassemia: Challenges in haemoglobin analysis and clinical diagnosis Genes Genet Syst, 84, 67-71 77 Lý Thị Thanh hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai cộng (2011) Áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR chẩn đoán trước sau sinh bệnh beta thalassemia bênh viện Nhi Trung Ương Tạp chí Nhi Khoa, 4, 67-73 78 Bùi văn Viên, Dương Bá Trực, Nguyễn Công Khanh (1999) Nhận xét bước đầu sở di truyền phân tử mối quan hệ kiểu gen với mức độ thiếu máu thể tích hồng cầu bệnh HbE/β Thalassemia tạp chí Nhi Khoa, 8, 123-129 79 Filon D., Oppenheim A., Truc D et al (2000) Molecular analysis of beta thalassemia in Viet Nam Hemoglobin, 24(2), 99-104 80 Ngô Diễm Ngọc, Lý thị Thanh Hà, Ngô thị Tuyết Nhung cộng (2015) Sàng lọc chẩn đoán trước sinh bệnh α β thalassemia thai phụ nguy cao bệnh viện nhi Trung ương Tạp chí Y học Việt Nam, 434, 83-92 81 Cornelis L (2010) Review of alpha Thalassemia Orphanet Journal of Rare Disease, 5, 13-19 82 Kutlar F (2008) An α2 Globin gene Initiation codon mutation in a vietnamese patient with HbH disease Ann N Y Acad Sci, 398, 400 83 Renzo Galanello (2011) α-thalassemia Genetics in Medicine, 13(2), 83-88 84 D J Weatherall (2001) Phenotype-genotype relationships in monogenic disease: lesson from the thalassemias Genetics, 2, 56-67 85 Herbert L Muncie (2009) Alpha and Beta Thalassemia American Family Physican, 80(4), 456-462 86 Rugless M J et al (2008) A large deletion in the human α globin cluster caused by a replication error is associated with an unexpectedly mild phenotype, Hum Mol Genet, 17, 3084-3093 87 Ngô Diễm Ngọc, Lý thị Thanh Hà, Ngô thị Tuyết Nhung cộng (2015) Chẩn đoán trước sinh bệnh HbH phù thai HB Bart’s bệnh viện Nhi Trung ương Tạp chí Y học Việt Nam, 434,115-120 88 Galanello R., Sollaino C., Paglietti E et al (1998) α-thalassemia carrier identification by DNA analysis thalassemia Am JHematol, 59, 273-278 in the screening of 89 Kanavakis E., Papassotiriou I., Karagiorga M et al (2000) Phenotypic and molecular diversity of haemoglobin H disease: a Greek experience Br J Haematol, 111, 915-923 90 Harteveld C L., Yavarian M., Zorai A et al (2003) Molecular spectrum of alpha-thalassemia in the Iranian population of Hormozgan: three novel point mutation defects Am J Hematol, 74, 99-103 91 Chui D.H (2005) Alpha-thalassemia: Hb H disease and Hb Barts hydrops fetalis Ann N Y Acad Sci, 1054, 25-32 92 Jingzhong L (2011) A novel large deletion causing Hb Bart’s Hydrop Fetalis in South China, Ann Hematol, 90, 125-126 91 Thein S L., Hesketh C., Wallace R B., Weatherall D J (1988) The molecular basis of thalassaemia major and thalassaemia intermedia in Asian Indians: Application to prenatal diagnosis Brit J of Haematol, 70, 225-231 92 Wong C., Antonarakis S E., Goff S C et al (1986) On the origin and spread of β- thalassemia: Recurrent observation of four mutations in different ethnic groups Proc Natl Acad Sci USA, 83, 6529-6532 PHỤ LỤC BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Họ tên sản phụ: Tuổi mẹ: Mã số phiếu: 20 - 24 tuổi Từ 25 - 29 tuổi Từ 30 - 35 tuổi Từ 35 - 39 tuổi > 40 tuổi Dân tôc: Nghề nghiệp: Tuổi thai: < 15w Từ 16 - 18w Tiền sử: 6.1 Sinh lần 6.2 Sảy thai, thai chết lưu: Một lần Hai lần 6.3 Đã có bị Thalassemia: Không có > Ba lần 6.4 Con bị dị tật khác: 6.5 Bố mẹ mang gen thalassemia: 6.6 Tiền sử gia đình (có người đươc chẩn đoán Thalassemia) Siêu âm: Bình thường 10 Kết chọc ối 11 Kết máu bố,mẹ Có bất thường ... nay, kỹ thuật lai phân tử kỹ thuật dùng để chẩn đoán thay phương pháp Kỹ thuật Reverse hybridization (lai phân tử ngược) cải tiến sở kỹ thuật lai phân tử phát lúc nhiều đột biến khác gen Kỹ thuật. .. cứu: Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization) ”, với mục tiêu: Phát đột biến gen gây bệnh Thalassemia kỹ thuật Reverse hybridization chẩn đoán trước. .. lệ sinh trẻ bị bệnh Thalassemia 1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 1.2.1 Một số kỹ thuật di truyền phân tử thường dùng để chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia Việt Nam Bệnh