1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hơn 30 năm kể từ em bé đời từ thụ tinh ống nghiệm (TTTON), ngành hỗ trợ sinh sản đạt nhiều thành tựu đáng kể nhằm nâng cao khả làm mẹ bệnh nhân vô sinh Kích thích buồng trứng (KTBT) trở thành thường quy nhằm tạo nhiều noãn, nhiều phôi, tăng hội có phôi chuyển cho bệnh nhân, từ tăng tỷ lệ thành công TTTON Do khả có phôi dư sau chuyển phôi kích buồng trứng thường hay xảy Trên sở đó, kỹ thuật trữ lạnh phôi đời trở thành phận thiếu điều trị vô sinh TTTON Thành công kỹ thuật trữ lạnh phôi làm tăng tỷ lệ có thai cộng dồn sau chuyển phôi tươi chuyển phôi đông lạnh, giảm nguy kích buồng trứng nặng góp phần không nhỏ việc giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân Trữ lạnh phôi kỹ thuật bảo quản phôi nguyên trạng ban đầu thời gian dài Điều đạt cách lưu giữ phôi nhiệt độ nitơ lỏng (-1960C), làm ngưng phản ứng enzyme nội bào, hô hấp, chuyển hóa…, giúp chúng tiếp tục phát triển bình thường sau thời gian dài đông lạnh Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới thành công chu kỳ chuyển phôi đông lạnh tuổi mẹ, chất lượng niêm mạc tử cung chất lượng phôi sau rã đông… Trong chất lượng phôi sau rã đông phụ thuộc vào kỹ thuật trữ lạnh thời điểm trữ lạnh phôi Kỹ thuật trữ lạnh phôi gồm ba phương pháp trữ lạnh chậm (slow freezing), trữ lạnh nhanh (fast cooling) trữ lạnh cực nhanh – thủy tinh hóa (vitrification) Các kỹ thuật áp dụng trữ lạnh phôi giai đoạn khác như: giai đoạn phôi tiền nhân, phôi phân chia giai đoạn sớm (phôi ngày 2, phôi ngày 3) hay giai đoạn phôi nang Tuy nhiên, đời kỹ thuật đông phôi thủy tinh hóa thể ưu vượt trội phương pháp trữ lạnh việc trữ phôi vào giai đoạn tối ưu tranh cãi Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia – bệnh viện phụ sản Trung Ương áp dụng thường quy kỹ thuật đông phôi phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) từ năm 2009, phôi thường đông vào giai đoạn phôi Tuy nhiên thời điểm đông phôi ngày hay ngày chủ yếu dựa vào kinh nghiệm thuận tiện, chưa có nghiên cứu đề tài Vì vậy, với mục đích tìm hiểu thời điểm trữ lạnh - rã đông phôi tối ưu nhằm tăng tỷ lệ thành công chu kỳ chuyển phôi đông lạnh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhận xét kết chuyển phôi đông lạnh kỹ thuật trữ lạnh phôi ngày phôi ngày bệnh viện phụ sản Trung Ương” nhằm hai mục tiêu: Đánh giá kết chuyển phôi phôi trữ lạnh phương pháp thủy tinh hóa vào tuổi phôi ngày ngày bệnh viện phụ sản Trung Ương từ 01/10/2014 đến 31/03/2015 Nhận xét số yếu tố liên quan đến tỷ lệ thai lâm sàng sau chuyển phôi đông lạnh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VÔ SINH Vô sinh định nghĩa tình trạng thai sau năm chung sống vợ chồng mà không sử dụng biện pháp tránh thai nào, có quan hệ tình dục trung bình 2-3 lần/tuần Trên giới, tỷ lệ nguyên nhân vô sinh có thay đổi theo thời gian điều tra Theo thống kê nguyên nhân vô sinh nữ chiếm 40%, vô sinh nam chiếm 40%, vô sinh không rõ nguyên nhân chiếm 20% Ở Việt Nam, điều tra Viện bảo vệ Bà mẹ Trẻ sơ sinh từ 19931997 1000 trường hợp vô sinh, tỷ lệ vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh nam chiếm 36% vô sinh không rõ nguyên nhân chiếm 10% Các nguyên nhân vô sinh nữ bao gồm nguyên nhân vòi tử cung chiếm 35%, rối loạn phóng noãn chiếm 35%, lạc nội mạc tử cung chiếm 20%, không rõ nguyên nhân chiếm 10% Các nguyên nhân vô sinh nam bao gồm nguyên nhân bất thường tinh dịch đồ (26,4%), giãn tĩnh mạch thừng tinh (12,3%), suy tinh hoàn (9,4%), tắc ống dẫn tinh (6,1%) nguyên nhân khác yếu tố bẩm sinh, mắc phải, miễn dịch, rối loạn cương, không xuất tinh Có nhiều phương pháp điều trị tùy thuộc vào nguyên nhân gây vô sinh Năm 1976, John Hunter thực thành công trường hợp thụ tinh nhân tạo Tuy nhiên đến cuối kỷ 20, phương pháp đánh giá chức cấu trúc vòi trứng trở nên hoàn thiện mở đường cho kỹ thuật nội soi phát triển Cũng vào cuối kỷ 20, tiến lĩnh vực nội tiết sinh sản nam khoa hỗ trợ tích cực việc chẩn đoán điều trị vô sinh Sự đời em bé từ TTTON Louise Brown năm 1978 mở trang sử cho phát triển kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 1.2 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 1.2.1 Khái niệm Kỹ thuật TTTON lấy noãn người phụ nữ qua chọc hút kết hợp với tinh trùng chuẩn bị ống nghiệm, sau phôi hình thành chuyển trở lại buồng tử cung người mẹ Quá trình phát triển phôi thai diễn bình thường tử cung người mẹ TTTON chiếm 50% chu kỳ điều trị với kỹ thuật hỗ trợ sinh sản giới 1.2.2 Các định làm TTTON 1.2.2.1 Vô sinh vòi tử cung Đây định phổ biến TTTON Việt Nam Theo Nguyễn Xuân Huy, Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2003, định TTTON tắc vòi tử cung 81,9% 1.2.2.2 Vô sinh chồng Tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương (2003), định làm TTTON tinh trùng yếu chiếm tỷ lệ 8,5% Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) đời cho phép trường hợp nam giới thiểu tinh trùng nặng có hội làm cha 1.2.2.3 Lạc nội mạc tử cung Lạc nội mạc tử cung (LNMTC) phát triển niêm mạc tử cung lạc chỗ, bên lòng tử cung Trong số phụ nữ muộn có tới 30 - 40% có LNMTC 50% người bệnh có LNMTC bị muộn Tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương (2003), LNMTC chiếm khoảng 2,6% định TTTON 1.2.2.4 Do rối loạn phóng noãn Không phóng noãn nguyên nhân thường gặp điều trị vô sinh, chiếm khoảng 6% định hỗ trợ sinh sản Mỹ Lý phổ biến nhóm nguyên nhân người bệnh có hội chứng buồng trứng đa nang Trong số trường hợp định TTTON Bệnh viện Phụ sản Trung ương (2003) có 4,6% hội chứng buồng trứng đa nang [6] 1.2.2.5 Vô sinh không rõ nguyên nhân Tỷ lệ vô sinh không rõ nguyên nhân thay đổi từ 10 - 30% Đây khái niệm mang tính tuyệt đối nguyên nhân vô sinh phát muộn lần thăm khám sau trình điều trị Tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương định TTTON vô sinh không rõ nguyên nhân 5,8% [6] 1.2.2.6 Vô sinh miễn dịch Các yếu tố miễn dịch gần ảnh hưởng đến bước trình sinh sản trình phá hủy giao tử kháng thể kháng tinh trùng hay ngăn cản phân chia phát triển sớm phôi Bơm tinh trùng lọc rửa vào buồng tử cung TTTON định trường hợp [6] 1.2.2.7 Thụ tinh nhân tạo thất bại TTTON thường định sau - chu kỳ thụ tinh nhân tạo thất bại Tuy nhiên định phụ thuộc vào yếu tố khác, người bệnh tuổi cao định sớm Theo J.Mck Tabot M.Lawrence, tỷ lệ thành công kỹ thuật TTTON cao gấp lần kết thụ tinh nhân tạo Do TTTON định ngày rộng rãi 1.2.2.8 Hiến noãn hiến phôi (Donation of eggs and embryos) Trong hiến noãn: đứa kết tinh trùng chồng, noãn người hiến môi trường tử cung người vợ có thai đẻ Hiến phôi đặt phôi hình thành từ noãn tinh trùng cặp vợ chồng khác vào buồng tử cung người xin phôi 1.2.2.8 Mang thai hộ Mang thai hộ định cho trường hợp tử cung hay tử cung khả mang thai mà buồng trứng chức TTTON thực từ trứng người vợ tinh trùng người chồng Người mang thai hộ chuyển phôi, mang thai đẻ Ở Việt Nam, Chính phủ vừa ban hành nghị định số: 10/2015/NĐ-CP mang thai hộ mục đích nhân đạo 1.2.3 Một số phương pháp HTSS thông dụng kèm theo TTTON - Trữ lạnh phôi thông dụng thiếu trung tâm TTTON - Trữ lạnh noãn tinh trùng - Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) - Chọc hút tinh trùng từ mào tinh (PESA) tinh hoàn (TESE) - Xin noãn, xin tinh trùng, xin phôi - Nuôi cấy trưởng thành noãn non (IVM) - Hỗ trợ phôi thoát màng (AH) - Chẩn đoán sàng lọc di truyền tiền làm tổ 1.3 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT TRỮ LẠNH Trữ lạnh HTSS nói chung kỹ thuật bảo quản giao tử phôi nguyên trạng ban đầu thời gian dài nhiệt độ nitơ lỏng (-1960C) Sự trữ lạnh giao tử phôi khởi đầu tiếp xúc với chất bảo quản lạnh, sau làm lạnh tới nhiệt độ oC để lưu trữ, rã đông pha loãng, loại bỏ chất bảo quản lạnh quay trở lại môi trường sinh lý để phát triển tiếp tục Tế bào phải giữ nguyên cấu trúc qua trình trữ lạnh Nguyên lí quan trọng trữ lạnh làm giảm tổn thương gây nên hình thành tinh thể đá nội bào Để đạt điều này, tế bào loại bỏ nước trước trình trữ lạnh Nếu khử nước không hoàn toàn dẫn đến hình thành tinh thể đá nội bào lớn gây tổn thương gây chết tế bào Các yếu tố ảnh hưởng đến sống sót giao tử phôi trữ lạnh bao gồm: loài, giai đoạn phát triển, loại chất bảo vệ đông lạnh phương pháp đông lạnh 1.3.1 Nguyên tắc trữ lạnh 1.3.1.1 Giảm độ hòa tan khí môi trường Yếu tố đóng vai trò quan trọng việc gây tổn thương tế bào qua việc tạo bong bóng khí khổng lồ Những bọt khí thường có kích thước từ 25-100µm Trong suốt trình rã đông, số lượng bọt khí tăng lên nhanh chóng vài phút, phình to lên thành không bào bên tế bào khiến tế bào trương phồng lên gây tổn thương tổ chức nội bào, màng suốt, từ làm vỡ phôi bào noãn Hiện người ta sử dụng môi trường trữ lạnh có hệ đệm PBS (phosphate buffer salt) để khắc phục tượng 1.3.1.2 Sự hình thành tinh thể nước đá Khi nước làm lạnh điểm đông (freezing point), đông đặc lại cấu trúc tinh thể gọi đá (ice), tạo điều kiện cho tồn đồng thời hai pha dung dịch, pha rắn tinh thể đá, hai pha dung dịch gồm muối chất hòa tan Trong môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300 mosmol/kg), việc hình thành tinh thể đá diễn - oC đến -15oC, nhiên hình thành tinh thể đá liên tục nhiệt độ khoảng -10 0C Khi nhiệt độ xuống -130 oC không dung dịch nước mà tồn dạng kết tinh (crystalisation) thủy tinh hóa (vitrification) Khi đá chiếm thể tích lớn nước trạng thái lỏng, gây sức ép lực xuyên thủng quan nội bào dẫn đến tổn thương tế bào Trong trình đông lạnh, có tượng nước di chuyển khỏi tế bào hình thành đá khoang ngoại bào Nhiều đá ngoại bào gây phá hủy học, gây tổn thương màng tế bào qua chế chèn ép Vì nguyên lý quan trọng trữ lạnh tránh hình thành tinh thể đá nội bào ngoại bào 1.3.1.3 Tăng nồng độ chất hòa tan môi trường Khi phần lớn nước môi trường trở thành trạng thái rắn, nồng độ chất hòa tan tăng lên làm tăng áp suất thẩm thấu môi trường, môi trường trở nên ưu trương, tế bào nước co lại Sự giảm thể tích tế bào mức làm tổn thương không hồi phục cấu trúc khung tế bào làm tế bào chết Vì vậy, nguyên lý thứ hai tránh shock thẩm thấu 1.3.1.4 Tăng nhiệt độ tiềm ẩn Khi nước chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, tỏa lượng nhiệt tương đối lớn, có khả thay đổi nhiệt độ môi trường từ vài độ (-) lên lại 0°C Thay đổi làm ảnh hưởng tới khả sống tế bào chức tế bào sau rã đông 1.3.1.5 Độ pH dung dịch Độ pH dung dịch giảm theo nhiệt độ Cân acid - base môi trường biến đổi theo chiều hướng tăng lực ion, làm cho protein hòa tan môi trường dễ bị kết tủa Các chất bảo vệ lạnh có vai trò quan trọng việc kiểm soát biến đổi acid - base dung dịch Ví dụ: glycerol glycol hoạt động base yếu, ester (DMSO) base mạnh Sự biến đổi độ pH dung dịch theo nồng độ khác tùy theo loại chất bảo vệ đông lạnh sử dụng Tuy nhiên, độ pH thích hợp để trì hoạt động sinh lý tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ thấp mà tế bào bảo quản Người ta nhận thấy sống tồn sau bảo quản nhiệt độ xấp xỉ 0oC với độ pH 1.3.1.6 Áp suất thẩm thấu Nhiệt độ xác để hình thành kết tinh thủy tinh hóa phụ thuộc vào chất hòa tan dung dịch Trong dung dịch NaCl, tượng thủy tinh hóa xảy nhiệt độ -20 oC đến -30oC Nhiệt độ gọi điểm Eutecti Vì trước đạt đến điểm này, NaCl trạng thái dung dịch Tuy nhiên, số lượng phân tử nước có mặt dạng dung dịch giảm xuống với nhiệt độ Kết trực tiếp giảm áp suất thẩm thấu môi trường: môi trường trở nên ưu trương Ngay trước đạt đến điểm Eutecti, nồng độ NaCl khoảng 5M, điểm đông 0,16M (đẳng trương) Như vậy, bảo quản đông lạnh môi trường đẳng trương, tế bào nước giảm thể tích hình thành tinh thể đá ngoại bào làm tăng áp suất thẩm thấu môi trường 1.3.2 Các đối tượng trữ lạnh 1.3.2.1 Trữ lạnh tinh trùng Kỹ thuật nhà khoa học biết đến từ năm cuối kỷ 18 Tuy nhiên, đến năm 1953, đứa bé đời từ thụ tinh trứng tinh trùng sau trữ lạnh ghi nhận Trữ lạnh tinh trùng kỹ thuật đơn giản giới Việt nam, hệ thống ngân hàng tinh trùng việc sử dụng tinh trùng trữ lạnh HTSS trở thành kỹ thuật điều trị thường quy 1.3.2.2 Trữ lạnh noãn Xét tính chất, so với trữ phôi trữ noãn giúp hạn chế rắc rối pháp lý quyền sở hữu phôi Hiện việc bảo quản khả sinh sản ngày quan tâm tuổi sinh đẻ ngày muộn giúp 10 bệnh nhân ung thư có hội làm mẹ, tối ưu hóa kỹ thuật trữ lạnh noãn ngày quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, xét kỹ thuật, trữ noãn động vật noãn người thực thành công hiệu kỹ thuật thấp Vào thời điểm có kỹ thuật trữ phôi trữ tinh trùng áp dụng thường quy lâm sàng 1.3.2.3 Trữ lạnh phôi Bên cạnh trữ lạnh tinh trùng, trữ lạnh phôi phát triển vượt bậc thời gian gần 1.4 TRỮ LẠNH PHÔI 1.4.1 Khái niệm trữ lạnh phôi Với việc sử dụng kỹ thuật KTBT để cải thiện đơn giản hóa quy trình TTTON người ta thu nhận số lượng lớn noãn bào kết nhiều phôi tạo thành lúc Tuy nhiên chuyển vào thể người mẹ nhiều phôi, người mẹ chưa sẵn sàng để nhận phôi chuyển, phôi tốt, có khả làm tổ cao dư, trữ lạnh sau rã đông chuyển phôi vào chu kỳ khác Từ quy trình trữ lạnh phôi đời góp phần nâng cao hiệu phương pháp thụ tinh ống nghiệm Mười năm sau Whitingham thành công việc trữ lạnh phôi chuột, năm 1983 Trounson Mohr báo cáo trường hợp có thai từ phôi người trữ lạnh Kể từ đó, việc trữ lạnh phôi biết đến tiếp tục phát triển mạnh Điều thu hút nhà khoa học tập trung nghiên cứu vào lĩnh vực kéo theo thay đổi không trung tâm hỗ trợ sinh sản Hiện kỹ thuật trữ lạnh – rã đông – chuyển phôi đông lạnh thực thường quy với tỷ lệ làm tổ phôi đông lạnh tương tự phôi tươi Kỹ 2.2.5 Các tiêu chuẩn đánh giá kết chuyển phôi đông lạnh 35 2.2.6 Công cụ thu thập thông tin: phiếu thu thập số liệu .37 2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU 37 2.4 VẤN ĐỀ Y ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU .37 CHƯƠNG 39 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 Trong thời gian từ 01/10/2014 đến 31/03/2015 Trung tâm Hỗ trợ sinh sản quốc gia – bệnh viện phụ sản Trung Ương, tiến hành nghiên cứu 502 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh chia làm nhóm: 39 - Chu kỳ có phôi trữ lạnh vào ngày (ký hiệu: Ngày 2), gồm 407 chu kỳ .39 - Chu kỳ có phôi trữ lạnh vào ngày (ký hiệu: Ngày 3), gồm 95 chu kỳ .39 Từ rút số kết sau: 39 3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .39 3.1.1 Tuổi đối tượng nghiên cứu .39 3.1.2 Số lần làm thụ tinh ống nghiệm 40 3.1.3 Phân loại vô sinh 41 41 3.1.4 Nguyên nhân vô sinh .41 3.1.5 Nguyên nhân trữ lạnh phôi .42 3.1.6 Thời gian bảo quản phôi 42 3.1.7 Niêm mạc tử cung chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 43 3.2 ĐẶC ĐIỂM VỀ CHU KỲ CHUYỂN PHÔI ĐÔNG LẠNH 45 3.2.1 Đặc điểm chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 45 45 3.2.2 Số phôi chuyển chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 45 3.2.3 Kết chất lượng phôi đông lạnh 46 3.2.4 Tỷ lệ sống sót trung bình phôi sau rã đông 47 48 3.2.5 Kỹ thuật chuyển phôi đông lạnh .48 3.2.6 Kết chuyển phôi đông lạnh .48 Các số liệu kết chuyển phôi đông lạnh tính đến hết tháng 9/2015 .48 3.2.7 Tỷ lệ làm tổ chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 49 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI TỶ LỆ THAI LÂM SÀNG CỦA CHUYỂN PHÔI ĐÔNG LẠNH .50 Trong nghiên cứu, lựa chọn tỷ lệ thai lâm sàng xét mối liên quan yếu tố ảnh hưởng tới kết chuyển phôi đông lạnh 50 Trong 384 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh, có 148 chu kỳ có thai lâm sàng chiếm tỷ lệ 30,6% .50 3.3.1 Liên quan tuổi mẹ tỷ lệ thai lâm sàng 50 3.3.2 Liên quan nguyên nhân vô sinh tỷ lệ thai lâm sàng 51 3.3.3 Liên quan nguyên nhân trữ phôi tỷ lệ thai lâm sàng 51 3.3.4 Liên quan thời gian trữ phôi tỷ lệ thai lâm sàng 52 Để đánh giá mối liên quan thời gian bảo quản phôi tỷ lệ thai lâm sàng, chia thời gian bảo quản phôi thành nhóm .52 3.3.5 Liên quan chất lượng phôi trước trữ tỷ lệ thai lâm sàng 53 3.3.6 Liên quan chất lượng phôi sau rã đông tỷ lệ thai lâm sàng .53 3.3.7 Liên quan chất lượng phôi chuyển tỷ lệ thai lâm sàng 54 3.3.8 Liên quan số lượng phôi chuyển tỷ lệ thai lâm sàng 54 3.3.9 Liên quan NMTC tỷ lệ thai lâm sàng 55 3.3.10 Liên quan cách thức chuyển phôi tỷ lệ thai lâm sàng 57 3.3.11 Liên quan số ngày dùng estradiol tỷ lệ thai lâm sàng 57 CHƯƠNG 58 BÀN LUẬN 58 4.1 BÀN LUẬN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .58 4.1.1 Tuổi 58 Trong thời gian từ 01/10/2014 đến 31/03/2015 Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia, nhận vào nghiên cứu 502 chu kỳ đông phôi vào giai đoạn phân chia sớm đủ tiêu chuẩn lựa chọn, có 407 chu kỳ trữ lạnh phôi ngày 95 chu kỳ phôi trữ lạnh ngày 58 Bảng 3.1 cho thấy đối tượng nghiên cứu có độ tuổi trung bình 32,77 ± 4,91 Tuổi trung bình thấp so với nghiên cứu Nguyễn Viết Tiến cs (2008) nghiên cứu áp dụng kỹ thuật trữ lạnh phôi 176 chu kỳ rã đông 880 phôi trữ lạnh vào ngày 1, ngày ngày trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia, tác giả ghi nhận tuổi trung bình đối tượng 35,03 ± 6,10 tuổi Phan Thanh Lan (2007) so sánh nhóm bệnh nhân có sử dụng không sử dụng GnRH trước chuyển phôi đông lạnh trung tâm có tuổi trung bình đối tượng 33,4 ± 3,63 tuổi cao Sự khác biệt có lẽ nhận thức truyền thông phương pháp hỗ trợ sinh sản cải thiện đáng kể sau năm, bệnh nhân khám điều trị muộn sớm .58 4.1.2 Loại vô sinh 59 4.1.3 Nguyên nhân vô sinh .59 4.1.4 Nguyên nhân trữ phôi .60 4.1.5 Thời gian bảo quản phôi 61 4.1.6 Niêm mạc tử cung chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 62 4.2 KẾT QUẢ CHUYỂN PHÔI ĐÔNG LẠNH CỦA PHÔI TRỮ NGÀY VÀ NGÀY 62 4.2.1 Đặc điểm chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 62 4.2.2 Số phôi chuyển chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 63 4.2.3 Kết chất lượng phôi đông lạnh 64 4.2.4 Tỷ lệ hủy chu kỳ 67 4.2.5 Đánh giá kết có thai 68 4.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI TỶ LỆ THAI LÂM SÀNG CỦA CHUYỂN PHÔI ĐÔNG LẠNH .69 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ thai lâm sàng xét mối liên quan yếu tố ảnh hưởng tới kết chuyển phôi đông lạnh 69 4.3.1 Liên quan tuổi mẹ tỷ lệ thai lâm sàng 69 4.3.2 Liên quan nguyên nhân vô sinh tỷ lệ thai lâm sàng 70 4.3.3 Liên quan nguyên nhân trữ phôi tỷ lệ thai lâm sàng 71 4.3.4 Liên quan thời gian trữ phôi tỷ lệ thai lâm sàng 71 Để đánh giá mối liên quan thời gian bảo quản phôi tỷ lệ thai lâm sàng, chia thời gian bảo quản phôi thành nhóm: 12 tháng Khi phân tích nhóm nhận thấy khả có thai lâm sàng giảm thời gian lưu trữ phôi tăng lên, tỷ lệ thai lâm sàng nhóm trữ lạnh phôi 12 tháng gấp 1,12 lần nhóm trữ lạnh 12 tháng Tuy nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê với CI 95%: 0,65 – 1,92 (p > 0,05) .71 Nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Thị Minh (2006): tác giả nhận thấy thoái hóa phôi xảy nhiều phôi chất lượng xấu trung bình thời gian trữ phôi 12 tháng, phôi chất lượng tốt không ảnh hưởng Tuy nhiên tỷ lệ thai lâm sàng nhóm phôi không khác biệt theo thời gian trữ phôi hay 12 tháng Hán Mạnh Cường (2010) ghi nhận tỷ lệ có thai giảm dần thời gian lưu trữ phôi tăng lên, nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê 72 Nghiên cứu Nastaran (2013) ảnh hưởng thời gian trữ phôi đến thành công chuyển phôi đông lạnh cho thấy tỷ lệ thai lâm sàng nhóm trữ phôi khác nhau: Nhóm I: 90 ngày (thai lâm sàng 24,9%), nhóm II: từ 90 - 365 ngày (22,6%), nhóm III: từ 365 - 730 ngày (27,2%), nhóm IV: từ 730 - 1095 ngày (21,2%) nhóm V: 1095 ngày (36%), nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 72 Chúng nhận thấy nghiên cứu trường hợp trữ phôi lâu năm, khoảng thời gian trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia áp dụng phương pháp đông lạnh thủy tinh hóa cách thường quy cho tất đối tượng trữ lạnh Có thể thống hiệu vượt trội kỹ thuật đông phôi giúp cho chất lượng phôi sau rã bị ảnh hưởng, từ ảnh hưởng tới kết cục chu kỳ chuyển phôi đông lạnh .72 4.3.5 Liên quan chất lượng phôi tỷ lệ thai lâm sàng 72 4.3.6 Liên quan giai đoạn phát triển phôi tỷ lệ thai lâm sàng 76 4.3.7 Liên quan số lượng phôi chuyển tỷ lệ thai lâm sàng 78 4.3.8 Liên quan NMTC tỷ lệ thai lâm sàng 79 4.3.9 Liên quan cách thức chuyển phôi tỷ lệ thai lâm sàng 82 4.3.10 Liên quan số ngày dùng estradiol tỷ lệ thai lâm sàng 84 KẾT LUẬN 85 Nghiên cứu 502 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia từ 01/10/2014 đến 31/03/2015, gồm có 407 chu kỳ trữ phôi ngày 95 chu kỳ trữ phôi ngày 3, có số kết luận sau: .85 1.Kết chuyển phôi phôi trữ lạnh vào ngày ngày .85 Tỷ lệ sống sót phôi sau rã đông ngày có xu hướng cao ngày 3: 80,69 ± 25,30 % so với 79,83 ± 29,20% 86 Tỷ lệ có thai ngày thấp ngày 3: 40,6% so với 44,4% .86 Tỷ lệ thai lâm sàng ngày 2: 29,4% thấp ngày 3: 35,6% 86 Tỷ lệ thai tiến triển ngày 27,9% thấp ngày 3: 34,4% 86 3.Yếu tố liên quan đến tỷ lệ thai lâm sàng sau chuyển phôi đông lạnh 86 Tỷ lệ thai lâm sàng chung đạt 30,6% 86 Chất lượng phôi chuyển liên quan đến tỷ lệ thai lâm sàng: Nhóm có phôi độ có tỷ lệ thai lâm sàng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm phôi độ .86 Số lượng phôi chuyển: Tỷ lệ thai lâm sàng tăng rõ rệt chuyển từ phôi trở lên so với chuyển ≤ phôi (p < 0,05); chuyển nhiều phôi khác biệt 86 Tỷ lệ thai lâm sàng cao có ý nghĩa thống kê nhóm có NMTC dày 10 mm so với nhóm lại 86 Chưa tìm thấy mối liên quan yếu tố: giai đoạn trữ lạnh phôi, chất lượng phôi trước trữ lạnh, phôi sau rã đông, tuổi mẹ, nguyên nhân vô sinh, nguyên nhân trữ phôi, thời gian trữ phôi, hình ảnh NMTC, cách thức chuyển phôi hay số ngày chuẩn bị NMTC estradiol đến tỷ lệ thai lâm sàng 86 KIẾN NGHỊ 86 1.Cần có thêm nghiên cứu tiến cứu, ngẫu nhiên có so sánh với cỡ mẫu đủ lớn để kiểm định khác biệt kết trữ phôi vào ngày ngày 86 2.Không nên chuyển nhiều phôi đông lạnh để giảm tỷ lệ đa thai mà đảm bảo tỷ lệ thai lâm sàng cao 87 3.Nên chuẩn bị niêm mạc tử cung thật tốt để nâng cao tỷ lệ thành công cho chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt kết nghiên cứu số tác giả vào giai đoạn đông phôi khác 26 Bảng 3.1 Tuổi đối tượng nghiên cứu .39 Bảng 3.2 Nguyên nhân trữ lạnh phôi 42 Thời gian bảo quản phôi tính từ ngày phôi trữ lạnh đến ngày rã đông phôi, chia thành nhóm 42 Bảng 3.3 Thời gian trữ lạnh phôi 43 Bảng 3.4 Độ dày NMTC chu kỳ chuyển phôi đông lạnh .43 Bảng 3.5 Số phôi chuyển chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 45 Chất lượng phôi thay đổi sau trình trữ lạnh 47 Nhóm trữ phôi ngày 2: tỷ lệ phôi có chất lượng tốt nhóm III giảm sau trữ lạnh sau nuôi cấy 24 (trước trữ lạnh 36,1%; sau rã đông 31,9% phôi chuyển 28%) .47 Nhóm trữ phôi ngày 3: tỷ lệ phôi có chất lượng tốt nhóm III tăng dần sau trữ lạnh sau nuôi cấy 24 (trước trữ lạnh 23,2%; sau rã đông 25,3% phôi chuyển 29,5%) 47 Bảng 3.6 Kỹ thuật chuyển phôi đông lạnh 48 Bảng 3.7 Kết có thai .49 Trong tổng số 200 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh có thai, có 160 chu kỳ chuyển phôi từ nhóm ngày 40 chu kỳ từ nhóm ngày Có 151/160 chu kỳ chuyển phôi từ nhóm ngày có phôi làm tổ, 40/40 chu kỳ có thai nhóm ngày phôi làm tổ .49 Bảng 3.8 Tỷ lệ làm tổ chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 49 13,33 .50 16,29 .50 13,83 .50 171/1283 50 43/264 50 214/1547 50 Bảng 3.9 Liên quan tuổi mẹ tỷ lệ thai lâm sàng 50 Khả có thai lâm sàng phụ nữ ≤ 35 tuổi cao 1,38 lần so với phụ nữ > 35 tuổi với CI 95%: 0,89 – 2,16; p > 0,05 Sự khác biệt tỷ lệ thai lâm sàng nhóm tuổi ý nghĩa thống kê 51 Bảng 3.10 Liên quan nguyên nhân vô sinh tỷ lệ thai lâm sàng .51 Bảng 3.11 Liên quan nguyên nhân trữ phôi tỷ lệ thai lâm sàng .52 Bảng 3.12 Liên quan thời gian trữ phôi tỷ lệ thai lâm sàng 52 Bảng 3.13 Liên quan chất lượng phôi trước trữ lạnh tỷ lệ thai lâm sàng 53 Bảng 3.14 Liên quan chất lượng phôi sau rã tỷ lệ thai lâm sàng 53 Bảng 3.15 Liên quan chất lượng phôi chuyển tỷ lệ thai lâm sàng 54 Bảng 3.16 Liên quan số lượng phôi chuyển tỷ lệ thai lâm sàng .54 Để phân tích mối liên quan NMTC tỷ lệ thai lâm sàng, chia đối tượng nghiên cứu thành nhóm có NMTC 10mm 55 Bảng 3.17 Liên quan độ dày NMTC tỷ lệ thai lâm sàng 56 Bảng 3.18 Liên quan hình ảnh NMTC tỷ lệ thai lâm sàng .56 Bảng 3.19 Liên quan cách thức chuyển phôi tỷ lệ thai lâm sàng 57 Bảng 3.20 Liên quan số ngày dùng estradiol tỷ lệ thai lâm sàng 57 Thời điểm chuyển phôi khác cho tỷ lệ thai lâm sàng khác nhau, nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 57 Biểu đồ 3.5 cho thấy số noãn, số phôi, số phôi trữ lạnh số phôi rã đông đối tượng nghiên cứu có xu hướng thấp nhóm ngày so với nhóm ngày Điều trung tâm, đa số trường hợp nhiều phôi nguy kích buồng trứng nặng trường hợp nhiều phôi tốt thường định đông phôi từ ngày 2, trường hợp phôi chậm phát triển thường kèm theo phôi tốt thường định đông phôi sau ngày, nhóm trữ lạnh phôi ngày thường có số phôi trữ so với ngày 62 Số phôi trữ lạnh trung bình 8,73 phôi nhóm ngày 6,57 nhóm ngày cao so với số phôi trữ lạnh trung bình nghiên cứu tác giả Nguyễn Viết Tiến cs (2008): 5,32 phôi; nhiên số phôi rã đông trung bình nhóm lại thấp hơn: 4,10 phôi nhóm ngày 3,63 phôi nhóm ngày so với 5,00 phôi Kết phù hợp với xu nhằm cải thiện chất lượng TTTON, giảm tỷ lệ đa thai qua việc giảm số lượng phôi chuyển chu kỳ, từ số lượng phôi trữ lạnh dư lại sau chu kỳ chuyển phôi tươi tăng lên .63 Biểu đồ 3.6 cho thấy chất lượng phôi thay đổi sau rã đông nuôi cấy 24 Nhóm trữ phôi ngày 2: tỷ lệ phôi có chất lượng tốt nhóm III giảm sau trữ lạnh sau nuôi cấy 24 (trước trữ lạnh 36,1%; sau rã đông 31,9% phôi chuyển 28%) Sự thay đổi lại ngược lại nhóm trữ phôi ngày với xu hướng tốt hơn: tỷ lệ phôi có chất lượng tốt nhóm III tăng dần sau trữ lạnh sau nuôi cấy 24 (trước trữ lạnh 23,2%; sau rã đông 25,3% phôi chuyển 29,5%) .66 Nghiên cứu tác giả Nguyễn Viết Tiến (2008) ghi nhận chất lượng phôi sau rã đông liên quan chặt chẽ đến chất lượng phôi trước đông tuổi phôi Để đánh giá ảnh hưởng trình đông lạnh đến phôi, tác giả chia phôi theo tỷ lệ % phôi bào bị thoái hóa Tác giả nhận thấy tỷ lệ thoái hóa phôi ngày thấp nhất, sau đến ngày 2, ngày cao Liên quan đến chất lượng phôi: nhóm phôi có chất lượng tốt bị tổn thương qua trình đông lạnh với tỷ lệ phôi nguyên vẹn nhóm phôi độ 3, độ độ 57,5%; 51,2% 13,4% .66 Sự khác biệt nghiên cứu chúng tôi, nhóm trữ phôi ngày đa phần phôi phát triển chậm so với phôi ngày 2, sau rã đông nuôi cấy thêm 24h, có phôi phát triển vượt trội, tiếp tục phân chia trở thành phôi tốt Số lượng phôi sau rã sau nuôi cấy 24h giảm số phôi bị thoái hóa hoàn toàn, nhiên cấu trúc chất lượng phôi lại thay đổi Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ phân chia tiếp nhóm trữ phôi ngày cao ngày Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Thị Minh (2006) Như cho thấy việc đánh giá phôi sau nuôi cấy 24h quan trọng hiệu quả, giúp lựa chọn phôi tốt xác hạn chế số lượng phôi chuyển, từ giảm tỷ lệ đa thai mà đảm bảo tỷ lệ thai lâm sàng 67 Tỷ lệ hủy chu kỳ nghiên cứu thấp nhiều so với nghiên cứu Hán Mạnh Cường (2010) trung tâm: 9,5%, tác giả ghi nhận 14 trường hợp hủy chu kỳ phôi sau rã đông bị thoái hóa hoàn toàn Sự khác biệt cho thấy kỹ thuật kết trữ rã đông phôi trung tâm ngày hoàn thiện Tỷ lệ nghiên cứu FengLin Chi (2013) nhóm có đáp ứng với KTBT 13,04% nhóm phôi trữ ngày 10,2% nhóm phôi ngày 3, không ghi nhận tường hợp hủy chu kỳ nhóm có nguy kích buồng trứng Kết tác giả cao so với kết nhóm trữ phôi ngày tác giả thống kê nhóm đối tượng đáp ứng với KTBT, số noãn chất lượng noãn kém, chất lượng số lượng phôi trữ kém, dẫn đến tỷ lệ phôi thoái hóa hoàn toàn cao 67 Khi nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mẹ đến tỷ lệ thai lâm sàng, có nhiều nghiên cứu đề cập tới yếu tố Tác giả Templeton cs (1999) nghiên cứu ảnh hưởng tuổi lên kết TTTON thấy tỷ lệ thành công giảm dần tới tuổi 35, giảm nhanh sau tuổi 35, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Nghiên cứu WilliamSBYeung (2007) ghi nhận tỷ lệ thai lâm sàng tỷ lệ thai tiến triển cao bệnh nhân trẻ tuổi ≤ 35 tuổi, ngược lại tỷ lệ sảy thai cao bệnh nhân > 35 tuổi (p < 0,05) Tác giả Maryam Eftekhar cs (2014) nhận thấy tuổi mẹ yếu tố ảnh hưởng tới tỷ lệ thai lâm sàng, tỷ lệ thai lâm sàng cao có ý nghĩa thống kê phụ nữ < 35 tuổi so với > 35 tuổi: 57,7% so với 29,2% (p < 0,0001) Tuy nhiên nghiên cứu phân tích hồi quy đa biến Wenhao Shi (2013) đánh giá tuổi mẹ lúc chọc hút noãn lúc chuyển phôi đông lạnh lại cho thấy mối liên quan tuổi mẹ tỷ lệ thai lâm sàng .69 Chất lượng phôi trước trữ lạnh .73 Kết khác với nghiên cứu A Gabrielsen (2007), tác giả nhận định yếu tố làm tăng tỷ lệ thai lâm sàng làm tổ chu kỳ chuyển phôi đông lạnh gồm: phôi có phôi bào vào ngày trữ phôi; có tiếp tục phân chia phôi bào sau rã đông phôi chuyển có phôi bào .73 Chất lượng phôi sau rã đông 73 Chất lượng phôi sau rã đông đánh giá sau rã đông giờ, phản ánh ảnh hưởng trình trữ lạnh – rã đông lên phôi Trong nghiên cứu ghi nhận trình trữ lạnh – rã đông làm thay đổi cấu trúc, hình thái số lượng phôi so với trước trữ lạnh Câu hỏi đặt thay đổi có ảnh hưởng tới kết cục cuối chu kỳ chuyển phôi đông lạnh không? Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ thai lâm sàng cao phôi sau rã đông thuộc nhóm II: 32,8%; thấp nhóm I: 28,4% Tuy nhiên khác biệt tỷ lệ thai lâm sàng nhóm ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Như vậy, hình thái phôi trước trữ lạnh sau rã đông bị thay đổi qua trình đông lạnh; tỷ lệ thai lâm sàng nhóm phôi có chất lượng khác khác nhau, song chất lượng phôi trước trữ lạnh sau rã đông không trực tiếp phản ánh tỷ lệ thai lâm sàng 73 Chất lượng phôi chuyển 74 Nghiên cứu phù hợp với nhiều y văn, nghiên cứu nước giới, khẳng định vai trò quan trọng chất lượng phôi chuyển lên thành bại chu kỳ TTTON tươi chuyển phôi đông lạnh .74 Nghiên cứu Lê Thị Phương Lan cs (2004) 50 trường hợp chuyển phôi đông lạnh trung tâm không ghi nhận trường hợp có thai nhóm bệnh nhân chuyển phôi có độ phôi kém, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương 50% Tương tự trên, Đặng Quang Vinh cs (2005) khảo sát 164 bệnh nhân đông lạnh chia thành nhóm: nhóm gồm bệnh nhân có phôi tốt sau rã đông, nhóm gồm bệnh nhân phôi tốt sau rã đông Tỷ lệ thai lâm sàng nhóm cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm (35,5% so với 11,1%) 75 Nghiên cứu Nguyễn Thị Minh (2006) với 192 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh ghi nhận tỷ lệ có thai giảm chất lượng phôi giảm Với trường hợp có phôi tốt (phôi độ 3), có phân chia tiếp để chuyển kết có thai đạt 46,9%, cao trường hợp chuyển phôi tốt 34,4% tỷ lệ có thai giảm mạnh bệnh nhân chuyển phôi chất lượng trung bình (phôi độ 2): 25% Đặc biệt, tỷ lệ có thai giảm rõ rệt 8,3% bệnh nhân có phôi độ để chuyển; chí không ghi nhận trường hợp có thai nhóm bệnh nhân có phôi độ mà tỷ lệ mảnh vỡ > 50% Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 75 Trong nghiên cứu WilliamSBYeung (2007) nhận thấy chu kỳ chuyển đơn phôi, phôi có phôi bào giai đoạn phát triển cao phôi vào ngày chuyển phôi có tỷ lệ thai tiến triển tốt đạt 25%, nhóm lại có tỷ lệ thai tiến triển 5% Trong chu kỳ chuyển đơn phôi có phôi bào bị hủy hoại làm giảm có ý nghĩa thống kê tỷ lệ thai lâm sàng 75 Tương tự Sifer (2006) nhận thấy tỷ lệ thai lâm sàng chu kỳ chuyển phôi có phôi phân chia tiếp cao có ý nghĩa thống kê so với chu kỳ phôi phân chia tiếp: 17,4 % so với 7,7% 75 Tác giả Wenhao Shi (2013) kết luận số phôi có chất lượng tốt yếu tố quan trọng làm tăng tỷ lệ thai lâm sàng Tỷ lệ thai lâm sàng nhóm có 0,1,2,3 phôi tốt 38,9%; 55,4%; 62,1% 61,7% Tỷ lệ thai lâm sàng chu kỳ quan sát thấy phôi tiếp tục phân chia cao có ý nghĩa thống kê với chu kỳ khác: 54,1% so với 34,1%; tương tự quan sát thấy có liên kết phôi bào tỷ lệ có thai 62,4% so với không liên kết 45,3% Sự hủy hoại phôi bào làm giảm tỷ lệ thai lâm sàng từ 53% xuống 36,2% 76 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Số lần làm thụ tinh ống nghiệm 40 Biểu đồ 3.2 Phân loại vô sinh 41 Biểu đồ 3.3 Nguyên nhân vô sinh .41 Biểu đồ 3.4 Hình ảnh NMTC chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 44 Biểu đồ 3.5 Đặc điểm chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 45 Biểu đồ 3.6 Chất lượng phôi đông lạnh 47 Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ sống sót trung bình phôi sau rã đông 48 DANH MỤC HÌNH a: Phôi 2PN b: Phôi tế bào c: Phôi ngày d: Phôi ngày 13 Hình 1.1 Các giai đoạn phân chia phôi 13 Bắt đầu từ ngày thứ sau thụ tinh, nguyên sinh chất phôi trở nên có hạt lõm nhỏ xuất Có tăng cường kết dính phôi bào để sau vào giai đoạn nén Sự nén phôi người nhìn thấy trạng thái tế bào, phôi người phân chia đến 16 - 32 tế bào trước nén .13 a: phôi dâu (ngày 4) b: phôi nang (ngày 5) 15 Hình 1.2 Phôi dâu (Morula) phôi nang (Blastocyte) 15 Hình 1.3 Phôi thoát khỏi màng bao xung quanh 21 2.2.3.2 Đặc điểm phôi 31 111 Hình Quy trình trữ lạnh – rã đông với môi trường Kitazato 111 PHỤ LỤC Quy trình trữ lạnh rã đông phôi Quy trình đông phôi Các phôi trữ lạnh phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) với môi trường Kitazato (Nhật Bản) - Bước 1: Nhúng phôi vào đĩa chứa 300 µl môi trường cân (ES) nhiệt độ phòng vòng 12 – 15 phút - Bước 2: Hút phôi chuyển qua đĩa chứa 300 µl môi trường đông lạnh thủy tinh hóa (VS1), dùng pipette Pasteur hút phôi lên xuống lần, giai đoạn tối đa phút - Bước 3: Hút phôi chuyển qua đĩa chứa 300 µl môi trường đông lạnh thủy tinh hóa (VS2), dùng pipette Pasteur hút phôi lên xuống lần, giai đoạn tối đa 30 giây - Bước 4: Hút phôi lên đặt vào dải mỏng Cryotop với lượng nhỏ môi trường VS2, tiếp nhúng vào Nitơ lỏng để lưu trữ Quy trình rã đông phôi - Bước 1: Phôi từ Nitơ lỏng nhúng vào môi trường TS 37°C – để phút - Bước 2: Sau phôi chuyển vào 300 µl môi trường pha loãng (DS) ủ vòng phút - Bước 3: Hút phôi chuyển vào 300 µl môi trường WS1 ủ vòng phút - Bước 4: Chuyển phôi vào 300 µl môi trường WS2, rửa phôi lần pipette Pasteur, vòng phút Sau đặt phôi vào môi trường nuôi cấy sau rã đông Hình Quy trình trữ lạnh – rã đông với môi trường Kitazato 13,15,21,39,40,43,44,46,47,106 1-12,14,16-20,22-38,41,42,45,48-86,93-105 ... ngày bệnh viện phụ sản Trung Ương nhằm hai mục tiêu: Đánh giá kết chuyển phôi phôi trữ lạnh phương pháp thủy tinh hóa vào tuổi phôi ngày ngày bệnh viện phụ sản Trung Ương từ 01/10 /20 14 đến 31 / 03 /20 15... cứu hồi cứu 33 9 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh rã đông từ năm 20 00 - 20 02 Tác giả nhận thấy trữ lạnh phôi vào ngày so với trữ lạnh phôi vào ngày cho tỷ lệ sống sót phôi sau rã đông tương tự, nhiên... điểm trữ lạnh - rã đông phôi tối ưu nhằm tăng tỷ lệ thành công chu kỳ chuyển phôi đông lạnh, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nhận xét kết chuyển phôi đông lạnh kỹ thuật trữ lạnh phôi ngày phôi ngày