Đang tải... (xem toàn văn)
Căn cứ Điều 13, khoản 2, điểm a Nghị định số 1552016NĐCP của Chính phủ ngày 18 tháng 11 năm 2016 quy định về xử phạt vi phạm hành chính trong lĩnh vực bảo vệ môi trường; Căn cứ Biên bản vi phạm hành chính số 02BBVPHC do Cán bộ Môi trường UBND xã Gia Hòa 1 lập hồi 10 giờ 30 phút, ngày 16 tháng 6 năm 2017 tại ấp Định Hòa, xã Gia Hòa 1, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng;
POLYMERASE CHAIN REACTION Những khái niệm chính: ♦ PCR khuếch đại trình tự DNA cụ thể in vitro ♦ PCR cần có mồi (primer), hai mồi bổ sung cho mạch DNA DNA polymerase ♦ Những chu kì nóng lạnh lặp lặp lại nhiều lần làm khuếch đại đoạn DNA hai vị trí liên kết mồi thành số lượng lớn DNA tái Kĩ thuật PCR khởi đầu vào thập niên 1980 (Saiki et al., 1985; Mullis and Faloona, 1987), không hợp lí nói tác động PCR lên sinh học phân tử, khoa học pháp lí, chuẩn đoán bệnh lí gen người trở nên rộng mở Tự thân trình kéo dài đơn giản chu trình chép DNA, sử dụng nhiều cách khác để tạo nên nhiều nhân thao tác DNA nhiều trường hợp dễ dàng thích hợp lần Khái niệm đơn giản PCR chép lặp lại nhiều lần đoạn chuỗi DNA kép Tiến trình trình bày sơ lược hình 4.1 Sự ưu việt PCR có khả nhân số lượng lớn từ phân đoạn DNA cụ thể thời gian ngắn PCR khuếch đại nhanh chóng vùng phân tử DNA mạch đơn ống nghiệm để sinh lượng đủ nhân bản, nối dài, phân tích cách xác định giới hạn Tác dụng PCR tôn vinh vào năm 1993 với giải thưởng Nobel hóa học cho Kary Mullis cho đóng góp ông với khoa học Mullis viết phát minh thú vị (Mullis, 1990) tìm thấy tự truyện thú vị Mullis web site giải Nobel (http://www.nobel.se/chemistry/ laureates/1993/mullis-autobio.html) PCR liên quan đến hai mồi hai chuỗi oligonucleotide, thường có chiều dài khoảng 17 đến 30 nucletide, mà nhận diện trình tự DNA mục tiêu để chép Một hai mồi có trình tự giống với mạch DNA (sense - mồi xuôi) mồi lại có trình tự giống chuỗi DNA lại (antisense - mồi ngược) Mồi xuôi liên kết, bổ sung bắt cặp với base, với mồi ngược bắt đầu tổng hợp mạch DNA Tương tự, mồi ngược liên kết với mồi xuôi tổng hợp mạch DNA mồi xuôi Chương trình PCR chia làm ba giai đoạn riêng biệt, giai đoạn thực nhiệt độ khác (hình 4.1) Chu kì trình biến tính – bắt cặp với mồi (hay gọi lai) – kéo dài lặp lại 20-30 lần để đạt mức độ khuếch đại mong muốn trình tự DNA cụ thể Ba bước chu kì sau: ♦ Biến tính: hai mạch phân tử DNA tách nhiệt độ Như biết chương 1, DNA bị biến tính thuận nghịch chu kì nóng lạnh Bước thường thực nhiệt độ 94oC ♦ Bắt cặp với mồi (lai): hai mạch mục tiêu sau làm lạnh với có mặt đoạn mồi oligonucleotide Một mồi nhận diện gắn vào mạch DNA mục tiêu mồi khác nhận diện gắn vào mạch lại Các mồi thiết kế cho đầu 3’ đoạn mồi phải đối mã với lại, tổng hợp DNA diễn hai mạch vùng hai mồi Nhiệt độ để bắt cặp mồi với DNA mẫu phụ thuộc vào chiều dài trình tự mồi, mức độ đặc trưng phản ứng PCR cụ thể có chương Nhiệt độ thông thường chọn phạm vi 45-60oC ♦ Kéo dài: DNA polymerase gắn vào đầu 3’ liên kết oligonucleotide sử dụng dNTP để tổng hợp mạch DNA theo chiều 5’-3’ Các thí nghiệm PCR sử dụng phân đoạn Klenow DNA polymerase I enzym chép, bước biến tính nhiệt, enzym thêm vào suốt chu kì Một đột phá đưa Tag DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus (Lawyeret al., 1989) Tag DNA polymerase kháng với nhiệt độ cao, có chịu nhiệt độ 94 oC giai đoạn biến tính khả hoạt động tốt Điều có nghĩa enzym không cần phải bổ sung suốt phản ứng chu kì nóng - lạnh cần thiết PCR thiết kế tự động Hơn Tag DNA polymerase có nhiệt độ tối ưu cho chép DNA 72 oC Ở nhiệt độ cao mà lúc phản ứng kéo dài diễn có nghĩa giai đoạn bắt cặp mồi không bị sai sót Biến tính Bắt cặp mồi (lai) Kéo dài DNA polymerase Lặp lại Sau vòng trình nhân PCR, phiên mạch DNA tổng hợp, minh họa hình 4.1 Vị trí bắt đầu tổng hợp DNA định liên kết đoạn mồi oligonucleotide với DNA mẫu Cụ thể trình lai thông qua liên kết hydro cặp base, xác vị trí nucleotide trình tự, mà bổ sung vào mạch mẫu Không có phức tạp, nhiên tồng hợp DNA kết thúc Nếu kiểm tra kết phản ứng PCR điển hình gel agarose hình 4.2, ta thấy dải đơn rời rạc tạo thành Điều cho thấy phân đoạn DNA tạo thành đồng nhất, chúng bắt đầu kết thúc vị trí Để hiểu điều xảy nào, ta xem đoạn DNA tạo thành suốt nhiều chu kì PCR Hình 2: Khuếch đại PCR gen từ DNA Hai đoạn mồi oligonucleotide thiết kế để flank gen gen người Một phản ứng PCR diễn 25 chu kì, phần mười phản ứng chạy gel agarose xếp theo kích thước DNA Gel nhuộm với ethium bromide chụp kính hiển vi Hình 4.3: Các sản phẩm tạo thành suốt chu kì đầu thí nghiệm PCR Một phân tử DNA mục tiêu (được mô tả màu đỏ xanh) chứa trình tự bổ sung với hai oligonucleotide Các oligonucleotide có tác dụng điểm bắt đầu cho nhân DNA Các sản phẩm chu kì PCR mẫu cho nhân DNA chu kì Trong hình sản phẩm chu kì đầu PCR (xanh lá), chu kì hai (tím), chu kì ba (nâu) Sự hoàn thành chu kì dẫn đến hình thành hai phân tử DNA mạch đôi (được đóng khung), mà đầu mạch 5’ 3’ thích hợp xác với đầu đoạn mồi oligonucleotide Các chu kì dẫn đến gia tăng theo cấp số nhân phân tử DNA Trong suốt chu kì PCR đầu tiên, hai mạch DNA mục tiêu tách trình nhân DNA bắt đầu điểm liên kết với mồi Hai mạch DNA tổng hợp cuối chu kì (ở hình 4.3), có đầu 5’ xác định, quy định vị trí liên kết với mồi, đầu 3’ không xác định Quá trình tổng hợp DNA không giới hạn điểm cụ thể, dừng lại suốt bước biến tính nhiệt chu kì Mỗi mạch DNA có cuối chu kì tiếp nối vào chu kì PCR, mạch có tác dụng mẫu cho liên kết với mồi Trong chu kì 2, mồi gắn với mạch DNA mẫu ban đầu mạch tổng hợp chu kì Liên kết mồi với mạch mẫu ban đầu đưa đến kết tạo thành sản phẩm tương tự suốt chu kì Tuy nhiên, liên kết mồi với mạch DNA tổng hợp chu 1, nhân bản, dẫn đến việc tạo thành mạch DNA với đầu đầu 3’ 3’ xác định Điều xảy nhân DNA chấm dứt thêm trình tự DNA chép Vì kết thúc chu kì mạch DNA tạo thành (thể hình với màu tím) có đầu 5’ 3’ xác định Tuy nhiên base bắt cặp với đoạn DNA có đầu 3’ không xác định Một lần nữa, sản phẩm chu kì tiến trình PCR vào chu kì 3, lần mạch DNA sử dụng làm mẫu để mồi gắn vào Vào cuối chu kì 3, phân tử DNA mạch đôi tạo thành cuối mạch 5’ 3’ bắt đầu kết thúc vị trí mồi gắn vào trình tự DNA mục tiêu ban đầu Ngoài chu kì PCR, chu kì biến tình nhiệt, bắt cặp mồi, kéo dài lặp lại dẫn đến nhân lên theo cấp số mũ đoạn DNA mục tiêu cụ thể (hình 4.1) Sau 25 chu kì, thông thường thí nghiệm PCR, mong đợi khuếch đại khoảng 30 triệu lần, khuếch đại đạt thực tế Tất phản ứng PCR “bị nhiễm” lượng phân đoạn DNA tạo thành không với chủ định không đáng kể, phần lớn khuếch đại phân đoạn DNA cụ thể Có nhiều yếu tố cần xem xét khuếch đại trình tự DNA cụ thể phương pháp PCR Nó bao gồm việc chọn lựa DNA polymerse sử dụng, mẫu DNA, điều kiện phản ứng trình tự mồi oligonucleotide Chúng thảo luận ngắn gọn vấn đề phía thí nghiệm kĩ thuật gen bị ảnh hưởng nào, độc giả hướng tới văn với khía cạnh thực tế PCR theo chiều sâu 4.1 ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG PCR Thành phần phản ứng PCR bao gồm thành phần: DNA (0.01–0.1 μg) Primer (20 pmol) Primer (20 pmol) Tris-HCl (20 mM, pH 8.0) MgCl2 (2 mM) KCl (25 mM) or KCl (10 mM) and (NH4)2SO4 (10 mM) Deoxynucleotide triphosphates (50 μMeach of dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Thermostable DNA polymerase (2 units) A total reaction volume of 50–100 μL Chúng nói enzyme polymerase, DNA mục tiêu mồi rõ phần Một số thành phần phản ứng (Tris, KCl and MgCl2), nồng độ ion magiê phản ứng đóng vai trò quan trọng thành công phản ứng PCR (Hình 4.4) Mg chất cần thiết cho DNA polymerase hoạt động, đặc điểm phản ứng PCR phụ thuộc vào nồng độ Mg sử dụng Nồng độ Mg thấp , phản ứng không xảy enzyme polymerase không hoạt động Nồng độ Mg cao, phản ứng đặc trưng sản xuất nhiều sản phẩm không mong muốn Nồng độ tối ưu Mg cần phải xác định thực nghiệm cho mồi PCR riêng biệt, thường có khoảng từ 1-5 mM Các thành phần đệm muối phản ứng (Tris KCl) thường sử dụng thường xuyên, làm giảm nồng độ KCl kích thích DNA polymerase lại mẫu lâu đạt chiều dài lớn sản phẩm khuếch đại (Foord Rose, 1994) Hình 4.4 : Ảnh hưởng nồng độ Mg hiệu đặc trưng thí nghiệm PCR Một thí nghiệm PCR thiết lập có chứa nồng độ MgCl khác Sau PCR, sản phẩm tách gel agarose nhuộm với ethidium bromide Các kích thước sản phẩm PCR thu được so sánh với thang DNA mẫu (M) Tái sản xuất yếu tố quan trọng cho thành công PCR , Qiagen GmbH Một phản ứng PCR thiết lập, thường phủ lớp dầu để ngăn chặn bốc mẫu trình làm nóng - cách khác, máy PCR với nắp ngăn chặn bốc nước nóng - trước chịu nhiệt độ khác mà thúc đẩy biến tính, nhiệt luyện, thành phần mở rộng chu kỳ PCR Điều kiện chu kỳ cho thí nghiệm PCR 94 ◦C, 30 s – giai đoạn biến tính 60 ◦C, 30 s – giai đoạn lai 72 ◦C, – giai đoạn kéo dài Giai đoạn biến tính lai ngắn, đủ phép phá vỡ gắn liên kết hydro sợi DNA Bắt đầu bao gồm bước biến tính ban đầu (94 C, phút) để đảm bảo mẫu DNA ban đầu chuỗi đơn Điều thường không xảy tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao chặn lại DNA mẫu Chiều dài sản phẩm PCR khuếch đại thời gian cho phép cho bước kéo dài phản ứng Hầu hết polymerase sử dụng PCR tái tạo DNA ống nghiệm với tỷ lệ khoảng 500-1000 bp min-1 (Bảng 4.2) Thời gian mà thí nghiệm PCR ủ nhiệt độ giãn điều chỉnh tùy thuộc vào chiều dài sản phẩm ban đầu Số chu trình PCR thực thử nghiệm cá nhân phụ thuộc vào số lượng hai mẫu DNA ban đầu phản ứng lượng DNA cần thiết sau trình khuếch đại Nói chung, để tránh lỗi chép (xem bên dưới), vài chu kỳ thực Điều thường có khoảng 17-25 chu kỳ Sau hoàn thành chu kỳ , phản ứng chuẩn PCR bao gồm bước kéo dài cuối (72 C phút) để đảm bảo tất DNA phản ứng nhân lên thành dạng mạch đôi Giai đoạn kéo dài cuối làm tăng hiệu nhân sản phẩm PCR (Li Guy, 1996) 4.2 DNA POLYMERASE CHỊU NHIỆT: Các vi khuẩn Thermus aquaticus lần phát số suối nước nóng Công viên quốc gia Yellowstone (Brock and Freeze, 1969) Từ tìm thấy sống môi trường nhiệt khắp giới Sinh vật sống nhiệt độ từ khoảng 50 80 C, nhiệt độ tối ưu tốc độ tăng trưởng khoảng 70 0C Taq ADN polymerase enzym monomeric với trọng lượng phân tử 94 kDa phân lập từ sinh vật (Chien,Edgar Trela, 1976; Luật sư cộng sự, 1989) Các enzyme chịu nhiệt, lặp DNA 74 0C chức sau ủ 95 C enzyme bao gồm hoạt động polymerase 5’ tới 3’ hoạt động exonuclease 5’tới 3’, thiếu 3’tới 5’ exonuclease (proofreading) hoạt động Việc thiếu proofreading hoạt động có nghĩa sở không xác đưa vào chuỗi polynucleotide mở rộng, loại bỏ Taq ADN polymerase dễ bị lỗi gây đột biến cho sản phẩm PCR khuếch đại Trong thử nghiệm in vitro, Taq ADN polymerase misincorporates base 104-105 base lặp lại (Barnes năm 1992; Cline, Braman Hogrefe, 1996) Các khác biệt lớn tỷ lệ lỗi ước tính do, phần, với phương pháp sử dụng gây đột biến Theo ước tính mức độ thấp nhất, với tỷ lệ lỗi 10 -4 lỗi cho cặp base tái sử dụng, chuỗi kb khuếch đại cho 25 chu kỳ với Taq sau khoảng 10 phần trăm sản phẩm khuếch đại có đột biến Tuy nhiên, đột biến xảy chu kỳ khuếch đại chu kỳ sau đó, thực tế tần số đột biến khác từ thí nghiệm thử nghiệm Mức độ báo lỗi không, nhiên, ảnh hưởng đến ảnh hưởng đến kết thí nghiệm.Nếu phản ứng PCR thực đơn để xác định có mặt hay vắng mặt gen phân tử DNA mục tiêu, sau 10 5’ (đỏ) cyanoethyl β-bảo vệ nhóm 3’-phosphite (màu xanh) Ngoài ra, tác nhân biến đổi khác (màu xanh) bảo vệ cho amin mồi diễn nơi phân tử Xem đoạn văn để biết chi tiết chu kỳ phản ứng Phản ứng ngưng tụ nucleoside có hiệu cao, với phần trăm nhóm 5’-hydroxyl không phản ứng với nucleoside gắn vào Để ngăn chặn phân tử chưa phản ứng tham gia phản ứng dẫn đến việc xóa cắt không mong muốn, nhóm chưa phản ứng 5’-OH bị khóa cách acetyl hóa acetic anhydride trước diễn bước oxy hóa Hiệu việc bắt cặp đảm bảo mồi lên đến chiều dài khoảng 60 nucleotide chiều tạo thành cách dễ dàng Sau tổng hợp xong, oligonucleotide cắt từ hỗ trợ hydroxit amoni nhiệt độ phòng Tiếp tục amoniac nhiệt độ cao tác động đến nhóm phosphat thông qua xoá gốc β nhóm cyanoethyl loại bỏ nhóm bảo vệ từ vị trí dị vòng Các oligonucleotide hoàn thành tinh từ hóa chất bị nhiễm sai sót, chuỗi trình tự đầy đủ thường bị phân lập cách lọc qua HPLC Các lợi lớn cho tổng hợp hóa học mồi trình tự sản xuất nhanh chóng tương đối rẻ (