ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ NGỌC MỸ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH CĨ KHẢ NĂNG TẠO HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CÂY THUỘC HỌ CAM (RUTACEAE) VÀ HỌ GỪNG (ZINGIBERACEAE) Chun ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số chun ngành: 62 42 40 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp.HCM, năm 2016 Cơng trình hồn thành tại: Bộ Mơn Vi Sinh – Kí Sinh Trùng, Khoa Dược, Trường Đại Học Y- Dược Tp.HCM Người hướng dẫn khoa học: Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng Phản biện 2: TS Phạm Nguyễn Đức Hồng Phản biện 3: TS Đinh Minh Hiệp Phản biện độc lập 1: TS Phạm Nguyễn Đức Hồng Phản biện độc lập 2: TS Đinh Minh Hiệp Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Mở đầu Vi sinh vật nội sinh vi sinh vật sống bên mơ thực vật khơng gây bệnh cho chủ Trong đó, vi khuẩn vi nấm vi sinh vật nội sinh thường gặp Theo nghiên cứu gần Hawksworth Rossman ước tính có đến 1,5 triệu lồi vi nấm khác nhau, khoảng 100.000 lồi mơ tả Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với chủ, chúng sử dụng chất dinh dưỡng để tồn tại, tạo sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học hormon sinh trưởng, chất kháng sinh có khả bảo vệ khỏi vi sinh vật gây bệnh Nhiều tài liệu cho thấy, sống cộng sinh mơ thực vật, vi nấm nội sinh sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn kháng nấm Họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) Việt Nam đa dạng, cam, chanh, qt, bưởi trồng phổ biến, có nhiều ứng dụng dược phẩm, thực phẩm… Từ đặc tính cho thấy, tiềm họ chứa hệ vi nấm nội sinh phong phú, sinh nhiều chất biến dưỡng có ý nghĩa việc điều trị bệnh Tuy vậy, nay, Việt Nam nói riêng giới nói chung chưa có nhiều nghiên cứu vi nấm nội sinh lồi thuộc hai họ thực vật Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm chủng vi nấm nội sinh có khả tạo chất biến dưỡng có lợi có khả sinh hoạt chất sinh học với hy vọng dùng để điều trị bệnh cho người cơng việc thú vị nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Từ chúng tơi thực luận án: “Nghiên cứu phân lập chủng vi nấm nội sinh có khả tạo hợp chất có hoạt tính sinh học từ thuộc họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae)” với mục tiêu tìm chủng vi nấm nội sinh có khả sinh hoạt chất sinh học cao từ thuộc họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) Tính cấp thiết đề tài: Hiện nay, thực vật hoạt chất chiết từ thực vật sử dụng rộng rãi điều trị nhiều loại bệnh Theo Balick cộng năm 1996, 119 loại hợp chất hóa học, 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, hợp chất sử dụng nhiều quốc gia Trước thực tế này, vấn đề đặt hoạt chất sinh học q giá sinh mối liên hệ tương sinh với vi nấm nội sinh có ích mơ thực vật Trên giới có nhiều nghiên cứu hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm sinh từ vi nấm nội sinh, chúng chủ yếu thuộc nhiều nhóm, bao gồm: alkaloid, peptid, steroid, terpenoid, phenol, quinine flavonoid… Điều mang lại nhiều hứa hẹn giải vấn đề kháng thuốc vi khuẩn chất kháng sinh hợp chất có hoạt tính cao Những đóng góp luận án: Đây nghiên cứu A terreus phân lập từ họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) nước giới Nghiên cứu mở hướng tiếp cận nguồn phương thức cung cấp hoạt chất kháng khuẩn chống oxy hóa, với đóng góp cụ thể sau: - Phân lập định danh 16/32 chủng vi nấm nội sinh từ họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) có chủng A.terreus có khả sinh hoạt chất sinh học cao - Khảo sát điều kiện ni cấy tối ưu chủng A terreus R-TN3 Ni cấy chiết chất chiết thơ có hoạt tính kháng S aureus MRSA chủng A terreus R-TN3 - Chiết hợp chất Y có hoạt tính kháng khuẩn Đã xác định giá trị MIC hợp chất Y có hoạt tính kháng S aureus MRSA Hợp chất Y xác định có khả ức chế dòng tế bào ung thư thử nghiệm (ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 ung thư phổi NCI-H460) - Đã tách hợp chất tinh khiết X1 X2 có hoạt tính chống oxy hóa cao giải phổ để tìm cấu trúc hợp chất Đây hợp chất chưa cơng bố cơng trình nước giới Hai hợp chất có khả ức chế dòng tế bào ung thư thử nghiệm, bao gồm dòng tế bào: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 ung thư phổi NCI-H460 Hợp chất X1 chứng minh có khả ức chế tế bào ung thư thơng qua khả cảm ứng apoptosis dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 điều kiện khảo sát Bố cục luận án: Luận án gồm 124 trang, đặt vấn đề trang, tổng quan tài liệu 26 trang, vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết nghiên cứu 51 trang, bàn luận 11 trang, kết luận kiến nghị trang Luận án có 66 bảng, 24 hình, sơ đồ, 15 biểu đồ, 91 tài liệu tham khảo, gồm 10 tài liệu tiếng Việt, 79 tài liệu tiếng Anh tài liệu tham khảo từ internet, phụ lục thể kết thực nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi nấm nội sinh: Khái niệm vi sinh vật nội sinh, vi nấm nội sinh, đặc điểm vi nấm nội sinh, trình bày quan hệ vi nấm nội sinh thực vật, ngun tắc để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh, đa dạng vi nấm nội sinh, số vi nấm nội sinh sinh hoạt chất sinh học 1.2 Tổng quan Aspergillus: Trình bày vị trí phân loại, đặc điểm hình thể, đặc điểm sinh thái phân bố Aspergillus Phân loại mơ tả đặc điểm hình thể, đặc điểm sinh thái phân bố A terreus, điều kiện ảnh hưởng đến sinh hoạt chất sinh học số hoạt chất sinh học A terreus sản sinh 1.3 Hệ thống phân loại Aspergillus: Định danh Aspergillus theo phương pháp truyền thống phương pháp sinh học phân tử 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước: Trình bày nghiên cứu ngồi nước nước 1.5 Tổng quan phương pháp chiết phân tách hoạt chất sinh học - Các phương pháp chiết, tách phân đoạn: Khái niệm phương pháp chiết chiết lỏng – lỏng, chiết lỏng rắn, chiết pha rắn Các phương pháp sắc ký phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc kí cột cổ điển - Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học phương pháp khuếch tán, tự sinh đồ hay phương pháp pha lỗng - Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất: Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) - Các phương pháp thử độc tính tế bào: Phương pháp xác định khả ức chế tế bào phương pháp xác định khả cảm ứng apoptosis: Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, thử nghiệm DNA phân mảnh, thử nghiệm caspase – CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Nguồn mẫu phân lập: Các thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) họ Cam (Rutaceae) 2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm: E.coli ATCC 25922; P.aeruginosa ATCC 27853; S.aureus ATCC 29213; MRSA ATCC 43300; S faecalis ATCC 29212; C albicans ATCC 10231 2.1.3 Mơi trường ni cấy: PDA, PSB,TSB,TSA, SDA, CDA 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phân lập vi nấm nội sinh từ thực vật 2.2.2 Sàng lọc vi nấm nội sinh có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm: Sử dụng phương pháp khuếch tán từ khoanh thạch thử 2.2.3 Sàng lọc vi nấm nội sinh có khả sinh hoạt chất chống oxy hóa: Hoạt hóa vi nấm chuẩn bị mẫu thử; xác định hoạt chất chống oxy hóa chất vi nấm nội sinh sản sinh phương pháp nhuộm DPPH nhanh 2.2.4 Phương pháp định danh vi nấm: Các vi nấm nội sinh định danh theo khóa phân loại Guy St Germain, năm 1995 2.2.5 Chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sinh hoạt chất sinh học: Sử dụng phương pháp khuếch tán từ khoanh thạch thử 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng pH mơi trường lên sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3: A terreus R-TN3 ni mơi trường PDB với pH mơi trường điều chỉnh khoảng từ 4, 5, 6, 7, 2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy lên sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3: Chủng vi nấm nội sinh ni mơi trường PDB 37 oC nhiệt độ phòng (25 – 30 oC) 2.2.8 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nitrogen, độ thơng khí lên sinh hoạt chất kháng khuẩn: Thiết kế mơ hình thực nghiệm D – Optimal phần mềm Design-Expert 6.0.6 với thành phần mơi trường điều kiện ni cấy (xi) xác định dựa vào đường kính vòng ức chế MRSA, S.aureus 2.2.9 Khảo sát ảnh hưởng dầu lên sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3: Ni cấy A terreus R-TN3 mơi trường bổ sung % dầu mè, dầu hướng dương, dầu đậu nành, dầu bắp, dầu olive 2.2.10 Khảo sát điều kiện ni cấy tối ưu: Thiết kế mơ hình thực nghiệm phần mềm Design - Expert 6.0.6 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy phần mềm BC Pharsoft ni cấy lơ kiểm chứng 2.2.11 Ni cấy chủng A terreus R-TN3 mơi trường tối ưu: A terreus R-TN3 ni cấy mơi trường tối ưu khảo sát điều kiện ni cấy tĩnh, nhiệt độ phòng (25 – 30 oC) 2.2.12 Chiết hoạt chất kháng khuẩn từ dịch ni cấy A terreus RTN3: Sử dụng phương pháp để chiết hoạt chất sinh học cao chiết thơ như: Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy; Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chất chiết thơ; Phương pháp tự sinh đồ phương pháp vi pha lỗng 2.2.13 Tách phân đoạn cho hoạt tính sinh học từ chất chiết thơ 2.2.13.1 Sắc ký lớp mỏng: Chất chiết thơ từ mơi trường ni A terreus R-TN3 hòa MeOH với nồng độ mg/ml, chấm dung dịch chất thử lên mỏng phát kết phương pháp soi đèn UV254, UV365, thuốc thử VS 2.2.13.2 Sắc kí cột cổ điển: Hệ dung mơi dùng để triển khai cột chloroform - methanol với tỷ lệ thay đổi theo hướng methanol tăng dần Triển khai cột, hứng phân đoạn kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng Xác định phân đoạn cho hoạt tính kháng khuẩn phương pháp tự sinh đồ Xác định phân đoạn cho hoạt tính chống oxy hóa phương pháp định tính nhanh DPPH 2.2.14 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất: Các chất thu qua sắc ký cột xác định cấu trúc dựa phương pháp phổ: Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1HNMR, 13C-NMR, DEPT) hai chiều (HMBC, HSQC, COSY, NOESY) 2.2.15 Thử độc tính tế bào: Phương pháp thử độc tính tế bào in vitro Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ xác nhận phép thử độc tính tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm diệt tế bào ung thư điều kiện in vitro 2.2.16 Phân tích thống kê liệu: Số liệu xử lý thống kê phần mềm Microsoft Excel, Microsoft Office phiên 2003 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Kết sàng lọc hoạt tính khảng khuẩn, kháng nấm: Qua sàng lọc, chúng tơi thu 10/82 chủng vi nấm nội sinh họ Gừng (Zingiberaceae) 11/64 chủng vi nấm nội sinh họ Cam (Rutaceae) có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm Trong đó, chủng sinh chất có hoạt tính cao ổn định, phổ kháng khuẩn rộng là: R - TN3, N GL1, Q - TL3, T2-CL1 3.1.2 Kết sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa: Kết sàng lọc chủng có hoạt tính chống oxy hóa thu 18/146 chủng có hoạt tính từ trung bình đến mạnh họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) 3.1.3 Kết định danh chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học: Qua q trình sàng lọc thử hoạt tính sinh học chủng vi nấm nội sinh, chúng tơi thu xạ khuẩn vi nấm sống nội sinh Vì chủng xạ khuẩn nội sinh có khả sản sinh hoạt chất sinh học nên chúng tơi tiến hành thu nhận định danh Kết định danh 16/32 chủng có khả sinh hoạt chất từ trung bình đến mạnh thu kết sau: 3.1.4 Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao: Tiến hành khảo sát khả phát triển sinh hoạt chất sinh học chủng A terreus 3.1.4.1 Khảo sát khả sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng A terreus: Tiến hành ni chủng A terreus mơi trường PDA, thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chủng vi khuẩn thử nghiệm S aureus, S feacalis, Pseudomonas, E coli, MRSA chủng vi nấm C albicans vào ngày thứ ni cấy Bảng 3.7 Tác động kháng khuẩn chủng A terreus STT Chủng T2– CL1 Đường kính vòng ức chế (mm) S aureus MRSA 10,33 ± 1,33d 12,0 ± 1,54c Q – TL3 R – TN3 N – GL1 14,66 ± 1,33c 21,33 ± 1,85a 20,33 ± 1,33a 17,33 ± 1,54b 20,67 ± 1,31a 20,33 ± 1,54a a,b,c,d: Trong cột số có mẫu tự khơng khác biệt mức 0,05 Kết cho thấy chủng T2 – CL1 tác động kháng yếu nhất, chủng R – TN3, N – GL1 kháng mạnh, chủng Q – TL3 khả kháng yếu N – GL1 kháng khuẩn mức cao (Bảng 3.6) 3.1.4.2 Khả sinh hoạt chất chống oxy hóa chủng A terreus: Sau cấy hoạt hóa CDA, tiến hành pha dịch treo ni PDB ngày; sau định tính khả sinh hoạt chất chống oxy hóa chủng A terreus Bảng 3.8 Kết định tính khả chống OXH chủng A terreus STT Chủng T2 – CL1 Q – TL3 R – TN3 N – GL1 Kết chống OXH ++ ++ +++ ++ Chú thích: (+): có hoạt tính chống oxy hóa yếu; (++): có hoạt tính chống oxy hóa trung bình; (+++): có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Dựa vào kết Bảng 3.7 cho thấy chủng A terreus nghiên cứu, chủng R – TN3 sinh hoạt chất chống oxy hóa mạnh nhất, ba chủng lại gồm T2 – CL1, Q – TL3, N – GL1 sinh hoạt chất chống oxy hóa mức trung bình (Phụ lục 3) 3.1.4.3 Khảo sát đặc tính cao chiết  Khảo sát hệ dung mơi tối ưu: Chạy sắc ký với hệ dung mơi khảo sát thu kết hệ dung mơi CHCl3:CH3COOH với tỷ lệ 9:1 phân tách nhiều hoạt chất chủng A terreus  Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy: Các cao chiết thơ sau hòa tan dung mơi với nồng độ thích hợp tẩm lên đĩa giấy đặt lên mơi trường trải dịch khuẩn thử nghiệm Bảng 3.10 Tác động kháng khuẩn cao chiết thơ chủng A terreus Vi khuẩn S aureus MRSA T2 – CL1 16,67±1,72b 16,0±1,54a Đường kính vòng ức chế (mm) Q - TL3 R – TN3 N - GL1 9,67±1,72c 18,67±1,72a 17,67±1,72ab 17,0±1,54a 17,33±1,54a 13,67±1,54b a,b,c,ab: Trong cột số có mẫu tự khơng khác biệt mức 0,05 Cao chiết thơ chủng R-TN3 cho kết kháng tối đa chủng MRSA S.aureus Các cao chiết thơ chủng T2-CL1, Q-TL3, NGL1 cho kết kháng trung bình  Phương pháp tự sinh đồ: Các mỏng sắc ký phân tách thành hoạt chất đặt đĩa mơi trường trải khuẩn thử nghiệm nhằm tìm phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn (Bảng 3.10) Bảng 3.11 Tác động kháng khuẩn phân đoạn thu từ chủng A terreus PĐ PĐ PĐ 12 T2-CL1 PĐ 13 PĐ 15 PĐ PĐ Q-TL3 PĐ 10 PĐ 12 PĐ 15 Chủng MRSA 9,33±1,44b 11,67±1,44a 11,33±1,44a 12,67±1,44a 0,0c 9,33±0,81b 13,67±0,81a 0,0c 9,33±0,81b S.aureus 0,00c 11,67±1,22b 0,00c 13,33±1,22a 14,33±1,24b 9,33±1,24d 0,0e 12,33±1,24c 16,67±1,24a PĐ MRSA S.aureus PĐ 12,67±1,15b 12,0±1,49b PĐ 12 6,67±1,15c 7,33±1,49c R-TN3 PĐ 13 16,67±1,15a 16,67±1,49a Chủng PĐ 11 PĐ 12 N-GL1 PĐ 13 0,0c 9,33±1,33b 13,0±1,33a 9,33±0,94b 12,67±0,94a 0,0c a,b,c,d,e: Trong cột số có mẫu tự khơng khác biệt mức 0,05 Từ kết Bảng 3.10 cho thấy chủng R-TN3 có phân đoạn kháng phân đoạn 13 cho hoạt tính kháng khuẩn cao MRSA S aureus 3.1.5 Khảo sát điều kiện ni cấy chủng A terreus R-TN3 3.1.5.1 Khảo sát ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy với chủng A terreus R-TN3: Khảo sát ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy lên sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng A terreus R-TN3 Bảng 3.13 Ảnh hưởng pH mơi trường khác sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3 pH mơi trường Đường kính vòng ức chế (mm) S aureus MRSA 11,67 ± 1,41d 9,67 ± 1,24d 14,0 ± 1,41c 15,0 ± 1,24b a 20,67 ± 1,31 21,33 ± 1,85a b 15,67 ± 1,41 15,67 ± 1,24b c 14,0 ± 1,41 13,67 ± 1,24c a,b,c,d: Trong cột số có mẫu tự khơng khác biệt mức 0,05 Kết Bảng 3.12 cho thấy mơi trường ni cấy có pH thích hợp cho sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng A terreus R-TN3 3.1.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chủng A terreus R-TN3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng A terreus R-TN3 Nhiệt độ khảo sát thí nghiệm nhiệt độ phòng nhiệt độ 37 oC Kết trình bày Bảng 3.13 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3 Nhiệt độ ni cấy Nhiệt độ phòng Nhiệt độ 37oC Đường kính vòng ức chế (mm) MRSA S aureus 21,33 ± 1,85a 20,67 ± 1,31a 15,0 ± 1,85b 15,67 ± 1,31b a,b: Trong cột số có mẫu tự khơng khác biệt mức 0,05 Ở nhiệt độ phòng (25-30 oC), chủng A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn mạnh Vậy chọn nhiệt độ phòng nhiệt độ thích hợp để tiến hành ni cấy chủng A terreus R-TN3 3.1.5.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nitrogen, độ thơng khí Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nitrogen độ thơng khí lên sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng A terreus R-TN3 Lượng bào tử đầu vào 104 CFU/ml, ni cấy điều kiện nhiệt độ phòng Thành phần mơi trường điều kiện ni cấy xác định dựa vào đường kính vòng ức chế MRSA S aureus vào thời điểm 5, 7, 9, 12 ngày Bảng 3.15 Các mức khảo sát biến độc lập Mức khảo sát x1 Glucose % Saccharose % Tinh bột gạo % Rỉ đường 2,7 % x2 Khoai tây 20 % Cao thịt % Cao nấm men % Dịch đậu nành 10 % x3 Lắc Tĩnh Từ 23 mơi trường có thành phần điều kiện thơng khí khác nhau, mơi trường có hàm lượng khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 % saccharose %, điều kiện tĩnh, A terreus R-TN3 cho tác động kháng MRSA, S aureus tốt ổn định; thời gian thích hợp để thu nhận hoạt chất kháng khuẩn từ dịch ni cấy ngày thứ ni cấy 3.1.5.4 Ảnh hưởng dầu: Để khảo sát ảnh hưởng dầu lên sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3, dầu thực vật dầu mè, dầu hướng dương, dầu nành, dầu bắp, dầu olive (nồng độ %) bổ sung vào mơi trường khoai tây-rỉ đường với thành phần gồm khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 %, ni cấy điều kiện tĩnh Thực song song với chứng mơi trường khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 % khơng bổ sung dầu Kết cho thấy mơi trường khoai tây-rỉ đường khơng bổ sung dầu chủng A terreus R-TN3 có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn cao Điều cho thấy dầu ảnh hưởng khơng tốt có khả kiềm hãm sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3 (Bảng 3.16) Bảng 3.32 Hoạt tính kháng khuẩn chất CT – EtOAc Vết 12 13 Đường kính vòng ức chế (mm) S aureus MRSA 11,33 ± 1,15b 11,33 ± 1,15b 7,33 ± 1,15c 7,33 ± 1,15c a 15,33 ± 1,15 15,33 ± 1,15a a,b,c: Trong cột số có mẫu tự khơng khác biệt mức 0,05 3.1.12 Sắc ký cột cổ điển Tổng khối lượng cao phân đoạn thu qua q trình sắc ký cột 10,592 g Từ phân đoạn tinh hợp chất X1 màu vàng nhạt, dạng vơ định hình, có Rf 0,692 Tiến hành định tính khả chống oxy hóa hợp chất X1 DPPH, kết cho thấy hợp chất X1 có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Từ phân gam phân đoạn (sau tách hợp chất X1), nhồi chạy cột nhỏ với hệ dung mơi n-hexan : chloroform (9:1) Bảng 3.35 Kết chạy cột phân đoạn PĐ 10 11 12 13 14 15 16 Dung mơi giải ly n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan: chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform n-hexan : chloroform Tỷ lệ 9:1 9:1 8:2 7:3 7:3 7:3 7:3 7:3 7:3 6:4 6:4 6:4 6:4 5:5 5:5 5:5 Vết 0 2 3 4 Ghi Tạp Chất Y Chất X2 Khóa cột, kết tinh Kết chạy cột 3g phân đoạn X1 thu chất X2 có hoạt tính chống oxy hóa cao hợp chất Y có hoạt tính kháng khuẩn cao Tiến hành tinh hợp chất X2 Y để giải cấu trúc thử độc tế bào ung thư để xác định hoạt tính sinh học hợp chất X2 Y 12 Y X2 X1 Hình 3.13 Kết SKLM hợp chất X1, X2 Y 3.1.13 Hợp chất Y 3.1.13.1 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất Y Thử hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn hợp chất Y phương pháp tự sinh đồ khuếch tán qua đĩa giấy thu kết hợp chất Y có hoạt tính kháng cao S.aureus cho hoạt tính kháng trung bình MRSA Xác định phân đoạn kháng hợp chất Y phương pháp tự sinh đồ Hợp chất Y chứa vết sắc ký đồ (UV254), chủ yếu vết số 13 vết số 12, hai phân đoạn cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh vết vết lại Kết cho thấy nồng độ chất thử Y 3,125 µg/ml cho hoạt tính kháng với chủng S aureus MRSA mức trung bình Bằng phương pháp SKLM tự sinh đồ, chiết hợp chất Y chứa hai hợp chất khác có hoạt tính kháng khuẩn xác định giá trị MIC hợp chất Y 25 µg/ml 3.1.13.2 Kết thử độc tế bào hợp chất Y Thử độc tế bào tế bào ung thư vú MCF-7: Hợp chất Y xác định khả ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 Bảng 3.38 Kết thử độc tế bào vú MCF-7 hợp chất Y Nồng độ (μg/ml) 100 75 50 25 10 IC50 Phần trăm ức chế tế bào (%) Lần Lần Lần TB ĐLC 76,90 87,02 89,23 84,38 6,57 70,09 71,58 69,51 70,39 1,07 43,75 48,09 45,21 45,69 2,21 17,30 10,92 9,72 12,64 4,08 1,00 -6,08 -9,30 -4,79 5,27 54,08 52,38 54,19 53,55 1,01 Khả ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 hợp chất Y gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 70 % tế bào MCF-7 tăng lên nồng độ 100 µg/ml gây chết 84 % tế bào MCF-7 13 Thử độc tế bào tế bào ung thư cổ tử cung Hela: Hợp chất Y xác định khả ức chế tế bào ung thư cổ tử cung Hela Bảng 3.39 Kết thử độc tế bào Hela hợp chất Y Nồng độ (μg/ml) 75 50 40 30 20 10 IC50 Lần 64,36 52,14 50,31 29,12 20,16 9,37 39,86 Lần 65,59 52,83 51,42 21,05 19,03 10,32 39,53 Lần 61,56 60,75 53,23 24,73 16,40 8,60 38,87 TB 63,83 55,24 51,65 24,97 18,53 9,43 39,42 ĐLC 2,06 4,79 1,47 4,04 1,93 0,86 0,50 Khả ức chế tế bào ung thư Hela hợp chất Y gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết 55 % tế bào Hela tăng lên nồng độ 75 µg/ml gây chết 63 % tế bào Hela Thử độc tế bào tế bào ung thư gan Hep G2: Hợp chất Y xác định khả ức chế tế bào ung thư gan Hep G2 Bảng 3.40 Kết thử độc tế bào ung thư gan Hep G2 hợp chất Y Nồng độ (μg/ml) 100 75 50 25 10 IC50 Phần trăm ức chế tế bào (%) Lần Lần Lần TB ĐLC 78,25 75,00 70,07 74,44 4,12 61,63 58,86 56,58 59,02 2,53 46,83 41,34 35,36 41,18 5,73 26,89 29,13 23,85 26,62 2,65 -1,27 -3,56 -2,27 -2,37 1,15 52,38 56,45 63,80 57,54 5,79 Khả ức chế tế bào ung thư Hep G2 hợp chất Y gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 59 % tế bào Hep G2 tăng lên nồng độ 100 µg/ml gây chết 74 % tế bào Hep G2 Thử độc tế bào tế bào ung thư phổi NCI-H460: Hợp chất Y xác định khả ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460 Bảng 3.41 Kết thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 hợp chất Y Nồng độ (μg/ml) 100 75 50 25 10 IC50 Phần trăm ức chế tế bào (%) Lần Lần Lần TB ĐLC 76,34 84,36 82,10 80,93 4,13 58,99 60,11 64,43 61,18 2,87 18,28 18,51 21,79 19,53 1,96 -7,07 2,01 4,12 -0,31 5,94 -15,82 -4,30 -0,59 -6,90 7,94 71,07 68,79 66,56 68,81 2,26 14 Khả ức chế tế bào ung thư NCI-H460 hợp chất Y gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 61 % tế bào NCI-H460 tăng lên nồng độ 100 µg/ml gây chết 80 % tế bào NCI-H460 3.1.15 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân tách 3.1.15.1 Hợp chất X1: Hợp chất X1 thu từ sắc ký cột cổ điển, xác định cấu trúc dựa vào kỹ thuật phổ phổ H, C13, phổ HRMS phổ chiều để xác định cấu trúc (Phụ lục 4) Kết cho thấy hợp chất X1 có cơng thức cấu tạo sau: Hình 3.18 Các tương tác HMBC CTCT X1 Chất X1 có tên gọi: Methyl 2-acetyl-5-methoxy-4-oxo-4H-chromen-7carboxylat Đây hợp chất mới, chưa cơng bố cơng trình nước giới 3.1.15.2 Hợp chất X2: Hợp chất X2 thu từ sắc ký cột cổ điển, xác định cấu trúc dựa vào kỹ thuật phổ phổ H, C13, phổ HRMS phổ chiều để xác định cấu trúc (Phụ lục 5) Dung mơi hòa tan mẫu: DMSO Kết cho thấy hợp chất X2 có cơng thức cấu tạo sau: Hình 3.19 Các tương tác HMBC CTCT X2 Chất X2 có tên gọi: Methyl 2-((4-amino-2-bromo-3-methyl-5thioxocyclopenta-1,3-dien-1-yl) oxy)-4-hydroxy-6-methoxybenzoat Đây hợp chất chưa cơng bố cơng trình giới 3.1.16 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất X1 3.1.16.1 Kết xác định khả chống oxy hóa thử nghiệm DPPH hợp chất X1: Kết cho thấy chất X1 có hoạt tính chống oxy hóa cao, khả đánh bắt gốc tự DPPH gia tăng tuyến tính theo nồng 15 độ Ở nồng độ 100 ppm chất X1 có khả đánh bắt 80 % gốc tự DPPH 3.1.16.2 Kết thử độc tế bào hợp chất X1 Hợp chất X1 xác định khả ức chế tế bào ung thư MCF-7, Hela, Hep G2 NCI-H460 Kết trình bày sau: Thử độc tế bào MCF-7: Các hợp chất phân lập xác định khả ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 Bảng 3.48 Kết thử độc tế bào MCF-7 chất X1 Nồng độ (µg/ml) 100 50 40 20 10 IC50 (µg/ml) Lần 80,82 75,06 68,92 33,12 10,54 -0,86 28,88 Lần 81,27 73,61 65,20 31,40 11,29 4,12 30,04 Lần 79,87 78,34 71,28 34,50 8,05 -3,09 27,90 TB 80,65 75,67 68,47 33,01 9,96 0,06 28,94 ĐLC 0,71 2,43 3,07 1,55 1,69 3,69 1,07 Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 75 % tế bào MCF-7 tăng lên gây chết 80 % tế bào MCF-7 nồng độ 100 µg/ml Thử độc tế bào Hela: Các hợp chất phân lập xác định khả ức chế tế bào ung thư cổ tử cung Hela Bảng 3.49 Kết thử độc tế bào Hela chất X1 Nồng độ (µg/ml) 100 75 50 25 10 IC50 (µg/ml) Lần 90,78 65,48 58,58 21,13 -3,77 46,26 Lần 84,20 64,11 59,27 25,00 2,82 45,39 Lần 81,10 66,51 60,14 23,92 0,91 45,59 TB 85,36 65,37 59,33 23,35 -0,01 45,75 ĐLC 4,94 1,20 0,78 2,00 3,39 0,46 Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 65 % tế bào Hela tăng lên gây chết 85 % tế bào Hela nồng độ 100 µg/ml Thử độc tế bào Hep G2: Các hợp chất phân lập xác định khả ức chế tế bào ung thư gan Hep G2 Bảng 3.50 Kết thử độc tế bào Hep G2 chất X1 Nồng độ (µg/ml) 100 75 50 25 10 IC50 (µg/ml) Lần 81,83 75,75 65,50 32,81 12,18 36,53 Lần 79,79 75,90 67,29 36,30 15,06 34,21 Lần 77,23 74,58 64,26 32,26 14,58 37,35 TB 79,62 75,41 65,68 33,79 13,94 36,03 ĐLC 2,31 0,72 1,52 2,19 1,54 1,63 16 Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 75 % tế bào NCI-H460 tăng lên gây chết gần 80 % tế bào ung thư gan Hep G2 nồng độ 100 µg/ml Thử độc tế bào NCI-H460: Các hợp chất phân lập xác định khả ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460 Bảng 3.51 Kết thử độc tế bào NCI-H460 chất X1 Nồng độ (µg/ml) 100 50 35 25 10 IC50 (µg/ml) Lần 76,34 68,46 62,67 31,91 16,59 32,12 Lần 80,46 72,86 60,74 29,04 22,96 30,83 Lần 78,21 73,92 65,20 31,09 20,08 29,74 TB 78,34 71,75 62,87 30,68 19,88 30,90 ĐLC 2,06 2,90 2,24 1,48 3,19 1,19 Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết 70 % tế bào NCI-H460 tăng lên gần 80 % tế bào NCI-H460 nồng độ 100 µg/ml Kết cho thấy hợp chất X1 có khả ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, thơng qua khả ức chế dòng tế bào thử nghiệm: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 ung thư phổi NCI-H460 3.1.17 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất X2 3.1.17.1 Kết xác định khả chống oxy hóa thử nghiệm DPPH hợp chất X2: Hợp chất X2 xác định khả chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Kết cho thấy chất X2 có hoạt tính chống oxy hóa cao, khả đánh bắt gốc tự DPPH gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 400 ppm chất X2 có khả đánh bắt 75 % gốc tự DPPH 3.1.17.2 Kết thử độc tế bào hợp chất X2 Hợp chất X2 xác định hoạt tính ức chế tế bào dòng tế bào MCF-7, Hela, Hep G2 NCI-H460 Kết trình bày sau: Thử độc tế bào ung thư vú MCF-7: Hợp chất X2 xác định khả ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 Bảng 3.53 Kết thử độc tế bào ung thư vú MCF-7 chất X2 Nồng độ (μg/ml) 100 75 50 25 10 IC50 Phần trăm ức chế tế bào (%) Lần Lần Lần TB ĐLC 78,65 77,02 78,96 78,21 1,04 74,91 74,84 74,69 74,82 0,11 65,97 67,39 67,32 66,89 0,80 19,34 27,95 27,62 24,97 4,88 -9,67 -7,38 -8,32 -8,45 1,15 44,45 41,20 41,14 42,26 1,89 17 Khả ức chế tế bào hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 74 % tế bào ung thư vú MCF-7 tăng lên gây chết gần 80 % tế bào MCF-7 nồng độ 100 µg/ml Thử độc tế bào ung thư cổ tử cung Hela: Hợp chất X2 xác định khả ức chế tế bào ung thư cổ tử cung Hela Bảng 3.54 Kết thử độc tế bào Hela chất X2 Nồng độ (μg/ml) 75 50 40 30 20 10 IC50 Lần 66,59 60,82 51,82 23,23 7,54 0,00 39.36 Lần 62,27 57,73 53,26 27,27 8,09 -8,07 38,75 Lần 68,56 56,05 51,32 24,27 5,80 -4,49 39,51 TB 65,81 58,20 52,13 24,93 7,14 -4,19 39,21 ĐLC 3,22 2,42 1,01 2,10 1,19 4,04 0,41 Khả ức chế tế bào hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết 58 % tế bào ung thư Hela tăng lên gây chết 65 % tế bào Hela nồng độ 75 µg/ml Thử độc tế bào Hep G2: Hợp chất X2 xác định khả ức chế tế bào ung thư gan Hep G2 Bảng 3.55 Kết thử độc tế bào ung thư gan Hep G2 chất X2 Nồng độ (μg/ml) 100 75 50 25 10 IC50 Phần trăm ức chế tế bào (%) Lần Lần Lần TB ĐLC 82,72 86,85 90,89 86,82 4,09 71,96 75,99 78,23 75,39 3,18 53,44 59,92 56,96 56,77 3,24 3,88 14,61 9,37 9,29 5,37 0,18 4,59 -2,53 0,75 3,60 52,00 45,44 47,47 48,30 3,36 Khả ức chế tế bào hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết 75 % tế bào ung thư gan Hep G2 tăng lên gây chết 86 % tế bào Hep G2 nồng độ 100 µg/ml Thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460: Hợp chất X2 xác định khả ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460 Khả ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460 hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết gần 50 % tế bào ung thư phổi NCI-H460 tăng lên gây chết 70 % tế bào NCI-H460 nồng độ 75 µg/ml Kết thử nghiệm độc tính tế bào hợp chất X1 X2 cho thấy chất X1 có khả ức chế dòng tế bào ung thư in vitro tốt X2 Do đó, chúng tơi bước đầu tìm hiểu chế tác động X1 thơng qua khả cảm ứng apoptosis (Bảng 3.55) 18 Bảng 3.56 Kết thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 chất X2 Nồng độ (μg/ml) 75 50 40 30 20 IC50 Phần trăm ức chế tế bào (%) Lần Lần Lần TB ĐLC 72,77 74,02 67,47 71,42 3,47 46,88 47,10 44,44 46,14 1,47 44,06 45,36 45,32 44,91 0,74 17,33 22,97 19,65 19,98 2,83 9,41 1,05 -1,50 2,98 5,71 49,92 48,78 52,08 50,26 1,68 3.1.18 Kết apoptosis hợp chất X1: Tiến hành tìm hiểu chế tác động X1 thơng qua khả cảm ứng apoptosis thử nghiệm DNA phân mảnh, kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB, caspase-3 dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 3.1.18.1 Kết thử nghiệm DNA phân mảnh Hiện tượng DNA phân mảnh coi “dấu ấn” q trình apoptosis Chúng tơi tiến hành xử lý tế bào NCI-H460 với X1 nồng độ 100 µg/ml 48 69 (Hình 3.20) Kết cho thấy tượng DNA phân mảnh xuất rõ ràng quần thể tế bào NCI-H460 xử lý với X1 nồng độ 100 µg/ml 48 69 (giếng 3), khơng quan sát thấy tượng mẫu tế bào NCI-H460 đối chứng (khơng xử lý, giếng 2) Điều chứng tỏ X1 cảm ứng q trình apoptosis tế bào ung thư phổi NCI-H460 điều kiện khảo sát Hình 3.20 Kết thử nghiệm DNA phân mảnh; M: thang chuẩn 100 bp Tế bào NCI-H460 xử lý với X1 nồng độ 100 µg/ml 48 Tế bào NCI-H460 đối chứng (khơng xử lý) Tế bào NCI-H460 xử lý với X1 nồng độ 100 µg/ml 69 3.1.18.2 Thử nghiệm kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB Chúng tơi tiến hành nhuộm tế bào NCI-H460 đối chứng (tế bào khơng xử lý) tế bào ủ với X1 nồng độ 100 µg/ml, 36, 48 60 với dung dịch nhuộm AO:EB Kết quan sát kính hiển vi huỳnh quang cho thấy thay đổi hình thái tế bào ủ với X1 so với tế bào đối chứng Mẫu tế bào NCI-H460 xử lý với chất chuẩn Camptothecin (CPT) nồng độ 0,01 µg/ml 36 chứng dương quy trình (Hình 3.21) 19 Hình 3.21 Thử nghiệm kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB 3.1.18.3 Thử nghiệm Caspase-3 Chúng tơi tiến hành xử lý tế bào NCI-H460 với X1 nồng độ 100 µg/ml 36, 48 60 để khảo sát khả hoạt hóa caspase-3 X1 q trình apoptosis (Biểu đồ 3.15) Kết cho thấy hoạt tính caspase-3 tăng có ý nghĩa thống kê sau 36 xử lý với X1 nồng độ 100 µg/ml, tiếp tục tăng đạt mức tối ưu 48 giờ, sau giảm mạnh thời gian xử lý kéo dài 60 (hình dưới) Mẫu tế bào NCI-H460 xử lý với chất chuẩn Camptothecin (CPT) nồng độ 0,01 µg/ml 36 chứng dương quy trình Biểu đồ 3.15 Thử nghiệm Caspase-3 hợp chất X1 Từ kết cho thấy X1 có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư thơng qua khả cảm ứng apoptosis dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 điều kiện khảo sát 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Sự tương tác chủ vi nấm nội sinh Giữa vi nấm nội sinh chủ có mối quan hệ phức tạp, tương tác chủ-vi nấm nội sinh từ mối quan hệ hỗ sinh thơng qua hội sinh để 20 ký sinh, tùy thuộc vào khuynh hướng di truyền, giai đoạn phát triển, tình trạng dinh dưỡng yếu tố mơi trường Vi nấm nội sinh gián tiếp hưởng lợi từ q trình phát triển chủ cách sinh chất chuyển hóa thứ cấp giúp cho chủ thích nghi với tác nhân phi sinh học ánh sáng, hạn hán stress, chẳng hạn động vật ăn cỏ, trùng giun tròn cơng hay tác nhân gây bệnh Qua q trình sàng lọc phân lập thuộc họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae), chúng tơi nhận thấy vi nấm nội sinh diện hầu hết phận Tuy nhiên chủng sinh hoạt chất sinh học cao chủ yếu tập trung thân Các phận dùng sử dụng chiết hoạt chất kháng khuẩn kháng nấm thân rễ, vỏ có tồn chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao Điều cho thấy phận có chứa tinh dầu có khả ức chế phát triển sinh hoạt chất sinh học vi nấm nội sinh Nghiên cứu hồn tồn phù hợp với nghiên cứu Schulz Boyle năm 2005, nhóm tác giả đề xuất tượng nội sinh vi nấm đối kháng cân chủ vi nấm nội sinh 3.2.2 Sàng lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học Đa số thuộc họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) phân lập có diện vi nấm nội sinh nhiên khơng phải tồn vi nấm nội sinh có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm chống oxy hóa Trong nghiên cứu có 21/146 chủng phân lập cho hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 18/146 chủng có hoạt tính chống oxy hóa Định danh 16/32 chủng vi nấm nội sinh có chủng A terreus có khả sinh hoạt chất sinh học cao 3.2.3 Định danh chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao Về mặt hình thái học, chủng A terreus thể đầy đủ đặc điểm chủng ni cấy nấm phát triển tương đối nhanh, khuẩn lạc tròn, dạng bột, mịn nhung, có màu vàng nâu đến màu nâu sậm giữa, vòng ngồi có màu trắng dần chuyển sang nâu, mặt trái có màu vàng sẫm; cho sắc tố màu nâu đến nâu đen lan mơi trường; có xuất giọt tiết ngày thứ 10 ni cấy Khi quan sát kính hiển vi, sợi nấm khơng có vách ngăn khơng màu, tồn bào tử đính bên - loại bào tử đính hay hạt đính; phần đỉnh to thành bọng hình chùy, bọng mang thể bình, bào tử đính ngắn, trơn.; thể bình song song hợp thành cụm đỉnh bọng, thể bình có hai tầng; đầu dạng hình tia tỏa tròn phù hợp với khóa phân loại Raper KB năm 1965 [61], tài liệu liên quan [61], [78] với chủng Bộ mơn mơ tả Định danh chủng A terreus phương pháp giải trình tự gen vùng ITS tra cứu BLAST SEARCH cho kết tương tự 21 phương pháp hình thái, góp phần khẳng định chủng có khả sinh chất có hoạt tính sinh học cao mà đề tài phân lập A terreus 3.2.4 Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao Qua q trình sàng lọc phân lập chọn chủng A terreus có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn chống oxy hóa cao Tiến hành khảo sát khả phát triển chủng mơi trường PDA, SDA, CDA để theo dõi độ ổn định chủng Kết cho thấy chủng R – TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn chống oxy hóa cao Chọn chủng R – TN3 để nghiên cứu chun sâu khả sinh hoạt chất sinh học cao ổn định 3.2.5 Điều kiện ni cấy tối ưu chủng A terreus R-TN3 Kết cho thấy ni cấy ba mơi trường PDA, SDA CDA, A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng S aureus MRSA tối ưu mơi trường PDA Tương tự nguồn khoai tây xác định nguồn nitrogen thích hợp cho việc sinh hoạt chất kháng khuẩn Theo Thongwai Kunopakarn năm 2007, phần lớn vi sinh vật có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn pH mơi trường từ 5,5-8,5 Sự sinh hoạt chất sinh học tối đa pH mơi trường PDB Jain Pudir năm 2011 Cả hai kết luận phù hợp với nghiên cứu chúng tơi: A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng S aureus MRSA ni mơi trường PDB khoảng pH từ 5-8, mạnh pH Kết tương tự với cơng bố trước Nishihara cộng năm 2001 với q trình sinh FR198248, chất kháng virus cúm A terreus sản sinh, thích hợp pH từ 6,3-6,4 Trong 23 mơi trường thử nghiệm với nguồn nitrogen carbon khác nhau, A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu phát triển mơi trường có nguồn nitrogen khoai tây nguồn carbon rỉ đường saccharose Khi phát triển mơi trường có nguồn nitrogen khác dịch đậu nành, cao thịt, cao nấm men, A terreus khơng sinh hoạt chất kháng khuẩn Kết hồn tồn phù hợp với nghiên cứu trước Jain P.1 Pundir năm 2011 chủng A terreus phân lập từ đất; nhiên ngược hồn tồn với nghiên cứu Mathan S cộng năm 2013 Ở nghiên cứu Mathan S cộng sự, chủng A terreus KC 582297 cho sinh khối chất kháng khuẩn tối ưu phát triển mơi trường có nguồn nitrogen cao nấm men Ở nghiên cứu chúng tơi, chủng A terreus R-TN3 khơng sinh hoạt chất kháng khuẩn mơi trường có nguồn nitrogen cao nấm men Sự khác biệt liên quan đến yếu tố chủng Trên mơi trường có nguồn carbon khác glucose, saccharose, rỉ đường tinh bột tan, A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu mơi trường có nguồn carbon rỉ đường saccharose Tinh bột tan 22 glucose khơng thích hợp cho q trình sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3 Kết tương tự với nghiên cứu Mathan S cộng năm 2013 chủng A terreus KC 582297 (nguồn carbon tối ưu saccharose, tinh bột) Với nguồn nitrogen khoai tây, nguồn carbon saccharose rỉ đường, mật độ tế bào nấm đầu vào 104 tế bào/ml, xác định quang phổ kế với OD530 nm = 0,1 (1 ml dịch nấm cho 100 ml mơi trường) Sử dụng phần mềm BC Pharsoft dự đốn thành phần mơi trường tối ưu để A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu là: khoai tây 30 %; Rỉ đường 3,28 %; Lượng nấm đầu vào: 104 tế bào/ml; Ủ điều kiện tĩnh ngày Xác định hiệu kháng khuẩn phương pháp khuếch tán cho thấy kết thực nghiệm phù hợp với dự đốn phần mềm 3.2.6 Chủng A terreus R-TN3 chất có hoạt tính sinh học Quần thể vi nấm nội sinh thuộc chi Aspergillus phân lập từ nhiều thực vật chứng minh có khả sinh chất có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng tế bào ung thư, Trong nghiên cứu A terreus R-TN3 phân lập từ thân non Riềng (Alpinia chinensis Rosc.) từ khác cho chất có hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa cao Đặc điểm kháng MRSA S aureus phù hợp với nhiều nghiên cứu cơng bố, số chủng A.terreus phân lập từ đất từ thực vật cho phổ kháng số vi khuẩn khác E coli, P aeruginosa, S faecalis Nhiều nghiên cứu xác định nhiều hoạt chất kháng khuẩn, kháng virus terrein, acid terreic, terreinol, terremide A, terremid B, +(-) – butyrolacton I, … Điều cho thấy tiềm nghiên cứu hợp chất kháng khuẩn chủng A.terreus đa dạng cần thiết 3.2.7 Chiết hoạt chất kháng khuẩn từ A terreus R-TN3 Hoạt chất kháng khuẩn từ dịch ni cấy A terreus phân bố tốt EtOAc Điều cho thấy hoạt chất kháng khuẩn từ A terreus R-TN3 tương đối phân cực Ở nghiên cứu Fernando cộng năm 2004, ba hoạt chất kháng khuẩn phân lập từ dịch ni cấy A terreus terrein, acid terreic terreinol tan tốt EtOAc Các hoạt chất kháng khuẩn từ A terreus R-TN3 sinh ngoại bào, chiết từ sinh khối nấm với dung mơi khơng cho tác động kháng khuẩn Q trình tinh dịch chiết thơ từ mơi trường ni cấy A terreus RTN3 tùy thuộc nhiều vào tính chất lý – hóa chất có hoạt tính Cũng theo Fernando cộng sự, sinh hoạt chất kháng khuẩn A terreus thay đổi tùy thuộc vào thời gian thành phần mơi trường ni cấy Trong thí nghiệm chúng tơi, A terreus R-TN3 có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu mơi trường PDB với đường saccharose %, 23 khoai tây 30%, thời gian ủ ngày điều kiện tĩnh Kết tự sinh đồ cho thấy có ba hoạt chất kháng khuẩn Vì vậy, cần khảo sát thêm số điều kiện ni cấy để tìm thêm hoạt chất kháng khuẩn từ A terreus R-TN3 3.2.8 Xác định hoạt tính sinh học hợp chất Y Với việc sử dụng phương pháp tự sinh đồ kết hợp với sắc ký cột, hợp chất Y chứa hoạt chất kháng khuẩn S aureus MRSA với MIC thấp chất CT Sơ phân tích thành phần hóa học phân đoạn cho kết dương tính với phản ứng định tính tinh dầu, courmarin, carotenoid, anthraglycosid Đây tiền đề định hướng quan trọng giúp phân lập xác định cấu trúc hoạt chất kháng khuẩn A terreus R-TN3 sản sinh Phương pháp tự sinh đồ, cho thấy hợp chất Y chứa từ hai hoạt chất kháng khuẩn vết Y1 Y2 3.2.9 Xác định cấu trúc hoạt tính sinh học hợp chất X1 X2 Kết cho thấy hợp chất X1 (Methyl 2-acetyl-5-methoxy-chromon-7carboxylat) hợp chất X2 (Methyl 2-((4-amino-2-bromo-3-methyl-5thioxocyclopenta-1,3-dien-1-yl) oxy)-4-hydroxy-6-methoxybenzoat) có khả ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, thơng qua khả ức chế dòng tế bào: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 ung thư phổi NCI-H460 Trên dòng tế bào Soma, hợp chất khơng gây ức chế tế bào Điều cho thấy khả hợp chất có tính an tồn cao Bên cạnh đó, hai hợp chất chưa cơng bố cơng trình nước giới Nghiên cứu đề tài hồn tồn phù hợp với nghiên cứu trước khả ức chế tế bào ung thư hoạt chất vi nấm A terreus sản sinh Trên giới có nhiều nghiên cứu vai trò ứng dụng hoạt chất sinh học tạo vi nấm nội sinh Các chất chuyển hóa tự nhiên vi nấm nội sinh giúp bảo vệ nguồn tài ngun thiên nhiên đáp ứng u cầu sản xuất dược phẩm từ nguồn gốc thực vật q trình lên men Rất nhiều hoạt chất sinh học tạo vi nấm nội sinh q trình sinh trưởng phát triển Tìm kiếm khám phá hoạt chất đích ngắm mà nhà nghiên cứu sinh dược học khơng ngừng vươn tới 4.1 KẾT LUẬN Các kết nghiên cứu luận án đáp ứng mục tiêu đặt ra, từ chúng tơi đưa số kết luận mặt khoa học ứng dụng sau: Phân lập sàng lọc 21/146 chủng vi nấm nội sinh có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm 18/146 chủng sinh hoạt chất chống oxy hóa Các chủng vi nấm nội sinh sinh hoạt chất sinh học thường đa dạng hình thái hình thức sinh sản Định danh 16/32 chủng vi nấm nội sinh có chủng A terreus sinh hoạt chất sinh học cao Các 24 chủng A terreus có tốc độ phát triển mạnh mơi trường CDA, lại sinh chất có hoạt tính tối ưu mơi trường PDA Chủng A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn cao S.aureus MRSA, chủng phù hợp cho nghiên cứu chun sâu khả sinh hoạt chất kháng khuẩn cao dễ ni cấy loại mơi trường PDA, SDA, CDA Trên 23 loại mơi trường nghiên cứu, chủng A terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng S aureus MRSA tối ưu mơi trường có nguồn nitrogen khoai tây, nguồn carbon rỉ đường/saccharose Đã sử dụng phần mềm BC Pharsoft dự đốn thành phần mơi trường tối ưu để chủng A terreus RTN3 sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn tối ưu rỉ đường 3,28 %; khoai tây 30 %; lượng tế bào nấm ban đầu 104 tế bào/ml; ni cấy tĩnh thời gian ngày pH Đã ni cấy chiết chất chiết thơ có tác động kháng S aureus MRSA chủng A terreus R-TN3 Bằng phương pháp SKLM tự sinh đồ, chiết hợp chất Y có hoạt tính kháng khuẩn Đã xác định giá trị MIC chất Y có hoạt tính kháng S aureus MRSA Chất Y xác định có khả ức chế dòng tế bào ung thư thử nghiệm (ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 ung thư phổi NCI-H460) Đã tách hợp chất tinh khiết X1 X2 có hoạt tính chống oxy hóa cao giải phổ để tìm cấu trúc hợp chất Đây hợp chất chưa cơng bố cơng trình giới Hợp chất X1 X2 có khả ức chế dòng tế bào thử nghiệm (ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư gan Hep G2 ung thư phổi NCI-H460) Hợp chất X1 chứng minh có khả ức chế tế bào ung thư thơng qua khả cảm ứng apoptosis dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 điều kiện khảo sát 4.2 KIẾN NGHỊ Mặc dù kết đạt khả quan cho thấy sở khoa học cho việc ứng dụng hoạt chất sinh học chủng A terreus R-TN3 việc làm kháng sinh, nhiên kết đạt qui mơ nhỏ Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu thêm số vấn đề sau: - Tiến hành nghiên cứu chun sâu chủng A terreus lại tiến hành chiết tách để thu nhận hoạt chất sinh học - Tăng quy mơ ni cấy chủng vi nấm A terreus R-TN3 - Tiến hành ni cấy với lượng lớn để phân lập xác định cấu trúc hoạt chất kháng khuẩn - Tiến hành thử nghiệm độc tính động vật thử nghiệm lâm sàng người chủng 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Tạp chí nước Võ Thị Ngọc Mỹ, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Thị Thùy Vân (2015), “Khảo sát điều kiện ni cấy chủng vi nấm nội sinh phân lập từ bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.)”, Tạp chí Dược học, 472 (55), tr 32-37 Võ Thị Ngọc Mỹ, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Đinh Nga, Lê Thị Thu Trang, Nguyễn Thị Cẩm Dun (2015), “Định danh khảo sát điều kiện ni cấy Aspergillus terreus N-GL1 phân lập từ Nghệ (Curcuma longa L.) Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 476 (55), tr 66-72 Võ Thị Ngọc Mỹ, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Đinh Nga, Phạm Thị Hồng Nhung (2015), “Khảo sát điều kiện ni cấy chủng R-TN3 phân lập từ Riềng (Alpinia chinensia Rosc.)”, Tạp chí Y Học Tp HCM , 19 (3), tr.265-267 Võ Thị Ngọc Mỹ, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Đinh Nga (2015), “Phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa từ số họ Zingiberaceae Rutaceae”, Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ (Đã nhận đăng ngày 25/09/2015) Vo Thi Ngoc My, Nguyen Van Thanh, Nguyen Dinh Nga (2015), “Antibacterial activity of the endophytic fungi isolated from Fortunella japonica (Thunb.) Swingle”, Tạp chí Khoa học kĩ thuật (Đã nhận đăng) Hội nghị nước quốc tế Võ Thị Ngọc Mỹ, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Thị Thùy Vân, “Khảo sát điều kiện ni cấy tối ưu làm tăng khả sinh hoạt chất kháng khuẩn vi nấm nội sinh phân lập từ Bưởi”, Kỷ yếu Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam lần III, 2013, tr 30 Võ Thị Ngọc Mỹ, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Đinh Nga, “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn vi nấm nội sinh phân lập thân Fortunella japonica (Thunb.) Swingle”, Kỷ yếu Hội nghị Nấm học: Nghiên cứu ứng dụng khu vực Phía Nam, 2014, tr 29 Võ Thị Ngọc Mỹ, Nguyễn Văn Thanh, “Khảo sát điều kiện ni cấy tối ưu chủng vi nấm nội sinh phân lập từ Bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.)”, Kỷ yếu Khoa học - Đào tạo, 2014, tập 1, tr 67, Trường ĐH Nguyễn Tất Thành, NXB KHKT Vo Thi Ngoc My, Nguyen Van Thanh, “Identifying and surveying the effect of culture conditions of Aspergillus terreus N-GL1 strain isolated from Curcuma longa L Viet Nam”, The first Aisa Conference on Pharamaceutical Sciences: Asiapharm I “Advances in Pharmaceutical and Biomedical Sciences”, 2016, pp.108, Ton Duc Thang University Đề tài đăng kí Lê Ngọc Thơng, Võ Thị Ngọc Mỹ, “Khảo sát, phân loại, xây dựng vườn tiêu thực vật có dược tính phòng điều trị bệnh gia súc chăn ni thú y”, Đề tài cấp sở, 2012-2014 Võ Thị Ngọc Mỹ, “Nghiên cứu chất kháng khuẩn kháng nấm tạo vi sinh vật nội sinh phân lập từ thuộc họ Rutaceae”, Đề tài cấp trường, 2014-2015 Võ Thị Ngọc Mỹ, “Nghiên cứu chất có hoạt tính sinh học tạo vi nấm nội sinh phân lập từ thuộc họ Zingiberaceae”, Đề tài cấp Bộ GD-ĐT, 2015-2016 ... người công vi c thú vị nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Từ thực luận án: Nghiên cứu phân lập chủng vi nấm nội sinh có khả tạo hợp chất có hoạt tính sinh học từ thuộc họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) ... tính từ trung bình đến mạnh họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) 3.1.3 Kết định danh chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học: Qua trình sàng lọc thử hoạt tính sinh học chủng vi nấm nội. .. tính sinh học Đa số thuộc họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) phân lập có diện vi nấm nội sinh nhiên toàn vi nấm nội sinh có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm chống oxy hóa Trong nghiên