TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CNSH- KTMT BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÀI GIẢNG THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME Hệ đại học TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Lưu hành nội MỤC LỤC BÀI MỞ ĐẦU MỤC ĐÍCH MÔN HỌC CÁC QUI ĐỊNH CHUNG 3 CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM 4 MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME BÀI ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME 11 XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ENZYME SAVINASE 11 MỤC ĐÍCH 11 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT 11 NỘI DUNG 12 BÁO CÁO 14 CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ 14 BÀI TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BROMELINE 15 MỤC ĐÍCH 15 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT 15 NỘI DUNG 17 BÁO CÁO 21 CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ 21 BÀI TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN 22 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON 22 MỤC ĐÍCH 22 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT 22 NỘI DUNG 23 BÁO CÁO 26 CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ 26 BÀI NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE 27 ĐỂ THU NHẬN ENZYME INVERTASE 27 MỤC ĐÍCH 27 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - H A CHẤT- MẪU VẬT 27 NỘI DUNG 28 BÁO CÁO 30 CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ 30 BÀI TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME INVERTASE TÁCH TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE 31 MỤC ĐÍCH 31 Bộ môn Công nghệ sinh học THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT 31 NỘI DUNG 32 BÁO CÁO 35 CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ 35 BÀI SO SÁNH ĐỘNG HỌC ENZYME CỐ ĐỊNH VÀ ENZYME TỰ DO 36 MỤC ĐÍCH 36 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT 36 NỘI DUNG 37 BÁO CÁO 41 CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ 42 TÀI LIỆU MÔN HỌC 43 PHỤ LỤC PHÂN CÔNG CHUẨN BỊ THỰC HÀNH 44 Bộ môn Công nghệ sinh học BÀI MỞ ĐẦU MỤC ĐÍCH MÔN HỌC Sau học xong môn học sinh viên có khả năng: - Chứng minh, củng cố lý thuyết, áp dụng kiến thức vào thực tế - Có kỹ thao tác, sử dụng thiết bị, dụng cụ thí nghiệm - Thực nghiêm túc nội quy phòng thí nghiệm - Hoàn thành thực hành theo thời gian quy định CÁC QUI ĐỊNH CHUNG Sinh viên đọc tóm tắt trước đến lớp Tự soạn để tham khảo lúc làm thí nghiệm Không đem giảng vào (PTN Có phiếu điểm danh theo buổi quên, không mang bị trừ điểm phải viết đơn để giáo viên xác nhận có buổi học Nghỉ phải có đơn xin phép GV dạy xác nhận GV dạy học bù Phải viết báo cáo riêng buổi bù nộp cho GV mà sinh viên đăng ký môn học Viết báo cáo theo tổ, nộp file word cho nhóm trưởng GV nhận báo cáo sau tuần buổi học từ nhóm trưởng qua mail trước 0h buổi Kết thúc môn học tuần nhóm gộp lại thành file gửi lại cho giáo viên Sau in toàn giấy A4 nộp lại (SV cập nhật lại phát lỗi so với gửi cho GV) Địa mail: linhdtm@cntp.edu.vn, hiendt@cntp.edu.vn, tuyendth@cntp.edu.evn SV phải xem kỹ thực hành trước vào PTN Đầu buổi có kiểm tra trắc nghiệm, điền khuyết, câu hỏi nhỏ (Lớp bỏ quỹ trả tiền photo đề buổi kiểm tra) Nếu kiểm tra đầu không đạt phải Sau xin giấy vào lớp phòng Công tác học sinh – Sinh viên với lý không chuẩn bị Rồi bố trí bù buổi thực hành khác Phải có đơn đồng ý GV dạy GV dạy bù SV phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an toàn, dụng cụ, hóa chất kết thí nghiệm cho thực tập SV phải có mặt phòng thí nghiệm (PTN) qui định: Sáng 7h, chiều 12h30 phải có mặt PTN suốt thời gian thực hành Đến trễ 10 phút không vào lớp Mặc áo blouse vào phòng thí nghiệm 10 Mỗi nhóm cử đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ (thiếu, hỏng, bể) báo cáo cho GVHD SV phải rửa dụng cụ trước sau thí nghiệm Kết thúc buổi thực tập nhóm phải lau dọn, làm chỗ nhóm làm thí nghiệm, dụng cụ bị mát, hư hỏng phải báo GVHD mua đền vào buổi học tuần Bộ môn Công nghệ sinh học 11 Mỗi buổi thực hành, nhóm làm theo phân công bảng Nhóm trực nhật có nhiệm vụ: dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nước cửa trước Không hoàn thành nhiệm vụ kết thực hành đạt điểm Công việc Buổi Buổi Buổi Buổi Buổi Buổi Dụng cụ 1,2 Hóa chất 10 3,4 Thiết bị 5,6 Vệ sinh 10 7,8,9,10 12 Nhóm sinh viên làm phúc trình theo yêu cầu bài, nộp cho giáo viên vào buổi thực hành Kết thúc môn có thi kiểm tra theo yêu cầu giáo viên 13 Tiêu chuẩn đánh giá tập – thí nghiệm thực hành - Điểm môn học điểm trung bình cộng - Nhóm trưởng cộng 0,3 điểm thưởng/ điểm tổng kết môn học STT Tiêu chí đánh giá Nội dung Điểm tối đa Nguyên tắc 0.5 điểm Tiến trình thí nghiệm điểm Giải thích thí nghiệm điểm Kết điểm Kết luận - Kiến nghị 0.5 điểm Trả lời câu hỏi cuối điểm An toàn, tổ chức điểm Thời gian điểm Kỹ thao tác điểm CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM Enzyme phân tử sinh học nhạy với thay đổi pH môi trường, nên vấn đề pha sử dụng dung dịch đệm chiết tách Enzyme quan trọng Vì giới hạn chương trình, nên trình bày cách pha sử dụng dung dịch đệm cần thiết 3.1 Định nghĩa pH Giá trị pH dung dịch tính theo công thức: pH = - log aH+ Trong đó: - a H+ biểu thị hoạt động ion có dung dịch tính theo biểu thức: aH = f CH+ - Với: Bộ môn Công nghệ sinh học  CH+ nồng độ H + dung dịch tính theo đơn vị ion gam /l  f hoạt độ H+, f ≥ Khi nồng độ H+ dung dịch tăng f giảm ngược lại nồng độ H+ nhỏ (dung dịch loãng) f = 1, lúc ta có: CH+ = aH+ Vì thế, dung dịch loãng tính pH gần theo công thức: pH = -log CH+ Sự phát triển, diễn tiến nhiều trình hóa học, sinh học, sinh hóa… đòi hỏi phải giá trị pH định không đổi có thay đổi mức độ nhỏ không đáng kể Vì cần phải có dung dịch đệm cho pH 3.2 Định nghĩa dung dịch đệm Dung dịch đệm pH dung dịch chứa chất có tác dụng giữ giá trị pH giới hạn định thêm acid mạnh hay kiềm mạnh vào dung dịch Các dung dịch có tính chất thường dung dịch hỗn hợp cặp acid base liên hợp, ví dụ: CH3COOH CH3COONa, NH4+ NH3, H2PO4- HPO42-… Nhưng phổ biến dung dịch hỗn hợp acid yếu base liên hợp với hay ngược lại Vì tác dụng đệm có hiệu lực lớn phạm vi định tùy thuộc vào chất acid yếu vùng đệm hiệu lực Tính theo công thức: pH = pKa  Trong đó: pKa = - logKa với Ka số phân ly H+ acid nước Vì hỗn hợp đệm có tác dụng thang đo pH Do muốn đệm cho vùng pH rộng phải có dung dịch đệm hỗn hợp nhiều hệ acid base liên hợp Ví dụ, dung dịch đệm gồm CH3COOH CH3COONa có tác dụng tốt khoảng pH = 3,7  5,7 Trong dung dịch đệm gồm NH4+ NH3 lại có tác dụng đệm tốt vùng pH =  11 Với hỗn hợp đệm gồm acid H3PO4 muối thường có tác dụng đệm tốt hai vùng pH, tương ứng với hai số phân ly acid Ka1 Ka2 vùng I có pH =  3,6 vùng II pH =  8,3 3.3 Hiệu ứng pha loãng dung dịch đệm Theo công thức pH dung dịch đệm : pH = pKa – log (Ca/Cb) Ca: nồng độ acid Cb: nồng độ base liên hợp Khi pha loãng, số lần pha loãng nồng độ Ca Cb nên tỷ số Ca/Cb không thay đổi, số điện ly H+ acid hoạt độ ion dung dịch thay đổi Vì pha loãng làm thay đổi pH dung dịch đệm Bộ môn Công nghệ sinh học Sự thay đổi pH gọi hiệu ứng pha loãng dung dịch đệm Hiệu ứng khác loại dung dịch đệm Đặc trưng cho hiệu ứng  pH1/2  pH1/2 giá trị pH thay đổi dung dịch đệm pha loãng gấp đôi nước cất Nếu pha loãng pH dung dịch tăng, ta có hiệu ứng dương Còn pH giảm ta có hiệu ứng âm Ví dụ pha loãng dung dịch đệm ta có  pH1/2 = -0.05, tức pH dung dịch đệm giảm 0.05 đơn vị pH pha loãng gấp đôi 3.4 Cách pha chế dung dịch đệm Các hoá chất sử dụng cho pha dung dịch đệm đòi hỏi phải tinh khiết Nước cất dùng để pha chế phải đun sôi, đuổi hết khí CO2 trước dùng, đồng thời phải đậy kín tránh khí CO2 từ không khí hòa tan vào để nguội Nồng độ đặc trưng dung dịch đệm phải xác, nên hạn chế việc sử dụng dung dịch loãng đậm so với nồng độ đặc trưng gây sai số Các dung dịch đệm sau pha tốt nên sử dụng vòng tháng Có nhiều dung dịch đệm pha với nhiều hóa chất khác nhau, nhiên chiết tách Enzyme, dung dịch đệm sau thường dùng: 3.4.1 Hỗn hợp đệm KCl HCl Để pha chế dung dịch đệm ta cần dung dịch KCl 0,2 M (14.9 g/l) dung dịch HCl 0,2 M (18 ml HCl đặc 36%) Hỗn hợp đệm chứa 25 ml dd KCl 0,2 M x ml HCl 0,2 M theo bảng sau: pH 25oC X ml HCl 0.2 M  pH1/2 1,00 67,00 +0,04 1,10 1,20 1,30 52,80 42,50 33,60 1,40 1,50 1,60 1,70 1,80 1,90 2,00 2,10 2,20 26,60 20,70 16,20 13,00 10,20 8,10 6,50 5,10 3,90 +0,13 +0,27 3.4.2 Hỗn hợp đệm K2HPO4 – HCl Bộ môn Công nghệ sinh học Để pha chế dung dịch đệm ta cần dung dịch K2HPO4 0,1 M (20,42 g/l)và dung dịch HCl 0,1 M (9 ml HCl đặc 36%) Hỗn hợp đệm chứa 50 ml dd K2HPO4 0,1 M X ml HCl 0,1 M theo bảng sau: pH 25oC X ml HCl 0.1 M  pH1/2 2,20 2,30 49,50 45,80 +0,14 2,40 2,50 42,20 38,80 2,60 2,70 35,40 32,10 2,80 2,90 3,00 28,90 25,70 22,30 3,10 3,20 3,30 3,40 3,50 18,80 15,70 12,90 10,40 8,20 3,60 3,70 3,80 3,90 4,00 6,30 4,50 2,90 1,40 1,10 +0,08 +0,09 +0,04 3.4.3 Hỗn hợp đệm K2HPO4- NaOH Để pha chế dung dịch đệm ta cần dung dịch K2HPO4 0,1 M (20,42 g/l) dung dịch NaOH 0,1M (4 gam NaOH/lít) Hỗn hợp đệm chứa 50 ml dd K2HPO4 0,1 M X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau: pH 25oC X ml NaOH 0,1 M  pH1/2 4.10 4.20 4.30 1.30 3.00 4.70 + 0.05 4.40 4.50 4.60 6.60 8.70 11.10 Bộ môn Công nghệ sinh học 4.70 13.60 4.80 4.90 5.00 5.10 16.50 19.40 22.60 25.50 5.20 5.30 28.80 31.60 5.40 5.50 34.10 36.60 5.60 5.70 38.80 40.60 5.80 5.90 42.30 43.70 + 0.06 + 0.06 + 0.14 3.4.4 Hỗn hợp đệm KH2PO4 – NaOH Để pha chế dung dịch đệm ta cần dung dịch KH2PO4 0,1 M (12,61 g/l) dung dịch NaOH 0,1 M (4.00 g/ lít) Hỗn hợp đệm chứa 50 ml dd KH2PO4 0,1 M X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau: pH 25oC X ml NaOH 0.1 M 5,80 5,90 6,00 6,10 6,20 3,60 4,60 5,60 6,80 8,10 6,30 6,40 6,50 6,60 6,70 6,80 6,90 9,70 11,60 13,90 16,40 19,30 22,40 25,90  pH1/2 pH 25oC X ml NaOH 0.1 M +0,07 7,00 7,10 7,20 7,30 7,40 29,10 32,10 34,70 37,00 39,10 7,50 7,60 7,70 7,80 7,90 8,00 40,90 42,40 43,50 44,50 45,30 46,10 +0,05  pH1/2 +0,08 +0,06 MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME Tùy theo đặc tính riêng biệt loại enzyme mà lựa chọn phương pháp làm cho thích hợp Trong trình tinh chế enzyme, trình tự thủ thuật bước thay đổi, song có nguyên tắc chung Bộ môn Công nghệ sinh học  Phá vỡ tế bào Enzyme có tế bào chất sinh vật cấu tử (nhân, lạp thể, ty thể, lysosome ) tế bào Nhưng phân tử enzyme khả qua màng tế bào màng cấu tử Do để chiết rút enzyme nội bào, bước phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa enzyme chuyển chúng vào dung dịch  Tác nhân học Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học nghiền với bột thủy tinh cát thạch anh, đồng hóa thiết bị đồng hóa (homogenizator) Để việc phá vỡ có hiệu mô thực vật, trước nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá cho trương nước (ví dụ mẫu hạt khô) Còn mô động vật gan thận, chiết enzyme người ta cần cắt bỏ mô liên kết  Tác nhân vật lý, hóa học Muốn tách enzyme cấu tử tế bào, người ta phải dùng yếu tố vật lý hóa học khác sóng siêu âm, dung môi hữu (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate ) chất detergent (chất tẩy) Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ cấu tử tế bào quan thường chứa mỡ  Chiết Sau phá vỡ cấu trúc tế bào, enzyme chiết nước cất, dung dịch đệm thích hợp dung dịch muối trung tính Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết rút: - Nhiệt độ: Để tránh hoạt tính chí vô hoạt, cần chiết rút tiến hành kết tủa enzyme nhiệt độ thấp (30C ÷ 50C) Các thao tác phải nhanh - Một số chất điện ly làm tăng trình chiết rút enzyme NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng chúng phụ thuộc vào phương pháp dùng chiết rút Khử màu: Trong trình chiết rút enzyme đối tượng động, thực vật, có trường hợp có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm xác định hoạt độ enzyme Trong trường hợp người ta cho thêm vào chất khử để loại màu Ở mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu Người ta thường loại màu cột nhựa trao đổi ion cách cho dịch enzyme qua cột lắc Khi qua cột, chất màu bị giữ lại enzyme không bị giữ Trong trình phải ý kiểm tra pH Sau loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ enzyme Trong dịch chiết, enzyme có protein cấu trúc, chất cao phân tử - khác polysaccharid, nucleic acid, chất có phân tử nhỏ đường monose, chất lipid, muối khoáng Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác  Kết tủa Bộ môn Công nghệ sinh học - Tất tổ sử dụng ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae giáo viên - cung cấp cấy truyền vào ống thạch nghiêng chuẩn bị Lấy vòng que cấy sinh khối nấm men, cấy zic zac ống thạch nghiêng Ghi tên tổ/nhóm lớn/ngày cấy vào ống nghiệm, sau đem cất lưu nhiệt độ phòng 24  Tiêu chí đánh giá kết tổ (chụp hình báo cáo):  Số ống nhiễm tổng số ống Đường cấy đẹp 3.3 Nhân giống cấp Các tổ sử dụng ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae (GV cung cấp), lấy vòng que cấy cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường Hansen lỏng (môi trường nhân giống cấp 1), khuấy nhẹ Sau nuôi cấy 48 điều kiện phòng 3.4 Nhân sinh khối Các nhóm theo lịch phân công phần phụ lục Lấy giống cấp đưa toàn sinh khối sang bình tam giác 250 chứa 100 ml môi trường Hansen lỏng Sau nuôi cấy lắc 150 vòng/1 phút 300C 72 3.5 Quan sát hình thái nấm men Quan sát vật kính 40: - Lấy phiến kính nhỏ lên giọt thuốc nhuộm (xanh methylen) Giọt thuốc nhuộm không nên to (về sau tràn khỏi lamelle), không nên nhỏ (tạo thành nhiều bọt khí đậy lamelle) - Lấy vòng sinh khối nấm men (từ ống giống GV cung cấp) hòa vào giọt thuốc nhuộm Đặt cạnh lamelle sát vào phía giọt mẫu hạ từ từ lamelle xuống cho giọt mẫu tràn khắp lamelle Nếu tràn dùng giấy lọc thấm bớt - Quan sát vật kính 40 ghi nhận kết Có thể vào mức độ bắt màu đậm nhạt để phân biệt tế bào sống tế bào chết Quan sát vật kính 100: - Dùng que cấy, phết dịch nấm men thành lớp mỏng phiến kính - Làm khô, cố định nhuộm đơn xanh methylen nhuộm vi khuẩn - Quan sát vật kính 100 ghi nhận kết BÁO CÁO Giữ, nhân giống cấp 1, nhân sinh khối có bị nhiễm hay không? (ảnh chụp) Hình thái tế bào nấm men quan sát vật kính 40, 100? (ảnh chụp) Tìm hiểu quy trình rửa tế bào nấm men? CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ Theo yêu cầu chung môn học Bộ môn Công nghệ sinh học 30 BÀI TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME INVERTASE TÁCH TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE MỤC ĐÍCH - Tách chiết thu nhận invertase từ sinh khối Saccharomyces cerevisiae - Xác định hoạt tính invertase thô phương pháp đường khử DNS THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ảng 5.1 Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng thực hành (cho nhóm g m sinh viên A HÓA CHẤT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ Saccharose 20g/lit Ml 100 PTN HCl 0,1N Ml 100 Phenolphtalein 1% Ml 10 Glucose chuẩn 10mg/ml Ml 40 Thuốc thử DNS Ml 300 Nước cất lần lit Giấy nhôm cuộn Cuộn Đệm acetate 0.1M pH=4.5 ml 600 Lấy trước 48h Sinh khối nấm men g 10 SV chuẩn bị QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ STT B DỤNG CỤ STT TÊN DỤNG CỤ Cốc thủy tinh 1000ml Cái Bình định mức 100 Cái Ống nghiệm phi 18 Cái 13 Giá ống nghiệm Cái Phễu thủy tinh Cái Pipet 5ml Cái Pipet 10ml Cái Pipet 1ml Cái Cốc thủy tinh 100ml Cái 10 Bình tia Cái 11 Đũa thuỷ tinh Cái 12 Quả bóp Cái Bộ môn Công nghệ sinh học lớp tổ 31 13 Tam giác 100 Cái 14 Bình tam giác 100ml nút mài Cái Mượn trước 48h C THIẾT BỊ STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT Máy Votex Cái 2 Bếp điện Cái 10 Máy phá tế bào Cái GHI CHÚ Cả lớp sóng siêu âm Máy đo OD Cái Xoong nhôm Cái Kính hiển vi Cái 1 tổ Tủ ấm đức Cái Mượn trước 48h Máy ly tâm Cái Cân phân tích số Cái Phòng thí nghiệm chuẩn bị: Cân 5g DNS vào 300 ml nước cất vào cốc, hòa tan 500C, sau thêm 5ml dung dịch NaOH 4M Cuối cho thêm 150g muối tartrat kép hòa tan hoàn toàn cho vào bình định mức nước cất cho đủ 500ml, chứa bình thủy tinh sẫm màu Chuẩn ml thuốc thử DNS HCl 0.1N với thuốc thử phenolphtalein, hết - ml HCl NỘI DUNG Invertase tên khoa học β-D-fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) loại enzym thủy phân saccharose thành glucose fructose (tỉ lệ mol 1:1) gọi đường nghịch đảo Đường nghịch đảo sử dụng phổ biến công nghiệp nước giải khát bánh Invertase có động thực vật, vi sinh vật (đặc biệt nấm men có khả tổng hợp invertase cao) Saccharomyces vi sinh vật quan tâm nhiều lĩnh vực lên men tạo invertase Invertase Saccharomyces gồm hai loại sau: invertase nội bào có trọng lượng phân tử vào khoảng 135000Da invertase ngoại bào có trọng lượng phân tử vào khoảng 270000Da Phản ứng thủy phân saccharose invertase xúc tác sau: Bộ môn Công nghệ sinh học 32 Invertase Saccharose (đường không khử) H C HOH O OH OH H H OH O  C HOH O H HO OH HOH C OH H Glucose + Fructose (đường khử) H C HOH O OH H HO O C HOH H HO OH H OH + OH HOH C OH H H OH Lượng glucose tạo thành phụ thuộc vào khả phân cắt enzyme Người ta tiến hành định lượng glucose sinh sau thủy phân theo nhiều phương pháp khác phương pháp Willsteate Schudel để biết hoạt độ enzyme (Trang 49Thực tập sinh hóa lớn - Lâm Thị Kim Châu, Trang 30- Thực tập sinh hóa sở - Trần Mỹ Quan) 3.1 Thu sinh khối nấm men (Tổ 1: Làm trước 48 theo phân công phụ lục) - Dịch nấm men nhân sinh khối đem ly tâm lần (4500 vòng/phút) 10 phút, loại dịch trong, thu hồi sinh khối nấm men - Tiếp tục phối trộn sinh khối nấm men với dung dịch nước muối NaCl (0,85%) theo tỉ lệ 1/3 (w/w) Sau đó, tiến hành ly tâm (4500 vòng/phút) 10 phút để thu nhận sinh khối nấm men Rửa nước cất vô trùng theo tỉ lệ 1/3 (w/w) giữ lại sinh khối nấm men Bảo quản sinh khối nấm men 16-200C (ngăn mát tủ lạnh) 3.2 Phá tế bào thu dịch enzyme thô 3.2.1 Phƣơng pháp tự phân (Tổ 1: Làm trước 48 theo phân công phụ lục) Trong trình tự phân nấm men, hệ enzyme tự phân có sẵn tế bào nấm men hoạt hóa Chúng xúc tác phản ứng phân giải chất có thành tế bào nấm men giải phóng enzyme invertase tế bào Cân 1g sinh khối nấm men cho vào dung dịch đệm acetate pH = 5.5 theo tỷ lệ 1/6 (w/w) để thực trình tự phân Để tủ ấm 450C 50 Sau trình tự phân, mẫu ly tâm (5000 vòng/phút) 10 phút để tách bỏ phần không tan, phần dịch lỏng thu chế phẩm invertase thô Sử dụng dịch enzyme để xác định hoạt tính 3.2.2 Phƣơng pháp phá sóng siêu âm Tổ 2: Cân 1g sinh khối nấm men cho vào cốc 100 có chứa nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1/6 (w/w) Dùng sóng siêu âm (tần số ?, thời gian ?) phá vỡ tế bào Sau trình phá tế bào, mẫu ly tâm (5000 vòng/phút) 10 phút để tách bỏ phần không tan, phần dịch lỏng thu chế phẩm invertase thô Sử dụng dịch enzyme để xác định hoạt tính Bộ môn Công nghệ sinh học 33 3.3 Xác định hoạt tính enzyme invertase Nhóm chẵn xác định hoạt tính dịch enzyme tự phân Nhóm lẻ xác định hoạt tính dịch enzyme phá sóng - Hút 4ml dung dịch đệm acetate pH = 4,5; 4,6 ml nước cất 0,4ml dịch chứa enzyme cho vào bình tam giác 100ml - Thêm vào 1ml dung dịch đường Saccharose nồng độ 2% - Lắc đều, để yên cho phản ứng xảy điều kiện phòng 15 phút - Đun cách thủy phút làm lạnh vòi nước → mẫu thủy phân dùng để xác định hàm lƣợng đƣờng glucose phương pháp DNS, từ suy số mol Saccharose bị thủy phân 3.3.1 Định lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp acid dinitrosalicylic (DNS) a Nguyên tắc: Đường khử đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) ketone (-CO) glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; saccharose, trehalose đường khử Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định So màu tiến hành bước sóng 540nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS tính hàm lượng đường khử mẫu nghiên cứu Phương trình phản ứng tạo màu đường khử DNS acid: b Dựng đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng đƣờng - Cho vào ống nghiệm với chất tích bảng sau: Hóa chất Ống Ống Ống Ống Ống Ống Ống mẫu Glucose 1% 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Nước cất 10 9,8 9,6 9,4 9,2 Mẫu thủy phân Nồng độ (%) ? ? ? ? ? ? Hút 1ml từ ống đến ống vào ống nghiệm tương ứng khác, ống mẫu giữ nguyên Thuốc thử DNS (ml) Bộ môn Công nghệ sinh học 34 Dùng giấy nhôm bịt kín đầu ống nghiệm Đặt vào nồi nước sôi phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng OD ( = 540 nm) ? ? ? ? ? ? ? Đo mật độ quang bước sóng 540 nm với ống để chỉnh OD = Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung mật độ quang (OD540nm), trục hoành nồng độ glucose Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y = OD540nm; x = [glucose] (%) hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel Chú ý: tiến hành mẫu dựng đường chuẩn mẫu thí nghiệm đồng thời c Tính kết - Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính X (mg/ml) đường khử dung dịch đường pha lõang - Nhân với hệ số pha lõang n để lượng đường ml dung dịch gốc Chọn hệ số pha lõang n cho OD nằm giới hạn đường chuẩn - Tính hàm lượng đường nguyên liệu (mg/g) = X *n* V/m V = thể tích dịch đường gốc (ml) m = khối lượng mẫu cân (g) Một đơn vị hoạt tính invertase lượng enzyme cần thiết để thủy phân micromol đường Saccharose phút điều kiện pH nhiệt độ 0oC Tính hoạt tính enzyme invertase BÁO CÁO Nêu bước thu nhận dung dịch invertase ? Vẽ đường chuẩn glucose Tính hoạt tính Invertase? CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ Theo yêu cầu chung môn học Bộ môn Công nghệ sinh học 35 BÀI SO SÁNH ĐỘNG HỌC ENZYME CỐ ĐỊNH VÀ ENZYME TỰ DO MỤC ĐÍCH Sau học xong sinh viên có khả năng: - Xác định thông số động học enzyme GOD tự do, cố định - So sánh giá trị Vmax, Km E tự cố định - Nêu ưu, nhược điểm phương pháp sử dụng enzyme cố định tự THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT Dụng cụ, hóa chất, thiết bị sử dụng cho thực hành kê theo bảng 6.1 ảng 6.1 Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng thực hành (cho nhóm g m sinh viên A HÓA CHẤT STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT Nước cất lần lit Đệm acetate pH =5.6 Ml 200 β-D-Glucose G 50 DNS Ml 650 NaOH 0,1N Ml 600 HCl 0,1N Ml 400 Alginate G 100 CaCl2 2% Ml 3000 Bông thấm G 500 G 500 Thếp 12 (NH4)2HPO4 g 0,4 13 MgSO4.7H2O g 0,2 14 Peptone g 10 15 Saccharose g 80 16 KH2PO4 g 0,2 17 NaOH rắn g 40 10 Bông không thấm 11 Giấy pH GHI CHÚ Môi trường nuôi cấy B DỤNG CỤ STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH Phễu thủy tinh Cái Pipet 5ml Cái Cốc 100 Cái Bộ môn Công nghệ sinh học SL/ĐVT GHI CHÚ tổ 36 Bình tia Cái Quả bóp Cái Đũa thủy tinh Cái Bơm kim tiêm cc Cái Muỗn thủy tinh xúc hóa Cái chất Panh kẹp Cái 10 Ống nghiệm 14 11 Ống đong 100 Cái 12 Pipet Cái 12 13 Bình tam giác 100ml Cái 30 Cả nhóm C.THIẾT BỊ STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT Máy quang phổ Cái 2 Cân số Cái Máy ổn nhiệt Cái Máy khuấy từ Cái Máy siêu âm Cái Máy ly tâm Cái Nồi hấp Cái Máy lắc Cái GHI CHÚ Cách pha dung dịch đệm acetate pH 5.6 Pha dung dịch A: Acetatic 0,2M: 11,55 ml CH3COOH đặc định mức tới 1000ml Pha dung dịch B: Natri acetate 0,2M: 16,4g CH3COONa (27,2g CH3COONa.3H2O) hòa tan định mức tới 1000ml Trộn 4,8ml dung dịch A 45,2 ml dung dịch B 50ml đệm acetate pH =5,6 NỘI DUNG Glucose oxidase (GOD, β-D-glucose: oxygen, 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) enzym xúc tác trình oxi hóa β-D-glucose thành acid gluconic với oxi chất nhận điện tử tạo hydro peroxide (H2O2) Là enzym biết đến từ lâu, nhiên gần GOD thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu giới ứng dụng quan trọng thực phẩm lĩnh vực khác y dược, hóa học lâm sàng, công nghệ sinh học công nghiệp dệt Enzym sử dụng sản xuất chất tạo chua thực phẩm, làm trắng bột lòng trắng trứng, bảo quản thực phẩm, làm cảm biến sinh học để xác định hàm lượng đường glucose Enzym thu Bộ môn Công nghệ sinh học 37 nhận từ nguồn vi sinh vật, phổ biến từ Aspergillus niger nấm mốc có khả sinh enzym GOD nội bào ngoại bào Trong thí nghiệm đánh giá khả thu nhận enzym nội bào, hiệu thu enzym cao so với enzym ngoại bào 3.1 Hoạt hóa nấm mốc giống Aspergillus niger Tổ 10: làm theo phân công phụ lục Nấm mốc từ ống giống hoạt hóa môi trường lỏng Thành phần (g/l): (NH4)2HPO4: 0,4 KH2PO4: 0,2 MgSO4.7H2O: 0,2 Peptone: 12 Saccharose: 80 Đun sôi môi trường phút, điều chỉnh pH đến 5,5 HCl 0,1 N Lấy 35 ml môi trường cho vào bình nón 100 ml, trùng 121oC, 30 phút, để nguội đến nhiệt độ môi trường Lấy vòng que cấy từ ống nấm mốc giống cấy vào môi trường Nuôi máy lắc 28-30 oC, 225 vòng/phút, 24 h 3.2 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme GOD Tổ 9: làm theo phân công phụ lục Tiến hành nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme môi trường có thành phần giống với nuôi tăng sinh có bổ sung thêm 40g/l CaCO3 không điều chỉnh pH Chuyền vào môi trường 4,5 ml dịch giống nấm mốc sau tăng sinh Nuôi máy lắc 28-300C, 175 vòng/phút, 72 h 3.3 Siêu âm trích ly enzyme nội bào Tổ 8: Dịch sau nuôi cấy sinh tổng hợp enzym lọc thu sinh khối Cân m (g) sinh khối nấm mốc Bổ sung 30ml đệm acetate pH= 5.6 tiến hành siêu âm tần số 14kHz với chu kỳ, chu kỳ kéo dài phút Ly tâm hỗn hợp sau siêu âm 20 oC, 5200 vòng/phút 15 phút thu phần dịch có chứa enzym nội bào 3.4 Phƣơng pháp cố định Glucose oxidase a Nguyên tắc Việc sử dụng enzyme hòa tan bị giới hạn ức chế sản phẩm cuối cùng, giá trị thành phẩm cao không ổn định, khả tái sử dụng khó thu hồi Vì kỹ thuật cố định enzyme giá thể tạo dạng enzyme cố định (enzyme không hòa tan) quan tâm b Cách tiến hành Tổ - Pha 100ml dung dịch Alginate natri 2% (w/v) (Dung dịch A) Bộ môn Công nghệ sinh học 38 - Lấy 100 ml dịch enzyme sau thu nhận phương pháp phá vỡ tế bào - (Dung dịch B) Trộn dung dịch A B với tỷ lệ 1:1 (v/v) dung dịch C Dung dịch C có 200 ml chia cho 10 tổ Các tổ làm  Nhỏ 20 ml dung dịch C vào cốc có chứa 30ml CaCl2 2% (2g/100ml) để tạo hạt Enzyme cố định (sử dụng bơm tiêm nhỏ độ cao 10-20 cm nhiệt độ phòng) Dung dịch CaCl2 phải khuấy đũa thủy tinh đặt khuấy từ từ để giữ cho hạt gel vừa tạo thành không dính vào Tổng thời gian tạo gel không 1% thời gian hạt ngâm dung dịch CaCl2 để đảm bảo hạt tạo thành thời gian Ngâm hạt E cố định dung dịch CaCl2 2% khoảng 30phút tăng độ bền hạt Khi dung dịch alginate nhỏ vào dung dịch CaCl2, lớp vỏ bao hình thành xung quanh hạt nhờ vào trình tạo liên kết mạng lưới alginate Ca2+  Sau 30 phút vớt hạt E cố định khỏi dung dịch CaCl2 rửa hạt lần nước cất Hạt enzyme cố định có dạng hình cầu với đường kính trung bình 3-4 mm 3.5 Xây dựng đƣờng chuẩn D-glucose Tổ 2: Pha 500ml dung dịch glucose 1% sử dụng để làm thí nghiệm Trong nhóm tổ dựng đường chuẩn (1 chẵn, lẻ) Tiến hành theo bảng sau: Hóa chất Ống Ống Ống Ống Ống Ống Glucose 1(%) (ml) Nước cất 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Nồng độ (%) - Từ ống nghiệm 1- lấy 1ml ống vào ống nghiệm tương ứng khác - Thêm vào ống 3ml thuốc thử DNS - Dùng giấy nhôm bịt kín đầu ống nghiệm - Đặt vào nồi nước sôi phút - Làm lạnh đến nhiệt độ phòng - Đo mật độ quang bước sóng 540 nm với mẫu trắng pha từ ống đối chứng - Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung mật độ quang (OD540nm), trục hoành nồng độ glucose Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y = OD 540nm; x = [glucose] (mg/ml) hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel 3.6 Xác định hoạt độ GOD tự GOD nƣớc rửa Nguyên tắc: Dựa phản ứng tạo màu glucose thuốc thử DNS, cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ glucose phạm vi định Bộ môn Công nghệ sinh học 39 Dựa vào đồ thị đường chuẩn với glucose tinh khiết, ta tính hàm lượng glucose có mẫu phân tích Cường độ màu đo máy quang phổ bước sóng 540 nm Tiến hành Ống nghiệm Đối chứng Enzyme tự Enzyme/ nƣớc rửa Glucose 1% (ml) 1 Đệm acetate pH= 5.6 (ml) 4 0.2 0.2 0.2 GOD (ml) 1 Nước cất (ml) 0 [glucose] (%) Để yên 30 phút 30oC Dừng phản ứng cách đun cách thủy phút Chuyển sang ống nghiệm tương ứng Ống nghiệm Đối chứng Enzyme tự Enzyme/ nước rửa Dung dịch (ml) 1 DNS (ml) 3 ? ? Đun sôi phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng OD 540nm ? ∆OD=ODM-ODKC Lượng glucose (y) Xác định hoạt tính Một đơn vị hoạt độ glucose oxidase lượng enzyme dùng để chuyển hóa µmol glucose thời gian phút điều kiện 30oC pH 5.6 3.7 Xác định thông số động học 3.7.1 Xác định thông số động học enzyme tự Tiến hành thí nghiệm Ống nghiệm Glucose 1% (ml) Đệm acetate pH= 5.6 [glucose] (%) 0.2 0.4 0.6 0.8 GOD 1%(ml) 1ml Để yên phút/370C Dừng phản ứng Bộ môn Công nghệ sinh học Đun cách thủy phút 40 Chuyển sang ống nghiệm tương ứng Ống nghiệm Dung dịch (ml) DNS (ml) Đun sôi ? ? ? phút Nhiệt độ phòng Làm lạnh OD 540nm ? ? ? ∆OD=ODM-ODKC Lượng glucose (y) Tính vận tốc phản ứng Qua tính 1/S 1/V Tính Vmax Km enzyme tự 3.7.1 Xác định thông số động học enzyme cố định Tiến hành thí nghiệm Ống nghiệm Glucose 1% (ml) Đệm acetate pH= 5.6 [glucose] (%) GOD cố định (g) 0.2 0.4 0.6 0.8 ? ? Để yên phút/37 C Dừng phản ứng Ống nghiệm Dung dịch (ml) Đun cách thủy phút Chuyển sang ống nghiệm tương ứng DNS (ml) Đun sôi phút Nhiệt độ phòng Làm lạnh OD 540nm ? ? ? ? ∆OD=ODM-ODKC Lượng glucose (y) BÁO CÁO Tính giá trị Vmax, Km GOD tự cố định So sánh, kết luận thông số động học enzyme tự cố định Sinh viên tự xây dựng phương pháp xác định hoạt độ GOD Bộ môn Công nghệ sinh học 41 CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ Theo yêu cầu chung môn học Đổi đơn vị: 1mg = 3UI, 1ml=103 µg =106 ng Bố trí thí nghiệm Công việc STT Thời gian Nhiệm vụ Hoạt hóa nấm mốc Chuẩn bị trước buổi thực hành Tổ 10 Nuôi cấy sinh tổng hợp GOD Siêu âm trích ly e nội bào Làm buổi thực hành Tổ Lập đường chuẩn Glucose Xác định hoạt độ dịch e thô nước rửa Các tổ làm Tạo thể gel alginate Tổ 7 Cố định e Các tổ làm XĐ thông số động học E cố định Các tổ chẵn XĐ thông số động học E tự Các tổ lẻ Tổ Tổ 1, tổ Các nhóm lấy số liệu chéo để có đủ phần việc để báo cáo Bộ môn Công nghệ sinh học 42 TÀI LIỆU MÔN HỌC Sách, giáo trình [1] Bộ môn CNSH, Bài giảng thực hành công nghệ enzyme, Trường ĐH CNTP TP HCM, 2014 [2] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Công nghệ enyme, Nhà xuất Đại học quốc gia TP.HCM, 2003 Tài liệu tham khảo [3] Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chính, Thực tập lớn sinh hóa, Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, 1997 [4] Phạm Thị Ánh Hồng, 2006, Kỹ thuật hóa sinh, NXB ĐHQGTP HCM [5] Nguyễn Văn Mùi, 1999, Thí nghiệm hóa sinh NXB ĐHQGTP HCM [6] Trần Bích Lam, 2004, Thí nghiệm hóa sinh thực phẩm NXB ĐHQG TP HCM [7] Nguyễn Đức Lượng, 2003, Thí nghiệm CNSH tập , NXB ĐHQGTP HCM [8] Trần Mỹ Quan, 2003, Thực tập hóa sinh sở, NXB ĐHQGTP HCM Bộ môn Công nghệ sinh học 43 PHỤ LỤC PHÂN CÔNG CHUẨN BỊ THỰC HÀNH NHÓM CÔ LINH Bộ môn Công nghệ sinh học 44 ... PHÂN CÔNG CHUẨN BỊ THỰC HÀNH 44 Bộ môn Công nghệ sinh học BÀI MỞ ĐẦU MỤC ĐÍCH MÔN HỌC Sau học xong môn học sinh viên có khả năng: - Chứng minh, củng cố lý thuyết, áp dụng kiến thức vào thực. .. buổi thực tập nhóm phải lau dọn, làm chỗ nhóm làm thí nghiệm, dụng cụ bị mát, hư hỏng phải báo GVHD mua đền vào buổi học tuần Bộ môn Công nghệ sinh học 11 Mỗi buổi thực hành, nhóm làm theo phân công. .. tiến hành với hiệu suất tương đối cao kỹ thuật đại lọc gel, hấp phụ chọn lọc, sắc ký trao đổi ion… Bộ môn Công nghệ sinh học 10 BÀI ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ENZYME