Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các thuốc nguồn gốc dược liệu được sử dụng rộng rãi và phát triển nhanh chóng trong hệ thống y tế. Ngay ở các nước phát triển, thuốc nguồn gốc dược liệu đã được sử dụng rất phổ biến như là một liệu pháp bổ trợ hoặc thay thế (Canada 70%, Úc 48%, Mỹ 42%, Pháp 75%) [148]. Thuốc cổ truyền đã được đưa vào chương trình đào tạo ở các trường đại học từ bậc cử nhân đến tiến sỹ (39 nước, 30% các nước khảo sát) [150]. Ở Việt Nam, thuốc nguồn gốc dược liệu được sử dụng từ lâu đời, nhưng vấn đề tiêu chuẩn hóa từ nguyên liệu ban đầu, bán thành phẩm đến thành phẩm nhằm nâng cao chất lượng và độ ổn định còn chưa được thực hiện triệt để. Phát triển các dạng thuốc hiện đại từ dược liệu cũng còn nhiều vấn đề cần giải quyết. Việc áp dụng các tiến bộ khoa học (công nghệ chiết xuất, bào chế bột cao khô và bào chế thành phẩm) để hiện đại hóa các dạng thuốc này là rất cần thiết, nhằm đảm chất lượng, tác dụng điều trị cũng như các lợi ích trong ứng dụng trên lâm sàng. Suy giảm miễn dịch mắc phải là hậu quả của nhiều quá trình bệnh lý như: Suy dinh dưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau khi dùng các thuốc ức chế hoặc độc với các tế bào của hệ thống miễn dịch, do tia xạ hoặc hoá chất điều trị ung thư, đặc biệt là trong nhiễm HIV/AIDS [13], [17]. Trong các trường hợp bệnh lý trên, ngoài điều trị đặc hiệu để loại trừ tác nhân gây bệnh thì điều trị nhằm nâng đỡ cơ thể, tăng cường miễn dịch là cần thiết. Tuy nhiên, do chi phí điều trị cao, đặc biệt là khi sử dụng thuốc kháng retrovirus trong điều trị HIV/AIDS, nhiều bệnh nhân không có cơ hội tiếp cận, thì việc tìm kiếm các thuốc điều trị bổ sung hoặc thay thế, với giá thành dễ chấp nhận là vấn đề cấp bách và có ý nghĩa thực tiễn cao. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, một số hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có tác dụng ức chế sự nhân lên của HIV [105], [133], kích thích miễn dịch [82], [90] và chống oxy hóa [133], [158], do vậy rất có thể có hiệu quả trong điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV, vì những người này bị tổn thương hệ miễn dịch nghiêm trọng. Mặt khác, tình trạng cân bằng oxy hóa khử gây ảnh hưởng đến các hoạt động của hệ miễn dịch và stress oxy hóa có liên quan đến sự nhân lên của HIV [11]. Các nghiên cứu này đã gợi ý việc sử dụng các chất chiết xuất từ dược liệu có tác dụng tăng cường miễn dịch hết hợp với chống oxy hóa như một biện pháp trị liệu thay thế hoặc bổ sung trong điều trị các trường hợp suy giảm miễn dịch mắc phải nói chung và HIV/AIDS nói riêng. Quả nhàu và cúc hoa vàng (CHV) là các dược liệu sẵn có ở Việt Nam với trữ lượng lớn, đã được sử dụng từ lâu để làm thuốc. Các nghiên cứu gần đây cho thấy quả nhàu và CHV có nhiều tác dụng sinh học quí như: tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm...Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) được tạo ra bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật, có chất lượng ổn định. Các nghiên cứu bước đầu cho thấy sâm NLSK có một số tác dụng sinh học tương tự với sâm tự nhiên như: tăng lực, tăng quá trình nhận thức và ghi nhớ, chống oxy hóa, bảo vệ gan...Tuy nhiên, các nghiên cứu về chiết xuất, bào chế chế phẩm từ ba dược liệu này còn đơn giản và chưa có chế phẩm thuốc nào bào chế phối hợp từ ba dược liệu này. Do vậy, để góp phần nghiên cứu phát triển một chế phẩm thuốc mới từ quả nhàu, CHV và sâm NLSK (Viên Kaviran) nhằm tăng cường miễn dịch và chống oxy hóa theo hướng hiện đại, an toàn, hiệu quả, thuận tiện khi sử dụng và ứng dụng được vào sản xuất, đề tài: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran” được tiến hành nhằm các mục tiêu sau: 1. Bào chế được bột cao khô định chuẩn của cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối. 2. Bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô định chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối. 3. Đánh giá được độc tính, tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran trên thực nghiệm.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN TRỌNG ĐIỆP NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – NĂM 2017 iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt ký hiệu luận án Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 DƯỢC LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Cây nhàu 1.1.2 Cúc hoa vàng 1.1.3 Sâm Ngọc linh sinh khối 13 1.2 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU VÀ PHUN SẤY 15 1.2.1 Kỹ thuật chiết xuất dược liệu 15 1.2.2 Kỹ thuật phun sấy ứng dụng làm khô dịch chiết dược liệu 29 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 36 2.1.1 Nguyên vật liệu 36 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 36 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 37 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Nghiên cứu bào chế bột cao khô tiêu chuẩn cúc hoa vàng, nhàu sâm Ngọc linh sinh khối 38 2.2.2 Nghiên cứu bào chế, tiêu chuẩn hóa đánh giá độ ổn định viên nang cứng Kaviran 48 2.2.3 Nghiên cứu tính độc tính tác dụng sinh học viên nang cứng Kaviran động vật thực nghiệm 52 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 55 iv Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 KẾT QUẢ BÀO CHẾ BỘT CAO KHÔ TIÊU CHUẨN 56 3.1.1 Kết định tính, định lượng hoạt chất dược liệu 56 3.1.2 Kết bào chế tiêu chuẩn hóa bột cao khô cúc hoa vàng 58 3.1.3 Kết bào chế tiêu chuẩn hóa bột cao khô nhàu 72 3.1.4 Kết chiết xuất, bào chế tiêu chuẩn hóa bột cao khô sâm Ngọc linh sinh khối 89 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÔNG THỨC, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN 97 3.2.1 Xây dựng công thức viên nang Kaviran 97 3.2.2 Kiểm nghiệm xây dựng tiêu chuẩn sở viên nang cứng Kaviran 101 3.2.3 Kết đánh giá độ ổn định viên nang cứng Kaviran 101 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN 101 3.3.1 Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn 101 3.3.2 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa bảo vệ gan viên nang cứng Kaviran 105 Chương BÀN LUẬN 112 4.1 CHIẾT XUẤT, BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘT CAO KHÔ CÚC HOA VÀNG, QUẢ NHÀU VÀ SÂM NGỌC LINH SINH KHỐI 112 4.1.1 Lựa chọn nguyên liệu kiểm định dược liệu đầu vào 112 4.1.2 Điều chế cao cúc hoa vàng, nhàu sâm Ngọc linh sinh khối 113 4.1.3 Bào chế bột cao khô cúc hoa vàng, nhàu sâm Ngọc linh sinh khối phương pháp phun sấy 121 4.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô cúc hoa vàng, nhàu sâm Ngọc linh sinh khối 131 4.2 XÂY DỰNG CÔNG THỨC, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN 133 4.2.1 Xây dựng công thức bào chế 133 4.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở viên nang cứng Kaviran 135 v 4.3 ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN 138 4.3.1 Đánh giá tính an toàn viên nang cứng Kaviran 138 4.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa động vật thực nghiệm viên nang Kaviran 138 4.3.3 Đánh giá tác dụng viên nang Kaviran chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch chiếu tia xạ 141 KẾT LUẬN 146 KIẾN NGHỊ 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ AE Aerosil ALT Alanin Transaminase AST Aspartat Transaminase BC Bạch cầu BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh) CHV Cúc hoa vàng CHV-PS Cao cúc hoa vàng phun sấy CI Carr’s compressibility index (Chỉ số nén) CR Chất rắn 10 CR/DP Chất rắn/ dịch phun (Tỷ lệ chất rắn dịch phun sấy) 11 cs Cộng 12 CT Công thức 13 d Khối lượng riêng (g/ml) 14 DĐVN Dược điển Việt Nam 15 DL Dược liệu 16 DM Dung môi 17 DM/DL Dung môi/ dược liệu 18 DPPH 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazylradical 19 EtOH Ethanol 20 Fla Flavonoid 21 Gy Grey – đơn vị chiếu xạ 22 HH Hỗn hợp 23 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) 24 HS Hiệu suất 25 KLTB Khối lượng trung bình 26 KLCT Khối lượng thể 27 KLLTĐ Khối lượng lách tương đối vii TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ 28 KLƯTĐ Khối lượng ức tương đối 29 MAE Microwave - assisted Extraction (Chiết xuất vi sóng) 30 MD Maltodextrin 31 MDA Malondialdehyd 32 n Số lượng mẫu thử 33 NC Nghiên cứu 34 NLSK Ngọc linh sinh khối 35 Noni-ppt Phần kết tủa ethanol giàu hợp chất polysaccharid dịch chiết nhàu 36 PL Phụ lục 37 QN Quả nhàu 38 SEM Scanning Electron Microscope (Quét hiển vi điện tử) 39 SGMD Suy giảm miễn dịch 40 TD Tá dược 41 TD/CR Tá dược/ chất rắn (Tỷ lệ tá dược so với chất rắn cao dược liệu) 42 TCCS Tiêu chuẩn sở 43 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) 44 TNJ Tahitian noni juice (Nước ép nhàu) 45 V Thể tích 46 Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số ứng dụng MAE chiết xuất dược liệu 23 2.1 Thành phần công thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 49 3.1 Hàm lượng luteolin apigenin CHV 56 3.2 Hàm lượng scopoletin nhàu 57 3.3 Hàm lượng ginsenosid Rg1 Rb1 sâm NLSK 57 3.4 Hàm lượng flavonoid toàn phần CHV 58 3.5 Ảnh hưởng phương pháp đến chiết xuất flavonoid từ CHV 59 3.6 Ảnh hưởng dung môi đến chiết xuất flavonoid từ CHV 59 3.7 Ảnh hưởng số lần chiết tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất flavonoid từ CHV 60 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61 3.9 Thông số qui trình điều chế dịch chiết CHV 62 3.10 Chiết xuất flavonoid từ CHV qui mô 3kg/mẻ 62 3.11 Kết chiết xuất, cô đặc loại tạp cao CHV 2:1 63 3.12 Thành phần cao CHV dùng để nghiên cứu phun sấy 64 3.13 Công thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao CHV 64 3.14 Ảnh hưởng loại tá dược đến phun sấy cao CHV 64 3.15 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun sấy cao CHV 66 3.16 Ảnh hưởng tỷ lệ tá dược/ chất rắn đến phun sấy cao CHV 67 3.17 Công thức khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tốc độ cấp dịch phun đến phun sấy cao CHV 69 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ, tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao CHV 69 3.19 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao CHV 70 3.20 Ảnh hưởng tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao CHV 71 3.21 Thông số qui trình bào chế bột cao khô CHV phun sấy 72 3.22 Hàm lượng flavonoid toàn phần nhàu 72 ix Bảng Tên bảng Trang 3.23 Ảnh hưởng tỷ lệ DM/DL số lần chiết đến chiết flavonoid từ nhàu 74 3.24 Ảnh hưởng tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất noni-ppt từ nhàu 76 3.25 Kết chiết xuất, cô cao, loại tạp cao nhàu toàn phần 77 3.26 Tỷ lệ chất rắn hàm lượng hoạt chất nhàu cao nhàu 1:1 78 3.27 Thiết kế công thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao nhàu 79 3.28 Ảnh hưởng loại tá dược đến phun sấy cao nhàu 79 3.29 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao nhàu 81 3.30 Ảnh hưởng tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao nhàu 82 3.31 Công thức khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao nhàu 84 3.32 Ảnh hưởng nhiệt độ phun sấy tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao nhàu 84 3.33 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ chất CR/DP đến phun sấy cao nhàu 86 3.34 Ảnh hưởng tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao nhàu 86 3.35 Thông số qui trình bào chế bột cao khô nhàu phun sấy 88 3.36 Thành phần nguyên liệu cao sâm NLSK 89 3.37 Công thức khảo sát ảnh hưởng loại tá dược đến phun sấy cao sâm NLSK 90 3.38 Ảnh hưởng tá dược đến kết phun sấy cao sâm NLSK 90 3.39 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến phun sấy cao sâm NLSK 91 3.40 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phun sấy cao sâm NLSK 92 3.41 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao sâm NLSK 93 3.42 Ảnh hưởng tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao sâm NLSK 93 3.43 Công thức khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao sâm NLSK 95 3.44 Ảnh hưởng tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao sâm NLSK 95 3.45 Thông số qui trình bào chế bột cao khô sâm NLSK phun sấy 96 x Bảng Tên bảng Trang 3.46 Giá trị IC50 hỗn hợp cao cao thành phần 97 3.47 Thành phần công thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 99 3.48 Thành phần công thức cho viên nang cứng Kaviran 100 3.49 Tỷ lệ chuột sống, chết sau 72 uống Kaviran 102 3.50 Ảnh hưởng Kaviran khối lượng thể thỏ 102 3.51 Ảnh hưởng Kaviran điện tim thỏ 103 3.52 Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu tiểu cầu lô thỏ nghiên cứu 103 3.53 Nồng độ AST, ALT, Creatinin Ure lô thỏ 104 3.54 Tóm tắt nhận xét mô bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm 105 3.55 Ảnh hưởng Kaviran lên khối lượng gan tương đối 106 3.56 Ảnh hưởng Kaviran lên hoạt độ AST, ALT huyết nhóm chuột nghiên cứu 106 3.57 Tóm tắt nhận xét đại thể vi thể gan nhóm chuột đánh giá tác dụng bảo vệ gan viên nang cứng Kaviran 107 3.58 Ảnh hưởng Kaviran lên KLƯTĐ KLLTĐ chuột nhắt trắng 108 3.59 Ảnh hưởng Kaviran lên số lượng bạch cầu chuột nhắt trắng 108 3.60 Nhận xét vi thể tuyến lách lô chuột nghiên cứu 109 3.61 Nhận xét vi thể tuyến ức lô chuột nghiên cứu 110 3.62 Nhận xét vi thể hạch lô chuột nghiên cứu 110 3.63 Nhận xét vi thể tủy xương lô chuột nghiên cứu 111 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây nhàu nhàu 1.2 Cúc hoa vàng 1.3 Thiết kế bình chiết sử dụng que siêu âm 18 1.4 Đồ thị biểu diễn trạng thái chất 24 1.5 Sơ đồ cấu tạo thiết bị quy trình phun sấy 29 1.6 Một số kiểu thiết kế đĩa phun ly tâm 31 3.1 Sự phụ thuộc mật độ quang theo nồng độ quercetin 58 3.2 Ảnh hưởng thời gian đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61 3.3 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy với tá dược khác 65 3.4 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy với tỷ lệ TD/CR khác 67 3.5 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy nhiệt độ khác 69 3.6 Ảnh hưởng dung môi đến chiết flavonoid từ nhàu 73 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến chiết flavonoid từ nhàu 75 3.8 Ảnh hưởng thời gian đến chiết flavonoid từ nhàu 75 3.9 Hàm lượng hiệu suất thu hồi scopoletin bột cao khô nhàu phun sấy với tá dược khác 79 3.10 Ảnh SEM bột cao khô nhàu tỷ lệ TD/CR khác 80 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ TD/CR đến hàm lượng hiệu suất thu hồi scopoletin bột cao khô nhàu 82 3.12 Ảnh SEM bột cao khô nhàu tỷ lệ TD/CR khác 82 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ tốc độ cấp dịch đến hàm lượng hiệu suất thu hồi scopoletin bột cao khô nhàu 84 3.14 Ảnh SEM bột cao khô nhàu phun sấy nhiệt độ khác 85 3.15 Hàm lượng hiệu suất thu hồi scopoletin bột cao khô nhàu phun sấy tỷ lệ CR/DP khác 86 3.16 Ảnh SEM bột cao khô nhàu tỷ lệ CR/DP khác 87 3.17 Ảnh hưởng tá dược đến hàm lượng hiệu suất thu hồi ginsenosid bột cao khô sâm NLSK 90 3.18 Ảnh SEM bột cao khô sâm NLSK với tá dược MD/AE (50:50) 91 1.3 Kết định tính ginsenosid sâm NLSK sắc ký lỏng hiệu cao Hình PL1.3 Sắc ký định tính ginsenosid Rg1 Rb1 sâm NLSK săc ký lỏng hiệu cao PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM BỘT CAO KHÔ CÚC HOA VÀNG a Tính chất: Chế phẩm dạng bột khô tơi, màu vàng nhạt đến vàng nâu, đồng nhất, vị đắng, mùi đặc trưng cúc hoa vàng b Độ đồng nhất: Chế phẩm đồng nhất, màu lốm đốm c Hàm ẩm, độ mịn tro toàn phần: Bảng PL2.1 Hàm ẩm, độ mịn tro toàn phần bột cao khô CHV STT Hàm ẩm (%) 4,13 4,37 4,22 4,24 ± 0,12 Tro toàn phần (%) 11,73 12,42 12,35 12,17 ± 0,38 Tỷ lệ bột qua rây 125 (%) 96,52 98,31 98,93 97,92 ± 1,25 Như vậy, chế phẩm dạng bột mịn, hàm ẩm 4,24 ± 0,12% tro toàn phần 12,17 ± 0,38% d Định tính: - Phương pháp SKLM: Sắc ký đồ trình bày hình PL2.1 Hình PL2.1 Sắc ký đồ định tính bột cao khô CHV sắc ký lớp mỏng: (1) mẫu CHV, (2) mẫu bột cao khô CHV Hình PL2.1 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu bột cao khô CHV cho vết có màu sắc với sắc ký đồ mẫu dược liệu CHV Trong có vết rõ với giá trị Rf 0,14, 0,25, 0,48, 0,54, 0,68 0,74 - Phương pháp HPLC: Sắc ký đồ trình bày hình PL2.2 - PL2.5 Hình PL2.2 Sắc ký đồ mẫu dung môi định tính bột cao khô cúc hoa vàng HPLC Hình PL2.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp apigenin luteolin định tính bột cao khô cúc hoa vàng HPLC Hình PL2.4 Sắc ký đồ mẫu bột cao khô cúc hoa vàng định tính HPLC Hình PL2.5 Sắc ký đồ chồng phổ mẫu bột cao khô cúc hoa vàng, mẫu chuẩn hỗn hợp mẫu dung môi định tính HPLC Kết hình PL2.2 đến PL2.5 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất píc luteolin apigenin có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ mẫu chuẩn, khoảng 24,6 34,4 phút e Định lượng luteolin apigenin HPLC: Bảng PL2.2 Hàm lượng luteolin apigenin bột cao khô CHV Mẫu Khối lượng cân (mg) V (ml) 96,3 50 82,6 50 97,8 50 91,7 50 94,5 50 Tên hoạt chất Luteolin Apigenin Luteolin Apigenin Luteolin Apigenin Luteolin Apigenin Luteolin Apigenin Diện tích píc (AU) 1.031.105,64 151.391,38 847.266,20 123.420,72 1.058.922,53 159.503,21 946.327,21 129.517,32 901.748,18 150.368,82 Luteolin Apigenin Hàm lượng (mg/g) 5,945 0,795 5,695 0,756 6,012 0,825 5,730 0,714 5,298 0,805 5,736 ± 0,280 0,779 ± 0,044 Như vậy, bột cao khô CHV chứa luteolin apigenin với hàm lượng 5,736 ± 0,280 mg/g 0,779 ± 0,044 mg/g PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM BỘT CAO KHÔ QUẢ NHÀU a Tính chất: Khối bột khô tơi, màu vàng nâu đến nâu đen, đồng nhất, vị chua, chát, mùi đặc trưng nhàu b Độ đồng nhất: Chế phẩm đồng nhất, màu lốm đốm c Hàm ẩm, độ mịn tro toàn phần: Bảng PL3.1 Hàm ẩm, toàn phần độ mịn bột cao khô nhàu STT TB ± SD Hàm ẩm (%) 4,12 4,03 4,19 4,11 ± 0,08 Tro toàn phần (%) 11,02 11,40 10,51 10,98 ± 0,45 % bột qua rây 125 99,17 98,51 97,45 98,37 ± 0,86 Như vậy, chế phẩm dạng bột mịn, có hàm ẩm 4,11 ± 0,08% tỷ lệ tro toàn phần 10,98 ± 0,45% d Định tính: - Phương pháp SKLM: Hình PL 3.1 Sắc ký đồ định tính bột cao khô nhàu sắc ký lớp mỏng Kết hình PL3.1 cho thấy: Trên sắc ký đồ bột cao khô nhàu xuất vết có màu sắc với mẫu dược liệu, với giá trị Rf 0,48, 0,63, 0,68, 0,78 0,83 Trong có vết to, rõ với giá trị Rf 0,48, 0,63 0,83 - Phương pháp HPLC: Kết trình bày hình PL3.2 Hình PL 3.2 Sắc ký đồ định tính bột cao khô nhàu sắc ký lỏng hiệu cao Kết hình PL3.2 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu bột cao khô nhàu xuất píc scopoletin có thời gian lưu tương ứng với scopoletin mẫu chuẩn (khoảng 6,6 phút) e Định lượng scopoletin HPLC: Bảng PL3.2 Hàm lượng scopoletin bột cao khô nhàu Mẫu Mẫu KL cân (mg) 450,3 Diện tích píc 250.722,06 378,47 Scopoletin (µg/g) Mẫu 423,1 248.063,16 398,45 Mẫu Mẫu 215,5 152,5 124.504,35 85.767,53 392,64 382,22 : 383,78 ± 12,26 Mẫu 138,9 75.034,80 367,13 Như vậy, hàm lượng scopoletin bột cao khô nhàu 383,78 ± 12,26 µg/g, cao gấp 3,41 lần so nhàu (112,52 ± 5,19 µg/g) PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM BỘT CAO KHÔ SÂM NLSK a Tính chất: Khối bột khô tơi, màu vàng nhạt đến vàng nâu, đồng nhất, vị đắng, mùi thơm đặc trưng sâm Ngọc linh sinh khối b Độ đồng nhất: Về mặt cảm quan cho thấy, chế phẩm dạng bột khô, tơi, đồng nhất, màu lốm đốm c Hàm ẩm, độ mịn tro toàn phần: Bảng PL4.1 Hàm ẩm, tro toàn phần độ mịn bột cao khô sâm NLSK STT TB ± SD Hàm ẩm (%) 3,92 4,16 4,07 4,05 ± 0,12 Tro toàn phần (%) 13,69 13,48 13,12 13,43 ± 0,29 % bột qua rây 125 98,29 96,55 97,87 97,57 ± 0,91 Như vậy, chế phẩm dạng bột mịn, có hàm ẩm 4,05 ± 0,12% tỷ lệ tro toàn phần 13,43 ± 0,29% d Định tính: - Kết định tính SKLM (Hình PL4.1): Hình PL4.1 Sắc ký đồ định tính bột cao khô sâm NLSK sắc ký lớp mỏng Hình PL4.1 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất vết có màu sắc với mẫu dược liệu, với giá trị Rf 0,23; 0,44; 0,60; 0,66; 0,81; 0,85 0,90 Trong có vết to, rõ với giá trị Rf 0,23 0,44 - Kết định tính HPLC (Hình PL4.2 đến Hình PL4.4): Hình PL4.2 Sắc ký đồ mẫu dung môi định tính bột cao khô sâm NLSK HPLC Hình PL4.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 định tính bột cao khô sâm NLSK HPLC Hình PL4.4 Sắc ký đồ mẫu thử định tính bột cao khô sâm NLSK HPLC (S16.2) Kết hình PL4.2 đến hình PL4.4 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu bột cao khô sâm NLSK xuất píc ginsenosid Rg1 Rb1 có thời gian lưu tương ứng thời gian lưu ginsenosid Rg1 Rb1 sắc ký đồ mẫu chuẩn (khoảng 11,7 phút 33,9 phút) e Định lượng ginsenosid Rg1 Rb1 HPLC: Bảng PL4.2 Hàm lượng ginsenosid Rg1 Rb1 bột cao khô sâm NLSK Mẫu Rg1 (mg/g) Rb1 (mg/g) Rg1+Rb1 (mg/g) Hàm lượng ginsenosid bột cao khô sâm NLSK 33,78 35,14 34,46 35,80 33,91 35,60 34,78 ± 0,86 32,45 35,58 33,32 35,11 34,00 34,67 34,19 ± 1,17 66,23 70,72 67,78 70,91 67,91 70,27 68,97 ± 1,93 Như vậy, hàm lượng ginsenosid Rg1 Rb1 bột cao khô sâm NLSK 34,78 ± 0,86mg/g 34,19 ± 1,17mg/g Tổng hàm lượng ginsenosid Rg1 Rb1 68,97 ± 1,93mg/g PHỤ LỤC KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN 5.1 Tính chất: Viên nang cứng bên chứa bột thuốc màu vàng nâu, đồng Mùi thơm đặc trưng Vị đắng, 5.2 Độ đồng khối lượng: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.3, phương pháp Kết cho thấy: Khối lượng thuốc đóng nang chênh lệch nằm giới hạn ± 7,5% so với khối lượng trung bình 5.3 Hàm ẩm độ rã viên: Bảng PL5.1 Hàm ẩm độ rã viên Kaviran Chỉ tiêu Hàm ẩm (%) Độ rã (phút) 4,25 6,53 4,38 6,85 4,32 7,28 4,57 6,77 4,43 5,58 4,29 8,18 TB ± SD 4,37 ± 0,12 6,87 ± 0,86 Kết cho thấy: Viên Kaviran có hàm ẩm thấp rã nhanh, tương ứng 4,37 ± 0,12% 6,87 ± 0,86 phút 5.4 Kết định tính: a Phương pháp sắc lý lớp mỏng: - Định tính sâm NLSK: Hình PL5.1 Sắc ký đồ định tính sâm NLSK viên nang Kaviran SKLM Hình PL5.1 cho thấy: Trên sắc ký đồ mỏng mẫu viên nang Kaviran có vết có màu sắc giá trị Rf tương đương với mẫu sâm NLSK, là: 0,22; 0,46; 0,60; 0,63; 0,82; 0,86 0,92 Trong có vết to đậm có giá trị Rf 0,22 0,46 - Định tính cúc hoa vàng: Hình PL5.2 Sắc ký đồ định tính CHV viên nang Kaviran SKLM (1: CHV; 2: bột cao khô CHV; 3: viên nang Kaviran) Hình PL5.2 cho thấy: Trên sắc ký đồ mỏng mẫu viên nang Kaviran có vết có màu sắc giá trị Rf tương đương với mẫu CHV bột cao khô CHV, là: 0,14, 0,25, 0,48, 0,54, 0,69 0,74 - Định tính nhàu: Hình PL5.3 Sắc ký đồ định tính nhàu viên nang Kaviran SKLM Hình PL5.3 cho thấy: Trên sắc ký đồ mỏng mẫu viên nang Kaviran có vết có màu sắc giá trị Rf tương đương với mẫu nhàu bột cao khô nhàu, 0,48, 0,63, 0,68, 0,78 0,83 b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao: - Định tính ginsenosid Rg1, Rb1: Hình PL5.4 Sắc ký đồ định tính ginsenosid Rg1 Rb1 viên Kaviran sắc ký lỏng hiệu cao: (A) mẫu viên nang, (B) kết chồng phổ mẫu viên nang mẫu chuẩn Hình PL5.4 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất píc ginsenosid Rg1 Rb1 có thời gian lưu 11,7 34,0 phút Kết phù hợp với kết chồng phổ mẫu viên nang mẫu chuẩn ginsenosid Rg1 Rb1 - Định tính luteolin apigenin: Hình PL5.5 Sắc ký đồ định tính luteolin apigenin viên nang Kaviran Hình PL5.5 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất píc luteolin apigenin có thời gian lưu trùng với thời gian lưu mẫu chuẩn, 22,9 32,1 phút - Định tính scopoletin: Hình PL5.6 Sắc ký đồ định tính scopoletin viên nang Kaviran Hình PL5.6 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất píc scopoletin có thời gian lưu khoảng 6,7 phút, tương ứng với thời gian lưu scopoletin sắc ký đồ mẫu chuẩn 5.5 Kết định lượng: Bảng PL5.2 Hàm lượng luteolin apigenin viên Kaviran Hàm lượng hoạt chất (mg/ viên) viên Kaviran Tên hoạt chất Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu TB ± SD Luteolin 0,835 0,876 0,894 0,835 0,902 0,884 ± 0,032 Apigenin 0,119 0,125 0,132 0,128 0,117 0,126 ± 0,006 Như vậy, viên nang Kaviran chứa luteolin apigenin với hàm lượng 0,884 ± 0,032 mg/viên 0,126 ± 0,006 mg/viên Bảng PL5.3 Hàm lượng ginsenosid Rg1 Rb1 viên Kaviran Tên hoạt chất Hàm lượng hoạt chất (mg/ viên) viên Kaviran Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu TB ± SD Ginsenosid Rg1 2,24 2,46 2,41 2,12 2,31 2,31 ± 0,137 Ginsenosid Rb1 1,95 2,34 2,29 2,28 2,35 2,24 ± 0,167 Ginsenosid Rg1+Rb1 4,19 4,80 4,70 4,40 4,66 4,55 ± 0,250 Như vậy, viên nang Kaviran chứa ginsenosid Rg1 Rb1 2,31 ± 0,137 2,24 ± 0,167mg/viên, tổng cộng 4,55 ± 0,250mg/viên ... 38 2.2.2 Nghiên cứu bào chế, tiêu chuẩn hóa đánh giá độ ổn định viên nang cứng Kaviran 48 2.2.3 Nghiên cứu tính độc tính tác dụng sinh học viên nang cứng Kaviran động vật thực... tiện sử dụng ứng dụng vào sản xuất, đề tài: Nghiên cứu bào chế đánh giá tác dụng sinh học viên nang cứng Kaviran tiến hành nhằm mục tiêu sau: Bào chế bột cao khô định chuẩn cúc hoa vàng, nhàu... GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN 138 4.3.1 Đánh giá tính an toàn viên nang cứng Kaviran 138 4.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan,