ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ LIỄU “BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ GLYPHOSATE VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS” LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ LIỄU “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào đậu tƣơng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Trọng Lương (Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam) GS.TS Phan Tuấn Nghĩa (Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN) Hà Nội – Năm 2014 I MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max (L.) Merr) trồng quan trọng giới có giá trị sử dụng toàn diện hàm lượng protein cao loại hạt thực vật (38-47%), lipid (12,525,0%), glucid (10-15%) Đây nguồn cung cấp protein dầu thực vật chủ lực cho toàn giới Hạt đậu tương chứa gần đầy đủ axit amin isoleucin, leucin, methyonin, phenylalanin, tryptophan, valin Mặc dù bắt đầu tiến hành sản xuất quy mô công nghiệp từ năm 2011 Việt Nam tiếp tục phải nhập phần lớn lượng bột đậu tương Năm 2013, Việt Nam nhập khoảng 2,97 triệu khô đậu tương Trước tình hình Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đặt yêu cầu tăng suất diện tích trồng đậu tương nước Ngày nay, công nghệ gen sử dụng phương pháp đại khắc phục nhiều hạn chế phương pháp chọn giống truyền thống Công nghệ gen cho phép nhà di truyền chọn giống thực vật xác định, thiết kế gen đặc hiệu cho mục tiêu mong muốn chuyển gen vào giống sử dụng nhằm tăng tính chống chịu, tăng suất chất lượng trồng Có nhiều phương pháp chuyển gen sử dụng thành công phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phòng thí nghiệm giới Việt Nam sử dụng nhiều Với ưu điểm tần số biến nạp cao, chuyển gen thu tương đối dễ tốn kém, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens đạt kết nhiều đối tượng thuốc lá, hoa cúc, đậu xanh, lúa nhiều giống trồng khác Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn tiến hành thực đề tài: “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào đậu tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens’’ CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung đậu tƣơng 1.1.1 Nguồn gốc Dựa vào đa dạng hình thái, Fukuda (1993) sau nhiều nhà khoa học khác thống rằng, đậu tương có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc) Từ Trung Quốc, đậu tương lan truyền khắp giới Theo nhà nghiên cứu Nhật Bản, vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu tương đưa vào Triều Tiên sau chuyển sang Nhật Đến kỷ 17, đậu tương nhà thực vật người Đức Engelbert Caemfer đưa Châu Âu đến năm 1954 du nhập vào Mỹ Một số tài liệu cho đậu tương đưa vào trồng nước ta từ thời vua Hùng, đậu tương trồng trước đậu xanh đậu đen 1.1.2 Phân loại Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học Glycine max (L.) Merr Theo khóa phân loại Hymowitz T., C.A Newell vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lượng nhiễm sắc thể, đậu tương thuộc đậu (Fabales), họ đậu (Fabaceae), phân họ Leguminosae, chi Glycine Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 loại trồng mang lại giá trị kinh tế giá trị dinh dưỡng cao 1.1.3 Vai trò đậu tương Cây đậu tương mang lại giá trị toàn diện Theo thống kê, toàn giới có khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương Các sản phẩm tiêu thụ thị trường gồm bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… Trong công nghiệp, đậu tương sử dụng để chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn ngành hàng không, chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu Đậu tương có khả cố định đạm nên sử dụng làm luân canh cải tạo đất hệ thống nông nghiệp Thân đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu tốt hàm lượng nitơ thân chiếm 0,05%, chiếm 0,19% Ngoài đậu tương nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Các phận đậu tương (thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm cao sản phẩm phụ thân tươi nghiền khô làm thức ăn tổng hợp gia súc 1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trình chuyển gen thực vật 1.2.1 Khái quát chung vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn gây bệnh sống đất, có khả xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u vết thương chủ Trong tự nhiên, Agrobacterium tumefaciens chủ yếu công hai mầm, đặc biệt nhóm thực vật có hoa Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u Agrobacterium tumefaciens sinh phát triển mạnh điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin cytokinin) Đó Agrobacterium tumefaciens chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA) sang tế bào thực vật T-DNA điều khiển trình sinh tổng hợp chất Ngoài ra, khối u sinh tổng hợp opine axit amin, đặc biệt dẫn xuất đường Opine vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon nitơ nhờ hoạt động gen chuyển hóa opine plasmid gây khối u thực vật Dạng opine tổng hợp nopanin, octopin, agrocinopin, mannozapin agropin, phụ thuộc vào chủng Agrobacterium tumefaciens Trong đó, octopin nopalin hai dạng opine phổ biến 1.2.2 Ti-plasmid Ti-plasmid phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb, phân tử lượng sấp xỉ 1,2.108 Trong tế bào thực vật chúng tồn đơn vị chép độc lập Tiplasmid chủng Agrobacterium khác có bốn vùng tương đồng: vùng có liên quan đến tái bản, vùng liên quan đến tiếp hợp, vùng gây độc hay gọi vùng vir (virulent region), vùng T-DNA Quá trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến vùng T-DNA vùng vir Vùng T-DNA Vùng T-DNA vùng chuyển vào tế bào thực vật gây nên khối u thực vật Có hai hệ gen tồn T-DNA: - Hệ gen thứ quy định trình sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật auxin cytokinin Khi gen hoạt động dẫn đến phân chia tế bào cách liên tục gây khối u - Hệ gen thứ hai quy định lên trình sinh tổng hợp opine Đây axit amin lạ có nguồn gốc từ arginine không xuất tế bào bình thường T-DNA giới hạn hai bờ phải (right border) bờ trái (left border) Hai bờ có cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ đoạn DNA nằm hai bờ chuyển vào tế bào thực vật Bờ phải bờ trái yếu tố cần thiết cho chuyển DNA Tuy nhiên, trình chuyển T-DNA lại vùng gây độc quy định Vùng gen vir Vùng vir dài 35kb mang gen gây độc Vùng bao gồm gen virA, virB, virC, virD, virE, virG (một số chủng có virF) Trong gen virA, virB, virD, virG cần thiết cho tạo độc tính Hoạt động gen vir giúp T-DNA tách khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào thực vật Sự biểu gen vùng vir trình sinh hoá phức tạp mà tác nhân tác động đến hợp chất phenolic Với đặc tính A.tumafaciens sử dụng vectơ để chuyển gen vào 1.2.3 Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen kỹ thuật đưa hay nhiều gen lạ thiết kế dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ trồng nói riêng sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, ) làm cho gen lạ tồn dạng plasmid tái tổ hợp gắn vào gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen hoạt động tổng hợp nên protein đặc trưng dẫn tới việc xuất đặc tính thể chuyển gen Các bước để tạo thực vật chuyển gen gồm có: chọn lọc phân lập gen, chuyển gen vào tế bào thực vật, nuôi tế bào thực vật mang gen lạ thành hoàn chỉnh Hiện nay, có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật khác sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A tumefaciens phương pháp sử dụng phổ biến Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens xem phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất hai mầm) dựa vào khả chuyển gen tự nhiên loài vi khuẩn đất Agrobacterium 1.2.4 Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các Ti-plasmid chứa gen tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật opine không cần thiết gây khối u cho bị xâm nhiễm nên không dùng trực tiếp làm vector Các enzym giới hạn cắt DNA plasmid nhiều chỗ khác nhau, công nghệ gen lại cần có vị trí cắt cho hoạt động số enzym giới hạn Ngoài ra, gen one dùng làm thị chọc lọc có tính trội, chúng lại làm cản trở trình tái sinh bình thường thực vật Với lí này, Ti-plasmid nghiên cứu cải biến cắt bỏ gen không quan trọng, lắp thêm gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa MCS (multicloning site- trình tự tạo dòng) tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả: vectơ liên hợp, vectơ nhị phân Nhờ vậy, trồng biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả tái sinh phát triển bình thường Vectơ liên hợp (co-integrative vector) Hệ thống vector liên hợp (co-integrative vector) kết liên hợp hai loại plasmid: Ti-plasmid loại trừ vùng gen gây khối u gen tạo hợp chất opine giữ lại vùng vir vùng bờ trái, bờ phải Thay vào gen bị cắt bỏ đoạn tương đồng với đoạn plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid Plasmid trung gian plasmid tách dòng từ vi khuẩn E coli tái sinh Agrobacterium Plasmid có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, gen thị phục vụ việc chọn lọc có đoạn tương đồng Khi cho tương tác hai loại plasmid với chúng liên hợp qua trao đổi chéo hai đoạn tương đồng hình thành nên vector liên hợp Vector liên hợp nằm vi khuẩn A tumefaciens hoạt động theo chế chuyển gen thông thường vi khuẩn đất Do tần số đưa plasmid trung gian từ E coli sang Agrobacterium thấp nên vector sử dụng Vectơ nhị phân (binary vector) Hệ thống vector nhị phân khác với vector liên hợp chúng có hai vector (plasmid) có mặt hoạt động Agrobacterium (1) Vector chuyển gen: Ti-plasmid nhỏ có khả tự chép có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA cắt bỏ hết gen không cần thiết hai trình tự bờ trái bờ phải, gắn thêm đơn vị chép để DNA plasmid vừa tự nhân E coli Agrobacterium, gen chọn lọc, gen thị, vùng có chứa nhiều điểm cắt enzym giới hạn (vùng tạo dòng đa năng) nằm hai trình tự bờ trái bờ phải để chèn gen mong muốn (2) Vector bổ trợ: với vùng T-DNA bờ phải, bờ trái cắt bỏ hoàn toàn, giữ lại vùng vir Khi gen vector bổ trợ hoạt động sản phẩm tác động tới đoạn T-DNA vector chuyển gen dẫn đến chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị chép không bền vững E coli hai vùng hoạt động Tuy nhiên, vector nhị phân có ưu điểm như: không xảy trình tái tổ hợp plasmid, kích thước vector nhỏ Nhờ vậy, hiệu trình chuyển gen từ E coli sang A tumefaciens tăng lên Hiện nay, vector nhị phân sử dụng rộng rãi với nhiều loại thiết kế phù hợp với yêu cầu trình chuyển gen Hệ thống vector pCAMBIA Vector pCAMBIA vector nhị phân có nguồn gốc vector pPZP Đặc điểm chung pCAMBIA: số lượng copy E coli cao, đơn vị chép pVS1 bền vững Agrobacterium, kích thước nhỏ (từ 7-12kb) phụ thuộc vào loại plasmid, chọn lọc vi khuẩn chloramphenicol kanamycin, chọn lọc thực vật hygromycin B kanamycin, gen thị gen gus Hiện hệ thống pCAMBIA đã thiết kế vector khác mang gen thích hợp với đối tượng thực vật, chủng A tumefaciens mục đích sử dụng khác Gồm có: p2300, p2201, p1300, p1301, p1302, p1303, p1304, p1305.1, p1305.2 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp thông qua A.tumefaciens Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp thông qua A.tumefaciens: Ảnh hưởng kiểu gen: hiệu chuyển gen khác kiểu gen loài Nhiều báo cáo, tài liệu chuyển gen đề cập đến ảnh hưởng kiểu gen đến khả chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy in vitro Ảnh hưởng dạng mẫu mô đích: hiệu biến nạp mô khác biểu tiếp nhận gen ngoại lai khác (các mô phân sinh dễ biến nạp hơn) Ở cà chua (giống seeda) mô mầm cho hiệu biến nạp cao gấp lần mô Các dạng mô sử dụng làm mô đích để biến nạp mô sẹo phôi hóa, phôi non hạt hay huyền phù tế bào Mẫu non hay già ảnh hưởng đến khả biến nạp Nếu mẫu non, sức sống dẫn đến tỷ lệ mẫu sống thấp, mẫu già lúc hệ gen thực vật ổn định dẫn đến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn Ảnh hưởng chủng Agrobacterium plasmid: nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A tumefaciens cho thấy chủng vi khuẩn sử dụng hiệu loài mầm LBA4404, C58 bị bất hoạt, EHA101 chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 AGL1 từ EHA101) [33] Dạng Ti-plasmid Agrobacterium có vai trò trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Các nghiên cứu cho thấy, Tiplasmid dạng nopalin có hiệu việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Tiplasmid dạng octopin Nhiệt độ: ảnh hưởng nhiệt độ trình đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển TADN phát loài hai mầm Nhiệt độ thích hợp cho trình chuyển T6 ADN thay đổi dạng mẫu mô biến nạp định Nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen bền vững cần phải đánh giá với dạng mẫu mô đích với chủng Agrobacterium biến nạp Ở loài mầm nhiệt đồng nuôi cấy thường 24250C, số trường hợp 280C Ảnh hưởng nhiệt độ thấp (dưới 230C) đến khả chuyển T-ADN chuyển gen bền vững đánh giá Biểu gen bền vững gen chuyển gen vào mô sẹo tỏi đạt cao 220C Tần số chuyển gen cao nhận phôi ngô non sau biến nạp đồng nuôi cấy 200C so với 230C Ảnh hưởng thành phần môi trường lây nhiễm đồng nuôi cấy: lây nhiễm Agrobacterium cải tiến cách thêm chất cảm ứng acetosyringone vào môi trường nuôi cấy Khi nghiên cứu ảnh hưởng acetosyringone đến hiệu chuyển gen giống lúa DT10 cho thấy nồng độ 400μM hiệu biến nạp cao (45,1%) nồng độ 500μM đạt 16%, thấp (Trần Bích Lan cs, 1998) Gần đây, việc sử dụng LCys bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy cải thiện hiệu suất chuyển gen ngô Ảnh hưởng chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium: chất kháng sinh như: cefotaxim, car, timentin thường sử dụng loại bỏ vi khuẩn sau đồng nuôi cấy nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium Hiện nay, Car sử dụng chủ yếu thí nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium vào ngô lúa nồng độ 100 mg/l Và đậu tương cefotaxim 200mg/l, car 250mg/l Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn: mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế bào thực vật giảm khả tái sinh tế bào sau biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao cần thiết chuyển gen vào loài, mẫu mô khó, tần số chuyển gen cải thiện cách lây nhiễm mật độ vi khuẩn cao sau rửa mẫu bổ sung chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy 1.3 Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate đậu tƣơng 1.3.1 Cơ chế kháng glyphosate Để sản xuất chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần gen kháng mã hóa cho protein, protein làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, thay đổi vị trí tác động thuốc tế bào, làm thuốc không gây hại Thuốc diệt cỏ glyphosate ức chế đặc hiệu enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase (EPSP-synthase) Đây enzyme cần thiết thực vật để tổng hợp amino acid thơm (phenylalanin, tryptophan tyrosin), số vitamin hợp chất có nguồn gốc thứ cấp Enzyme người động vật, glyphosate không độc người Glyphosate phân giải đất nhờ vi sinh vật không để lại sản phẩm độc hại Kháng glyphosate chế khác nhau: + Thứ có biểu mạnh mẽ enzyme EPSP-synthase điều khiển promoter CaMV-35S đồng thời tạo nên enzyme oxidoreductase vi khuẩn Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt với lượng lớn EPSP-synthase tạo nên lượng thuốc lại gây hại biến đổi gen Ở gen cần thiết, gen oxidoreductase thực vật + Một khả thứ hai sử dụng EPSP-synthase vi khuẩn Từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn phân lập thay đổi trình tự amino acid nên enzyme không mẫn cảm với glyphosate sử dụng nhiều trồng thương mại + Thứ ba xuất dạng đột biến EPSP-synthase trồng có khả kháng glyphosate Sự kết hợp glyphosate vào enzyme EPSP-synthase loại hình bình thường làm hoạt tính xúc tác hạn chế di chuyển enzyme vào lục lạp Dạng EPSP*synthase (mã hóa shkG*- dạng đột biến) có hoạt tính thấp với glyphosate thể hoạt tính có mặt thuốc diệt cỏ 1.6.2 Đậu tương chuyển gen kháng glyphosate Hiện nay, trồng chuyển gen kháng glyphosate thường mang vài gen đây: - Gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 mã hoá cho dạng enzym 5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) có khả kháng thuốc diệt cỏ glyphosate - Gen EPSPS cải biên phân lập từ ngô mã hoá cho enzym EPSPS - Gen phân lập từ vi khuẩn đất Achromobacter chủng LBAA mã hoá cho enzym oxy hoá khử glyphosate (GOX) Ở đậu tương, người ta đưa số gen kháng thuốc diệt cỏ, nhiên chuyển gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 biểu tính kháng thuốc diệt cỏ hiệu Giống đậu tương chuyển gen kháng glyphosate mang gen trồng phổ biến nhiều quốc gia giới tên thương mại đậu tương Roundup ready Đây giống đậu tương chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Roundup chứa hoạt chất glyphosate phổ biến Hiện nay, nhà khoa học tập đoàn giống trồng nỗ lực nghiên cứu nhằm phát triển thêm giống đậu tương mang gen kháng thuốc trừ cỏ khác gen EPSPS nỗ lực hầu hết dừng lại việc tạo dòng chuyển gen triển vọng chưa thể tạo sản phẩm thương mại hoá khác thay cho giống Roundup ready mang gen EPSPS CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu thực vật hai giống đậu tương DT2008 giống ĐT26 Các chủng vi khuẩn GV3101, C58C1, LBA4404được lưu giữ Viện Di truyền Nông nghiệp Các chủng chứa vector pCAMBIA2300 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Hóa chất môi trường Các hóa chất sử dụng thí nghiệm: H2O2, BAP, IAA, muối đa lượng, vi lượng, vitamin thuộc môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) B5 (Gambor, 1968) Các chất kháng sinh, chất dẫn dụ acetosyringone (AS) 2.2.2 Các thiết bị thí nghiệm Các máy móc thiết bị thí nghiệm dùng cho nghiên cứu bao gồm: máy khuấy từ, máy ly tâm, máy khuấy trộn vortex, máy quang phổ, máy soi chụp ảnh gel, pipetman loại, máy ly tâm lạnh, điện di DNA, số trang thiết bị khác 2.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Xây dựng quy trình tái sinh giống đậu tương DT2008 ĐT26 Nội dung 2: Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ vào hai giống đậu tương DT2008, ĐT26 nhờ Agrobacterium tumefaciens Nội dung 3: Đánh giá xác định biểu gen chuyển 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu  Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh     Phương pháp lây nhiễm chủng vi khuẩn vào mẫu thực vật Phương pháp tách chiết DNA Phương pháp PCR Phương pháp điện di gel agarose CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xây dựng quy trình tái sinh hai giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26 3.1.1 Ảnh hưởng H2O2 đến khả khử trùng hạt Khử trùng mẫu công đoạn có ý nghĩa định đến kết trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Bảng 3.1 Ảnh hưởng H2O2 đến khả khử trùng hạt giống đậu tương DT2008 giống ĐT26 Giống ĐT26 Giống DT2008 Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu nhiễm chết sống nhiễm chết sống (%) (%) (%) (%) (%) (%) 94 98 10 92 10 90 12 34 64 40 55 35 20 45 40 23 37 10 40 58 46 49 12 75 25 78 22 Nồng độ Thời gian H2O2 (%) (phút) 15 20 Qua bảng số liệu cho thấy sử dụng dung dịch H2O2ở nồng độ 15% thời gian 10 phút 10 thích hợp cho việc khử trùng hạt đậu tương giống DT2008 ĐT26, cho tỷ lệ mẫu sống cao: Với giống DT2008 tỷ lệ mẫu sống đạt 92% giống ĐT26 tỷ lệ mẫu sống đạt 90% 3.1.2 Ảnh hưởng tổ hợp BAP IBA đến khả tạo chồi từ mầm nốt mầm giống đậu tương nghiên cứu BAP cytokinnin tổng hợp nhân tạo, có tác dụng kích thích phân bào tái sinh chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy Sau tuần nuôi cấy với lần cấy chuyển quan sát ghi nhận kết bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP IBA lên khả tạo cụm chồi từ mầm Công thức Giống ĐT26 Giống DT2008 Tỉ lệ tạo Chất Tỉ lệ tạo lƣợng cụm chồi chồi ++ ++ 68 3,4 ++ 71 3,52 ++ 0,1 83 4,89 +++ 86 4,88 +++ 0,1 100 6,22 +++ 100 6,46 ++ 2,5 0,1 100 5,45 + 100 5,72 + 0,2 60 3,13 +++ 62 3,26 +++ 1,5 0,2 76 4,36 +++ 80 4,67 +++ 0,2 100 5,2 ++ 100 5,31 ++ 2,5 0,2 100 4,93 ++ 100 4,98 ++ BAP IBA (mg/l) (mg/l) 0 0,1 1,5 cụm chồi Số chồi/cụm Số chồi/cụm Chất lƣợng chồi +: chồi trung bình, biến dạng ++: chồi khỏe, có màu xanh +++: chồi to khỏe, rộng, có màu xanh đậm Kết bảng 3.2 cho thấy kết hợp BAP với IBA khả tạo cụm chồi số chồi/mẫu giống cao công thức đối chứng (không bổ sung BAP IBA) Trong thí nghiệm chọn công thức có bổ sung kết hợp 0,1 mg/l IBA với mg/l BAP công thức tốt để tạo cụm chồi cho hai giống đậu tương DT2008 ĐT26 3.1.3 Ảnh hưởng GA3 đến khả kéo dài chồi giống đậu tương nghiên cứu 11 Bảng 3.3 Khả kéo dài chồi hai giống đậu tương DT2008 ĐT26 Công Nồng độ GA3 Nồng độ (mg/l) IAA (mg/l) thức Giống DT2008 Giống ĐT26 Chiều cao chồi Chiều cao chồi (cm) (cm) 0,1 0,1 3.2 3.8 0,5 0,1 6,2 7,4 0,1 5,8 6,6 Kết cho thấy, khả kéo dài chồi hai giống đậu tương nghiên cứu môi trường bổ sung GA3 có khác biệt rõ rệt Chiều cao chồi dao động từ 3,2 cm đến 7,4 cm Khả kéo dài chồi hai giống DT2008 ĐT26 thích hợp nồng độ GA3 0,5 mg/l (chiều cao chồi giống DT2008 đạt 6,2 ĐT26 đạt 7,4 cm) Trong đó, giống ĐT26 có khả kéo dài chồi tốt giống DT2008 Ở tất công thức so sánh chiều cao chồi 2giống DT2008 ĐT26 cho thấy ĐT26 có khả kéo dài chồi tốt (chiều cao chồi giống DT2008 3,2; 6,2; 5,8; giống ĐT26 tương ứng 3,8; 7,4; 6,6) Điều chứng tỏ, việc kéo dài chồi yếu tố GA3 đặc điểm giống định Như vậy, từ kết thí nghiệm chọn công thức có bổ sung 0,5 mg/l GA3 0,1 mg/l IAA công thức tối ưu để kéo dài chồi hai giống đậu tương nghiên cứu 3.1.4 Ảnh hưởng α-NAA đến khả hình thành rễ giống đậu tương nghiên cứu α-NAA có tác dụng làm tăng hô hấp tế bào mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất nitơ, tăng khả tiếp nhận sử dụng đường môi trường nuôi cấy Bảng 3.4 Ảnh hưởng α-NAA đến khả rễ giống đậu tương DT2008 Giống Nồng độ Tỷ lệ α-NAA rễ (mg/l) (%) Số rễ TB/cây Chiều Chất dài rễ lƣợng (cm) rễ 12 Đặc điểm hình thái 0,1 47 1,26 2,05 Xấu Thân nhỏ, khoẻ, có 2-3 xanh đậm Thân mập, DT2008 0,5 100 4,15 7,12 Tốt khoẻ, có 2-3 xanh đậm 90 3,22 4,30 Xấu 0,1 45 1,50 2,82 Xấu Thân nhỏ, có 2-3 xanh nhạt Thân nhỏ, có 3-4 xanh nhạt Thân mập, ĐT26 0,5 98 4,36 7,65 Tốt khoẻ, có 3-4 xanh đậm 86 3,45 5,20 Xấu Thân nhỏ, có 3-4 xanh đậm Chất lượng rễ: - Rễ tốt: rễ nhiều, to, có màu trắng, khỏe - Rễ xấu: rễ nhỏ, có màu vàng Từ kết cho thấy, hầu hết giống có khả phát sinh rễ nuôi cấy môi trường có bổ sung α-NAA Tỷ lệ phát sinh rễ tương đối cao nồng độ α-NAA 0,5 mg/l tùy thuộc giống, với giống DT2008 đạt 100%, giống ĐT26 đạt 98% Kết phù hợp với kết nghiên cứu Zhanyuan Zhang cộng (1999) Qua kết thí nghiệm khử trùng, tạo chồi, kéo dài chồi rễ đậu tương tiến hành xây dựng quy trình tái sinh sau: QUY TRÌNH TÁI SINH HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG DT2008 VÀ ĐT26 13 Hạt đậu tƣơng DT2008, ĐT26 Khử trùng H2O215% 10 phút MS-B5+ 0,1 mg/l IBA + mg/1BAP + 100 ml/l nước dừa Tạo cụm chồi MS-B5 + 0,5 mg/l GA3 + 0,1 mg/l IAA Kéo dài chồi MS-B5 + 0,5 mg/l α-NAA Ra rễ Hình 3.5 Sơ đồ quy trình tái sinh hai giống đậu tương DT2008 ĐT26 3.2 Bƣớc đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ vào hai giống đậu tƣơng DT2008 ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.2.1 Xác định chủng vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens phù hợp để chuyển gen CP4EPSPS vào giống đậu tương DT2008, ĐT26 Trong thí nghiệm này, ba chủng vi khuẩn thử nghiệm LBA4404, C58C1 GV3101 Hiệu chuyển gen chủng vi khuẩn xác định dựa vào tần số biểu tạm thời gen gus, kết thu sau: Bảng 3.5 Biểu tạm thời gen gus lây nhiễm chủng Agrobacterium khác với nốt mầm giống đậu tương DT2008 ĐT26 Giống ĐT26 Giống DT2008 CT Chủng Tổng Số mẫu Tần số Tổng Số mẫu Tần số biểu khuẩn số biểu biểu số biểu hiện tạm mẫu gus tạm thời mẫu gus thời (%) 14 (%) GV3101 101 3,96 100 5,0 LBA4404 115 20 17,4 110 18 16,4 C58C1 110 21 19,1 110 20 18,2 Kết thí nghiệm bảng 3.5 cho thấy, số chủng vi khuẩn sử dụng thí nghiệm chủng vi khuẩn C58C1 tỷ lệ biểu tạm thời gen gus giống DT2008 ĐT26 đạt cao (19,1% 18,2%) Như vậy, thí nghiệm chọn chủng C58C1 để lây nhiễm với giống đậu tương DT2008 ĐT26 cho hiệu biến nạp tương đối cao 3.2.2 Ảnh hưởng mật độ dung dịch vi khuẩn (OD600) đến hiệu chuyển gen vào giống DT2008 ĐT26 Bảng 3.6 Kết thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng mật độ dung dịch vi khuẩn (OD600) đến khả biểu gen gus DT2008 ĐT26 Giống ĐT26 Giống DT2008 Tỷ lệ Tỷ lệ sống chết (%) (%) 0,0 86,5 13,5 0,2 84,5 0,4 Tần số Tỷ lệ Tỷ lệ Tần số biểu sống chết tạm thời (%) (%) (%) 0,0 85,3 14,7 0,0 15,5 1,65 82,5 17,5 1,64 84,2 15,8 3,5 84,0 16,0 3,2 0,6 83,4 16,6 18,2 84,6 15,4 17,4 0,8 84,5 15,5 18,9 84,3 15,7 18,6 1,0 81,7 18,3 17,4 82,7 17,3 17,2 1,2 65,3 34,7 4,5 66,4 33,6 4,7 1,4 60,4 39,6 2,2 61,6 38,4 2,1 OD biểu tạm thời (%) Như vậy, từ kết thí nghiệm ta hoàn toàn sử dụng giá trị OD = 0,8 biến nạp vi khuẩn với giống đậu tương DT2008 ĐT26 15 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens đến hiệu chuyển gen giống đậu tương DT2008, ĐT26 Bảng 3.7 Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp giống đậu tương DT2008, ĐT26 ĐT26 Giống DT2008 Thời Tỉ lệ gian sống (%) Tỉ lệ chết (%) Tần số biểu Tỉ lệ tạm sống thời (%) (%) Tỉ lệ chết (%) Tần số biểu tam thời (%) 87,5 12,5 86,5 13,5 30 85 15 5,5 83,7 16,3 5,0 45 83,5 16,5 7,5 82,5 17,5 6,5 60 81,5 18,5 18,7 80 20,0 18,2 90 65,5 34,5 10,5 64,6 35,4 10,5 Quan sát kết bảng 3.7 ta thấy thời gian biến nạp thích hợp với chủng C58C1 dòng đậu tương DT2008 ĐT26 60 phút, tần số biểu tạm thời tốt là18,7% 18,2% 3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian đ ồng nuôi cấy đế n hi ệu chuyển gen vào DT2008 ĐT26 Bảng 3.8 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến biểu tạm thời gen gus Công thức Tần số biểu gen tạm thời (%) Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) Giống DT2008 Giống ĐT26 0 10,0 8,5 12,8 11,4 18,5 18,1 16,1 15,8 16 14,2 13,8 Như vậy, thí nghiệm thời gian đồng nuôi cấy thích hợp ngày, cho tỉ lệ biểu tạm thời gen gus đạt 18,5% giống đậu tương DT2008 18,1% giống đậu tương ĐT26 3.2.5 Ảnh hưởng tổ hợp kháng sinh cefotaxim vancomycin đến hiệu ức chế vi khuẩn Trong quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens điển hình, sau vi khuẩn A tumefaciens sử dụng để chuyển gen ngoại lai vào mô hay tế bào thực vật, vật liệu chuyển gen cần xử lý với loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn Việc sử dụng kết hợp cefotaxim vancomycin giúp cải thiện đáng kể hiệu ức chế vi khuẩn Vì vậy, thí nghiệm sử dụng vancomycin nồng độ 250 mg/l kết hợp với cefotaxim nồng độ khác nhằm cải thiện hiệu ức chế vi khuẩn Kết thí nghiệm thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Hiệu ức chế vi khuẩn A tumefaciens ảnh hưởng tổ hợp kháng sinh cefotaxim vancomycin đến khả tái sinh hai giống ĐT26 DT2008 Nồng độ kháng sinh Vancomycin Cefotaxim Giống ĐT26 Giống DT2008 (mg/l) Tỉ lệ Tỉ lệ Số chồi Tỉ lệ mẫu mẫu tái sinh mẫu tái sinh (chồi/ (%) (%) mẫu) (%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Số chồi tái sinh (chồi/ mẫu) 0 11 1,17 1,17 250 150 45 41 1,32 38 40 1,32 250 200 62 46 1,32 60 44 1,32 250 250 72 49 1,35 71 39 1,35 250 300 81 39 78 32 17 Kết nghiên cứu thu tương đương với kết nghiên cứu Wiebke cs (2006) Như vậy, dựa tất tiêu theo dõi kết luận công thức thí nghiệm sử dụng 250 mg/l cefotaxim 250 mg/l vancomycin cho hiệu ức chế vi khuẩn tốt 3.2.6 Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến sức sống khả tái sinh mẫu mầm giống DT2008 ĐT26 Nồng độ kanamycin sử dụng cho nghiên cứu chọn lọc mô tế bào mang gen thường dao động từ 50-500 mg/l tùy thuộc vào loài thực vật loại mô tế bào sử dụng thí nghiệm Với đậu tương non, Zhang cs (2006) sử dụng nồng độ kanamycin cao 400 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen Cũng đậu tương với vật liệu mầm Muhammad cs (2010) lại sử dụng nồng độkanamycin thấp khoảng từ 20-50 mg/l trình tiến hành chọn lọc Nhằm xác định liều lượng kanamycin thích hợp giúp ức chế hoàn toàn tái sinh mô tế bào đậu tương không mang gen kháng, bố trí thí nghiệm bổ sung kanamycin nồng độ khác vào môi trường tái sinh giống DT2008 ĐT26 Dưới kết thí nghiệm thu sau 40 ngày thí nghiệm Bảng 3.10 Ảnh hưởng kháng sinh kanamycin đến khả tái sinh mẫu mầm giống đậu tương DT2008 ĐT26 Giống ĐT26 Giống DT2008 Công Tỉ lệ thức mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Số chồi trung bình (chồi/mẫu) Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu chết (%) tái sinh (%) Số chồi trung bình (chồi/mẫu) 90 2,22 94 2,27 60 40 1,15 56 44 1,14 96 92 1,13 100 0 100 0 Kết nghiên cứu bảng 3.10 cho thấy, ngưỡng nồng độ kanamycin thích hợp để ức chế phát triển mô không mang gen ngoại lai hai giống đậu tương thí nghiệm 50-75 mg/l Qua thí nghiệm tiến hành, xác minh nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp để chọn lọc mô mang gen 50-75 mg/l Ở khoảng nồng độ này, 96100% mẫu mầm giống đậu tương ĐT26 92-100% mẫu mầm giống đậu tương 18 DT2008 không mang gen kháng khả tái sinh Từ kết đạt đƣợc đƣa quy trình chuyển gen nhƣ sau: Khử trùng hạt Chủng vi khuẩn C58C1 Cho hạt nảy mầm Nuôi lỏng tạo huyền phù Làm tổn thương nốt mầm hạt Cho mẫu đậu tương tiếp xúc với dịch khuẩn với OD600 = 0,8 (lây nhiễm 60 phút) Đồng nuôi cấy môi trường A2 (trong ngày) Khử khuẩn cefotaxim (250 mg/l) vancomycim (250 mg/l) Chọn lọc Kanamycin (50 mg/l) Tạo chồi môi trường MS-B5 + 0,1mg/l IBA + 2mg/l BAP (trong tuần) Kéo dài chồi môi trường MS-B5 +0,5 mg/l α-NAA(trong tuần) Ra rễ môi trường MS-B5 +0,5 mg/l αNAA(trong tuần) 19 Hình 3.12 Sơ đồ quy trình quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS vào hai giống đậu tương DT2008 ĐT26 3.3 Kiểm tra có mặt gen CP4-EPSPS mẫu đậu tƣơng DT2008 ĐT26 biến nạp 3.3.1 Kiểm tra có mặt gen CP4-EPSPS mẫu đậu tương DT2008 biến nạp Hình 3.14 Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome đậu tương DT2008 biến nạp Sau kiểm tra có mẫu có xuất băng có kích thước xấp xỉ 1,5 kb tương đương với đối chứng dương (mẫu ADN plasmid pCAMBIA2300.1) Còn lại 20 mẫu xuất băng kích thước khuếch đại sản phẩm PCR Kết chứng tỏ đậu tương DT2008 tái sinh nhiều khả mang gen CP4-EPSPS 20 mẫu ADN nhân băng sản phẩm, đồng nghĩa với việc cá thể có mẫu ADN không mang gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate (hình 3.14) 3.3.2 Kiểm tra có mặt gen CP4-EPSPS mẫu đậu tương ĐT26 biến nạp 20 Hình 3.15 Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome đậu tương ĐT26 biến nạp Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy tổng số 25 mẫu đậu tương ĐT26 biến nạp sống sót môi trường chọn lọc có mẫu có xuất băng kích thước xấp xỉ 1,5 kb, giống băng kích thước mẫu DNA plasmid pCAMBIA2300.1 mang gen CP4-EPSPS khuếch đại (mẫu đối chứng dương tính) Trong 21 mẫu giống đậu tương ĐT26 biến nạp lại không thấy xuất băng kích thước nào, có nghĩa khuếch đại gen CP4-EPSPS, tương tự mẫu đối chứng âm tính (cây đậu tương không chuyển gen) (hình 3.15) 21 CHƢƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Dựa kết thu từ thí nghiệm, rút kết luận sau: Đã xây dựng quy trình tái sinh đậu tương giống DT2008 ĐT26: sử dụng H2O2 15% thời gian 10 phút để khử trùng mẫu, tạo cụm chồi đậu tương môi trường MS-B5 có bổ sung 0,1mg/l IBA, mg/l BAP, kéo dài chồi môi trường MS-B5 có bổ sung 0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3 Các chồi đậu tương đạt tiêu chuẩn chuyển sang môi trường rễ môi trường MS-B5 có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA Đã xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào giống đậu tương DT2008 ĐT26 cách sử dụng chủng C58C1 có OD = 0,8 lây nhiễm nốt mầm với thời gian lây nhiễm 60 phút, sau lây nhiễm đồng nuôi cấy ngày Mẫu đậu tương khử khuẩn cefotaxim (250 mg/l) vancomycin (250 mg/l), sau cho tái sinh theo quy trình để thu chuyển gen Bằng kĩ thuật PCR xác định mẫu giống DT2008 (trong tổng số 25 mẫu thu sau biến nạp) mẫu đậu tương ĐT26 (trong tổng số 25 mẫu thu sau biến nạp) mang gen CP4-EPSPS, với kích thước xấp xỉ 1,5 kB Đề nghị 1.Tiếp tục tiến hành thí nghiệm bổ sung để xác minh tồn gen kháng thuốc trừ cỏ chuyển gen, đồng thời thực tự thụ chọn lọc để thu chuyển gen đồng hợp tử làm vật liệu ổn định cho thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ cỏ glyphosate Sau thu vật liệu chuyển gen cần tiếp tục đánh khả kháng thuốc trừ cỏ chuyển gen đồng ruộng theo dõi tính ổn định gen chuyển đậu tương chuyển gen CP4-EPSPS 22 ... thực đề tài: Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào đậu tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ’ CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung đậu tƣơng 1.1.1... bao gồm gen virA, virB, virC, virD, virE, virG (một số chủng có virF) Trong gen virA, virB, virD, virG cần thiết cho tạo độc tính Hoạt động gen vir giúp T-DNA tách khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế... HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ LIỄU “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào đậu tƣơng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm