ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Dƣơng Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC Chuyên ngành : Hóa Phân Tích Mã số : 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo, PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực luận luận văn Em xin chân thành cám ơn nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Quỳnh Hoa hỗ trợ em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn GS Peter C Hauser, TS Mai Thanh Đức ThS Bùi Duy Anh thiết kế lắp đặt hỗ trợ trang thiết bị tư vấn kỹ thuật trình thực nghiên cứu Em xin chân thành cám ơn công ty 3SAnalysis cung cấp thiết bị CE-C4D cho nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Hóa Phân tích nói riêng khoa Hóa học nói chung dạy dỗ, bảo động viên em suốt thời gian em học tập trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, anh, chị nghiên cứu sinh, bạn học viên, em sinh viên Bộ môn Hóa phân tích động viên tinh thần, tận tình giúp đỡ em thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015 Học viên Dương Thị Nhàn MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 11 1.1 Tổng quan Salbutamol 11 1.1.1 Giới thiệu chung Salbutamol 11 1.1.2 Vấn đề sử dụng Salbutamol giới 12 1.1.3 Vấn đề sử dụng Salbutamol Việt Nam 13 1.2 Các phƣơng pháp xác định Salbutamol 14 1.2.1 Phương pháp điện hóa 1.2.2 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 1.2.3 Các phương pháp sắc ký 1.2.3.1 Các phương pháp sắc ký lỏng 1.2.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 1.2.4 Các phương pháp điện di mao quản 1.3 Phƣơng pháp xác định Salbutamol CE-C4D 18 1.3.1 Cấu tạo nguyên tắc hoạt động hệ CE 18 1.3.2 Giới thiệu detector đo độ dẫn không tiếp xúc C4D 20 1.3.3 Một số công trình xác định Salbutamol CE 21 1.4 Các phƣơng pháp làm giàu chất phân tích 23 1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 23 1.4.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 24 1.4.2.1 Nguyên tắc chiết pha rắn 25 1.4.2.2 Cơ chế chiết pha rắn 26 1.4.2.3 Các loại cột SPE 28 1.4.2.4 Một số công trình làm giàu Salbutamol chiết pha rắn 29 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32 2.1 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 32 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 32 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Phương pháp phân tích 32 2.2.2 Phương pháp lấy mẫu phân tích 33 2.2.3 Phương pháp xử lý mẫu 33 2.2.4 Quy trình xử lý mẫu nước tiểu phương pháp chiết pha rắn 34 2.2.5 Quy trình xử lý mẫu thịt phương pháp chiết pha rắn 36 2.3 Trang thiết bị hóa chất 37 2.3.1 Các dụng cụ thiết bị sử dụng 37 2.3.2 Hóa chất 39 2.3.2.1 Chất chuẩn 39 2.3.2.2 Hóa chất dung môi 39 2.3.2.3 Chuẩn bị dung dịch hóa chất 39 2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích 40 2.4.1 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 40 2.4.2 Độ lặp lại phương pháp 40 2.4.3 Độ (độ thu hồi) thiết bị, phương pháp 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Đánh giá phƣơng pháp phân tích CE-C4D 42 3.1.1 Xây dựng đường chuẩn cho Salbutamol 42 3.1.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn phát (LOQ) thiết bị 43 3.1.3 Đánh giá độ lặp lại thiết bị 44 3.2 Nghiên cứu, tối ƣu điều kiện chiết pha rắn làm giàu Sabutamol mẫu nƣớc tiểu 45 3.2.1 Khảo sát lựa chọn cột chiết 45 3.2.2 Khảo sát đệm chiết 46 3.2.3 Khảo sát trình rửa tạp 47 3.2.4 Khảo sát dung môi rửa giải 48 3.2.5 Đánh giá phương pháp phân tích Salbutamol mẫu nước tiểu kĩ thuật CE-C4D kết hợp chiết pha rắn 50 3.2.5.1 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp 50 3.2.5.2 Đánh giá độ lặp lại phương pháp 51 3.2.5.3 Đánh giá độ phương pháp 51 3.2.6 Phân tích mẫu thực tế 52 3.3 Nghiên cứu, tối ƣu điều kiện trình chiết pha rắn làm giàu Sabutamol mẫu thịt lợn 53 3.3.1 Chuẩn bị mẫu 53 3.3.2 Khảo sát lựa chọn cột chiết 53 3.3.3 Khảo sát lựa chọn quy trình rửa tạp 54 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích Salbutamol mẫu thịt kĩ thuật CE-C4D 56 3.4.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi 56 3.4.2 Đánh giá độ lặp phương pháp phân tích Salbutamol CE-C4D 57 3.4.3 Kết phân tích mẫu thịt lợn thực tế 57 3.5 Kết phân tích đối chứng với phƣơng pháp LC/MS/MS 58 KẾT LUẬN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Salbutamol 14 Bảng 3.1 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Salbutamol 42 Bảng 3.2 Giới hạn phát Salbutamol xác định phương pháp điện di mao quản CE-C4D 43 Bảng 3.3 Kết xác định độ lặp lại phương pháp CE-C4D định lượng Salbutamol 44 Bảng 3.4 Kết hiệu suất thu hồi loại cột chiết 46 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol 51 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol 52 Bảng 3.7 Kết phân tích hàm lượng Salbutamol 08 mẫu nước tiểu cung cấp .52 Bảng 3.8 Kết hiệu suất thu hồi loại cột chiết 54 Bảng 3.9 Kết hiệu suất thu hồi quy trình rửa tạp .56 Bảng 3.10 Khảo sát đánh giá độ thu hồi 56 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol 57 Bảng 3.12 Kết phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS 58 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo hệ thiết bị phân tích điện di mao quản 19 Hình 2.1 Các bước chiết pha rắn 34 Hình 2.2 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai Việt Nam .38 Hình 3.1 Đường chuẩn Salbutamol 43 Hình 3.2 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng (1) cột C18,(2) cột SCX 3ml (3) cột SCX 6ml .45 Hình 3.3 Điện di đồ so sánh kết phân tích khảo sát đệm chiết (1) đệm photphat pH = 6, (2) đệm axetat pH=5,2 .47 Hình 3.4 Điện di đồ kết khảo sát với quy trình rửa tạp khác (1; 2; 3; tương ứng với quy trình 1; 2; 3; 4) 48 Hình 3.5 Điện di đồ kết khảo sát với quy trình rửa giải (1; 2; tương ứng với quy trình 1; 2; 3) 49 Hình 3.6 Điện di đồ giới hạn phát Salbutamol mẫu nước tiểu .50 Hình 3.7 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng(1) cột C 18 , (2) cột SCX 3ml (3) cột SCX 6ml 54 Hình 3.8 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng dung dịch rửa tạp khác (1; 2; tương ứng với quy trình 1; 2; 3) 55 Hình 3.9 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng dung dịch rửa tạp khác (4; 5; tương ứng với quy trình 4; 5; 6) 55 Hình 3.10 Điện di đồ kết phân tích mẫu thịt thực tế 58 DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ Ace Acetic Arg L- arginin C4D Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện CE Phương pháp điện di mao quản EOF Dòng điện di thẩm thấu GC Sắc ký khí GC-MS Sắc ký khí khối phổ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC-MS Sắc ký lỏng hiệu cao – khối phổ… LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực LC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép với ion hóa khối phổ MeOH Methanol Ppm Parts per million: phần triệu %RSD % độ lệch chuẩn tương đối Sal Salbutamol SD Độ lệch chuẩn UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu LỜI MỞ ĐẦU Sử dụng chất tạo nạc mà phổ biến Salbutamol chăn nuôi vấn đề nóng nước ta Lợn ăn thức ăn có chứa Salbutamol tăng trọng nhanh, tỉ lệ nạc cao, thịt có màu đỏ tươi Tuy nhiên thịt lợn chứa dư lượng Salbutamol gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người tiêu dùng làm tăng huyết áp, tim đập nhanh, nhức đầu, tay chân run, buồn nôn, rối loạn tiêu hóa Mặc dù vậy, số người chăn nuôi thương lái lợi nhuận bất chấp sức khỏe người tiêu dùng, sử dụng Salbutamol chăn nuôi gây hoang mang dư luận, Để đảm bảo sức khỏe cho người dân, lấy lại niềm tin người tiêu dùng vào ngành chăn nuôi lợn đảm bảo tính công cho người chăn nuôi chân chính, việc nghiên cứu phát triển quy trình phân tích, kiểm tra hàm lượng Salbutamol có thức ăn chăn nuôi đối tượng chăn nuôi, thực phẩm cần thiết Việc xác định Salbutamol nước ta chủ yếu thực phòng thí nghiệm phương pháp HPLC với quy trình phân tích phức tạp, giá thành phân tích cao Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) gần biết đến phương pháp phân tích với nhiều ưu điểm, nghiên cứu, ứng dụng để phân tích Salbutamol mẫu thức ăn chăn nuôi [9, 20] Tuy nhiên, mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn phức tạp thường có hàm lượng Salbutamol thấp mà giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp CE-C4D hạn chế nên việc phân tích Salbutamol phương pháp CE-C4D mẫu gặp khó khăn [12, 14] Vì vậy, việc nghiên cứu kỹ thuật làm mẫu làm giàu Salbutamol mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn làm tăng độ nhạy phương pháp, giúp xác định hàm lượng nhỏ Salbutamol mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn phương pháp CE-C4D, góp phần quản lý việc sử dụng Salbutamol chăn nuôi Do lựa chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định Salbutamol mẫu nƣớc tiểu thịt lợn phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc” 10 Với hệ số làm giàu 100 lần, nhận thấy nồng độ 30 ppb mẫu nước tiểu cho tín hiệu Salbutamol quan sát Còn nồng độ 20 ppb không xuất pic Salbutamol Vậy giới hạn phát phương pháp 30 ppb, từ suy giới hạn định lượng phương pháp 100 ppb 3.2.5.2 Đánh giá độ lặp lại phương pháp Để đánh giá độ lặp lại phương pháp tiến hành chiết cột giống mức thêm chuẩn 10 µl sal 100 ppm vào 10 ml nước tiểu trắng, kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol Cột Nồng độ Sal thêm chuẩn (ppb) 100 100 100 Nồng độ Sal thu hồi (ppb) 98,3 97,1 97,5 Hiệu suất thu hồi (%) 98,3 97,1 97,5 CV % 0,63 Từ kết ta thấy hiệu suất thu hồi Salbutamol qua lần chiết tương đương nhau, giá trị CV % nhỏ 5% chứng tỏ độ lặp phương pháp tương đối tốt 3.2.5.3 Đánh giá độ phương pháp Độ yếu tố để đánh giá phương pháp phân tích Độ phương pháp đánh giá qua hiệu suất thu hồi phương pháp phân tích, bao gồm xử lý đo mẫu phân tích Nó cho biết lượng chất bị trình xử lý mẫu Đánh giá hiệu suất thu hồi đánh giá độ tin cậy phương pháp xử lý mẫu lựa chọn Quá trình đánh giá thực mức thêm chuẩn khác mẫu nước tiểu trắng (không chứa Salbutamol) + Mức 1: Thêm 5,0 µl hỗn hợp dung dịch chuẩn 100 ppm vào 10,0 ml mẫu trắng + Mức 2: Thêm 10,0 µl hỗn hợp dung dịch chuẩn 100 ppm vào 10,0 ml mẫu trắng 51 + Mức 3: Thêm 15,0 µl hỗn hợp dung dịch chuẩn 100 ppm vào 10,0 ml mẫu trắng Các mẫu xử lý theo quy trình tối ưu Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol Mức Mức Mức 50,0 100,0 150,0 Nồng độ Sal thu hồi (ppb) 47,8 98,3 146,9 Hiệu suất thu hồi (%) 95,6 98,3 97,9 Nồng độ Sal chuẩn thêm vào (ppb) Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 97,3 Như vậy, phương pháp CE-C4D kết hợp với chiết pha rắn để xử lí mẫu cho độ lặp lại tốt, hiệu suất thu hồi cao 95% giới hạn định luợng nhỏ cỡ ppb hoàn toàn phù hợp để áp dụng vào phân tích số mẫu nước tiểu lợn thực tế 3.2.6 Phân tích mẫu thực tế Chúng tiến hành phân tích số mẫu thực tế lấy vào tháng năm 2014 phân tích vào tháng năm 2015 Kết thu sau: Bảng 3.7 Kết phân tích hàm lượng Salbutamol 08 mẫu nước tiểu lấy theo ngày nuôi với thức ăn bổ sung Salbutamol Ngày lấy mẫu 18/8/14 19/8/14 20/8/14 22/8/14 24/8/14 26/8/14 1/9/14 6/9/14 Nồng độ 0,44 0,32 0,53 0,34 0,37 0,73 1,22 2,23 (ppm) Kết phân tích cho thấy mẫu có Salbutamol với nồng độ từ 0,32– 2,23 ppm Các kết thu không tuyến tính theo thời gian Trong thực tế, nuôi lợn, cho ăn thức ăn có bổ sung Salbutamol vào buổi tối lấy mẫu nước tiểu vào buổi sáng nhiên không kiểm soát số lần 52 lợn đào thải Salbutamol qua nước tiểu đêm Mặt khác, sâu tìm hiểu chế hấp thụ đào thải Salbutamol nên không bình luận kết thu Tuy nhiên, khẳng định, dựa việc xác định Salbutamol mẫu nước tiểu nhận biết lợn có ăn thức ăn chứa Salbutamol không Điều giúp nhà quản lý kiểm soát việc sử dụng Salbutamol thức ăn chăn nuôi lợn nuôi ăn salbutamol 3.3 Nghiên cứu, tối ƣu điều kiện trình chiết pha rắn làm giàu Sabutamol mẫu thịt lợn 3.3.1 Chuẩn bị mẫu - Đồng mẫu: Mẫu thịt (không chứa β –agonist đặc biệt Salbutamol) loại bỏ da, thái nhỏ xay đến đồng máy xay - Cân xác gam mẫu đồng vào ống fancon 15ml cân phân tích - Thêm xác 15 µl Salbutamol 100 ppm - Thêm 10 ml dung dịch đệm photphat (0,1 M) pH = Lắc kỹ máy lắc Vortex phút Ly tâmvới tốc độ 6000 vòng/phút 10 phút máy ly tâm, gạn lấy dịch phía vào ống ly tâm 50 ml khác Quá trình lặp lại lần, gộp dịch thu vào ống ly tâm 50 ml sau chỉnh pH dung dịch NaOH 30% dung dịch H3PO4 đặc Lọc phần dung dịch thu qua giấy lọc, thu dịch lọc vào cốc có mỏ 50 ml, lấy dung dịch thu tiến hành quy trình chiết qua cột 3.3.2 Khảo sát lựa chọn cột chiết Chiết pha rắn nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu xử lý mẫu thịt lợn việc phân tích Salbutamol Dựa kết nghiên cứu với mẫu nước tiểu, tham khảo tài liệu điều kiện sẵn có phòng thí nghiệm, cột chiết pha rắn với chất hấp phụ C18 (Sep-Park Water, Mỹ, 3ml), cột trao đổi cation mạnh (Bond Elut SCX, 3ml) (Bond Elut SCX, 6ml), lựa chọn để nghiên cứu với quy trình quy trình nêu mục 2.2.5: 53 Kết thu minh họa hình 3.7 10mV (3) sal (2) sal (1) 100 200 300 400 500 Thêi gian di chuyÓn (s) Hình 3.7 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng(1) cột C18 , (2) cột SCX ml (3) cột SCX ml Các kết khảo sát ảnh hưởng loại cột chiết tới hiệu suất thu hồi trình chiết thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết hiệu suất thu hồi loại cột chiết Loại cột C18 SCX 3ml SCX 6ml Hiệu suất thu hồi (%) Không có tín hiệu sal 48,01 97,30 Tương tự chiết mẫu nước tiểu, từ bảng số liệu ta thấy sử dụng cột trao đổi cation mạnh SCX 6ml hiệu suất thu hồi chất phân tích tốt nhất, tín hiệu thu đẹp Do lựa chọn cột SCX 6ml dùng để nghiên cứu tiếp luận văn 3.3.3 Khảo sát lựa chọn quy trình rửa tạp Do lượng cation sau qua trình chiết lớn nghiên cứu khảo sát dung dịch rửa tạp để giảm lượng cation Chúng nghiên cứu quy trình rửa tạp sau: Quy trình 1: ml H2O+ ml CH3OH + ml H3PO4 10 mM 54 Quy trình 2: ml H2O+ ml CH3OH Quy trình 3: ml H2O+ ml CH3OH + ml H3PO4 mM Quy trình 4: ml H2O+ ml CH3OH +1 ml H3PO4 10 mM Quy trình 5: ml hỗn hợp axeton /H2O +1 ml H3PO4 10 mM Quy trình 6: ml HCOOH 2%+ ml H2O Kết minh họa hình sau 10mV (3) sal (2) sal (1) sal 100 200 Thêi gian di chuyÓn (s) 300 400 500 Hình 3.8 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng dung dịch rửa tạp khác nhau(1; 2; tương ứng với quy trình 1; 2; 3) 10mV (6) (5) sal (4) sal 100 200 300 400 500 600 Thêi gian di chuyÓn (s) Hình 3.9 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng dung dịch rửa tạp khác nhau(4; 5; tương ứng với quy trình 4; 5; 6) 55 Hiệu suất thu hồi tính quy trình trình bày bảng 3.9: Bảng 3.9 Kết hiệu suất thu hồi quy trình rửa tạp Quy trình Hiệu suất thu hồi 58,40% 98,5% 85,15% 38,9 5% 73,82% Không có tín hiệu sal Từ bảng số liệu ta thấy thay đổi dung dịch rửa tạp đặc biệt dung dịch rửa có thêm thành phần axit photphoric nồng độ khác lượng cation loại bỏ phần lớn, nhiên axit photphoric rửa lượng chất phân tích đáng kể làm cho hiệu suất quy trình giảm đáng kể Vì vậy, lựa chọn quy trình rửa tạp quy trình để đảm bảo lượng chất phân tích thu hồi lớn 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích Salbutamol mẫu thịt kĩ thuật CE-C4D 3.4.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi Chúng tiến hành khảo sát nồng độ thêm chuẩn khác nhau: Mức 1: thêm 10 µl Salbutamol 100 ppm vào gam thịt Mức 2: thêm 15 µl Salbutamol 100 ppm vào gam thịt Mức 3: thêm 20 µl Salbutamol 100 ppm vào gam thịt Kết minh họa Bảng 3.10 Bảng 3.10 Khảo sát đánh giá độ thu hồi Mức Mức Mức Nồng độ Sal chuẩn thêm vào (ppm) 0,50 0,75 1,00 Nồng độ Sal thu hồi (ppm) 0,27 0,74 0,73 Hiệu suất thu hồi (%) 54,0 98,7 73,0 Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 75,2 Từ bảng ta thấy hiệu suất thu hồi mức thêm chuẩn khác khác Với nồng độ thêm chuẩn 0,50 ppm, hiệu suất thu thấp (54,0%) có 56 thể hàm lượng Salbutamol mẫu thấp lượng cation mẫu lại lớn làm tăng cạnh tranh với chất phân tích, dẫn đến giảm hiệu suất thu hồi Đối với mức hàm lượng thêm chuẩn 1,00 ppm, hiệu suất thu hồi đạt 73,0%, thấp so với mức Điều lượng Salbutamol lớn với lượng cation sẵn có mẫu vượt dung lượng hấp thu cột nên hiệu suất thu hồi giảm so với mức 3.4.2 Đánh giá độ lặp phương pháp phân tích Salbutamol CE-C4D Để đánh giá độ lặp phương pháp tiến hành chiết cột giống mức thêm chuẩn 15 µl sal 100 ppm vào gam thịt, kết trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol Cột Nồng độ Sal thêm chuẩn (ppm) 0,75 0,75 0,75 Nồng độ Sal thu hồi (ppm) 0,74 0,53 0,46 Hiệu suất thu hồi (%) 98,70 70,67 61,30 Từ bảng 3.11, ta thấy hiệu suất thu hồi Salbutamol qua lần chiết chênh lệch lớn Như vậy, độ lặp phương pháp chưa tốt nên tiến hành xác định LOD LOQ phương pháp Chính vậy, hướng quan trọng đề tài nghiên cứu, tối ưu quy trình xử lý mẫu thịt để đảm bảo yêu cầu phương pháp phân tích đáp ứng nhu cầu phân tích thực tế 3.4.3 Kết phân tích mẫu thịt lợn thực tế Chúng tiến hành phân tích mẫu thực tế lấy vào tháng năm 2014 phân tích vào tháng năm 2015 thu kết hình sau: 57 10 mV (2) sal (1) sal 100 200 300 400 500 600 Thêi gian di chuyÓn Hình 3.10 Điện di đồ kết phân tích mẫu thịt thực tế (1,2 tương ứng đường mẫu thật đường thêm chuẩn) Kết phân tích cho thấy mẫu có chứa Salbutamol với nồng độ ước tính 116,0 ppb Như trước mắt khẳng định sử dụng phương pháp chiết pha rắn kết hợp với CE-C4D phát có mặt Salbutamol mẫu thịt Đồng thời dựa việc xác định có Salbutamol mẫu thịt hay không, nhận biết lợn có ăn thức ăn chứa Salbutamol không Điều giúp nhà quản lý kiểm soát việc sử dụng Salbutamol thức ăn chăn nuôi lợn nuôi ăn Salbutamol Tuy nhiên phương pháp cần nghiên cứu phát triển để có độ lặp lại độ cao hơn, đáp ứng yêu cầu phân tích đặt thực tế 3.5 Kết phân tích đối chứng với phƣơng pháp LC/MS/MS Việc phân tích đối chứng thực Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I Các kết phân tích trình bày bảng 3.12 Bảng 3.12 Kết phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS Ngày lấy mẫu Nước tiểu 22/8 Nước tiểu 6/9 Thịt 8/9/14 Thịt 10/12/15 CE-C4D (ppb) 340,00 2230,0 116,00 KPH LC/MS/MS (ppb) 403,10 2212,1 104,20 0.2800 Độ lệch (%) 15,600 0,8000 11,300 58 Từ bảng 3.12 ta thấy đô lệch phân tích mẫu nước tiểu mẫu thịt lợn phương pháp CE-C4D so với phương pháp tiêu chuẩn LC/MS/MS dao động từ 0,8 †15,6% Nên kết luận phương pháp CE-C4D có độ cao, áp dụng để phân tích Salbutamol mẫu nước tiểu mẫu thịt lợn cho độ xác, độ tin cậy cao, góp phần giúp nhà quản lý kiểm soát việc sử dụng Salbutamol chăn nuôi 59 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu thực nghiệm, với mục tiêu đặt nghiên cứu kỹ thuật làm mẫu làm giàu Salbutamol đối tượng nước tiểu thịt lợn nhằm làm tăng độ nhạy phương pháp, giúp xác định hàm lượng Salbutamol đối tượng mẫu luận văn đạt số kết sau đây: - Đánh giá quy trình phân tích Salbutamol: Xây dựng đường chuẩn khoảng nồng độ 2,0 † 150 ppm, phương trình hồi quy có hệ số tương quan R2 = 0,9995; giới hạn phát giới hạn định lượng 0,5 ppm 1,7 ppm Các giá trị hệ số biến thiên CV (%) mức nồng độ 15,0; 70,0; 120,0 ppm nhỏ 5,3% - nằm giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn AOAC cho thấy thiết bị phân tích có độ lặp lại tốt - Đã tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu nước tiểu phương pháp chiết pha rắn Phương pháp xử lý mẫu cho độ thu hồi Salbutamol 97,3% Với quy trình này, giới hạn phát đạt mẫu nước tiểu 30 ppb Từ cho thấy phương pháp áp dụng để phân tích mẫu thực tế - Đề tài bước đầu khảo sát đưa quy trình chiết pha rắn cho việc xử lý mẫu thịt Mặc dù độ lặp lại phương pháp thấp, chưa đáp ứng nhu cầu phân tích thực tế mở hướng phát triển phương pháp nhằm phân tích Salbutamol mẫu thịt tương lai - Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng Salbutamol mẫu 08 mẫu nước tiểu Từ kết thu cho thấy quy trình chiết pha rắn kết hợp với phương pháp điện di mao quản nhằm xác định hàm lượng Salbutamol mẫu nước tiểu đáp ứng nhu cầu phân tích thực tế Từ việc xác định Salbutamol mẫu nước tiểu, nhận biết lợn có ăn thức ăn chứa Salbutamol không Điều giúp nhà quản lý kiểm soát việc sử dụng Salbutamol thức ăn chăn nuôi lợn nuôi ăn Salbutamol Đồng thời, phương pháp phát triển để trở thành công cụ hữu hiệu để kiểm tra an toàn vệ sinh 60 thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Tuy nhiên để phân tích Salbutamol mẫu nước tiểu mẫu thịt lợn phương pháp CE – C4D cách xác, ổn định, kinh tế cần tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình làm giàu chiết pha rắn song song nghiên cứu quy trình làm giàu khác đơn giản, kinh tế phương pháp làm giàu trực tiếp cột (làm giàu online) Đây mục tiêu tới nhóm nghiên cứu 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2002) - 54/2002/QĐ-BNN – ngày 20/06/2002 – Một số loại kháng sinh, hóa chất cấm sử dụng sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2012) - 649/BNN-CN – ngày 15/03/2012- Kiểm soát chất cấm chăn nuôi Nguyễn Thị Ánh Hường (2010), Nghiên cứu xác định dạng asen vô nước ngầm phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQGHN Phạm Luận (2005), Cơ sở lý thuyết Sắc kí điện di mao quản hiệu cao, Giáo trình giảng dạy dành cho sinh viên chuyên ngành Hóa Phân tích, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên Hà Nội Phạm Luận, Xử lý mẫu phân tích, Giáo trình giảng dạy dành cho sinh viên chuyên ngành Hóa Phân tích, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2011), Các kỹ thuật phân tích Điện di, Sách chuyên đề cao học, Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2011), Các phương pháp tách sắc ký, Sách chuyên đề cao học, Đại học khoa học Tự nhiên-ĐHQG Hà Nội Tạ Thị Thảo (2010), Bài giảng chuyên đề thống kê hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội Đoàn Thị Tươi, Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, Phạm Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thị Ánh Hường, Mai Thanh Đức (2015), “Xác Định salbutamol ractapamine phương pháp điện di mao quản sử dụng derector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D)”, Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học, Tập 20, Số Tiếng Anh 10 Andy Zhai Agilent Technologies Co.Ltd, “Determination of β2-Agonists in Pork with SPE Cleanup and LC-MS/MS Detertion”, Food Safety 62 11 AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requiremments for method varification, USA 12 ChangYing Guo, Hong Zheng, Li-Gang Deng, Xiao Lu, Shan-Cang Zhao, Jiang-Sheng Mao, Yu-Tao Wang, Guo-Sheng Yang, Hassan Y.Aboul-Enein (2010), “UPLS-ESI-MS-MS Determination of three β2-Agonists in Pork” Chromatography, 72, pp.79-84 13 Chen Huijing, Fan Sai, Miao Hong, Zhao Yunfeng, Wu Yongning (2012), “Simultaneous Detection of Residues of 25β-Agonists and 23β2-Blockers in Animal Foods by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Linear Ion Trap Mass Spectrometry”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, pp 1898−1905 14 Dujuan Zhang, Yanni Teng, Keguang Chen, Sha Liu, Chunmin Wei, Benjie Wang, Guiyan Yuan, Rui Zhang, Xiaoyan Liu and Ruichen Guo (2011), “Determination of β β2-Agonists in Pork Using Agilent SampliQ SCX SolidPhase Extraction Cartridges and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry”, Biomedical Chromatography 15 Fabiana S Felix, Maria S.M Quintino, Alexandre Z Carvalho, Lúcia H.G Coelho, Claudimir L Lago, Lúcio Angnes (2006), “Determination of Salbutamol in syrups by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection (CE-C4D)”,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40, pp 1288–1292.) 16 J Pleadin, A Vulic, N Persi, S Terzic, M Andrisic and I Zarkovic (2013), “Rapid Immunoassay Method for the Determination of Clenbuterol and Salbutamol in Blood”, Journal of Analytical Toxicology, pp.1-5 17 Mukesh Maithani and ranjit singh (2011), “Development and validation of a stability- Indicating HPLC method for the simultaneous determination of salbutamol sulphate and theophylline in pharmaceutical dosage forms”, J Anala Bioanal Techniques, pp.1-5 63 18 Niyazi yilmaz, Sibel a.ozlan, Bengi usluz, uhre senturk and Inci biryol (1998), “Voltammetric Determination of Salbutamol Based on Electrochemical Oxidation at Platinum and Glassy Carbon Electrodes” Tr J of Chemistry, pp 175-182 19 Peter Mikus, Iva Valaskova , Emil Havranek (2005), “Determination of Salbutamol in Pharmaceuticals by Capillary Electrophoresis”, Arch Pharm Chem Life Sci, 338, 498−501 20 Thi Anh Huong Nguyen, Thi Ngoc Mai Pham, Thi Tuoi Doan, Thi Thao Ta, Jorge Sáiz, Thi Quynh Hoa Nguyen, Peter C Hauser, Thanh Duc Mai (2014) “Simple semi-automated portable capillary electrophoresis instrumentwith contactless conductivity detection for the determination of βagonists in pharmaceutical and pig-feed samples.” Journal of Chromatography A, 1360 (2014) 305–311) 21 Tianshu Zhou, Qin Hu, Hui Yu, Yuzhi Fang (2001), “Separation and determination of β -agonists in serum by capillary zone electrophoresis with amperometric detection”, Analytica Chimica Acta , 441, pp 23–28) 22 Tomasz „Sniegocki, Andrzej Posyniak and Jan Zmudzki (2005), “Improved gas chromatography – mass spectrometry method for the determination of clenbuterol and salbutamol in animal urine”, Bull vet Inst Pulawy 49,443-447 23 Weiyu Wang, Yulian Zhang, Jinyan Wang, Xue Shi, Jiannong Ye (2010), “Determination of β-agonists in pig feed, pig urine and pig liver using capillary electrophoresis with electrochemical detection”, Meat Science, 85, pp 302–305.) 24 Wu bugang and Melinda meador (2011), List of veterinary drugs banned for use foof animals, global agricultural information network, Beijing 25 Yung Yang, Noella Rosales-Cỏnrado, Vanesa Gullé-Casla, María Eugenla León-González, Luls Vlcente Pérez-Arrlbas, Luls Marfa Plo-Dfez(2012), “Chiral Determination of Salbutamol, Salmeterol and Atenololby TwoDimensional LC–LC: Application to Urine Samples”, Chromatographia 75, pp.1365-1375 64 26 http://www.cfs.gov.hk/english/multimedia/multimedia_pub/multimedia_pub_fs f_14_01.html 27 http://www.animalpeoplenews.org/anp/2012/02/12/australian-use-of-riskydrug-may-drive-indonesian-cut-in-livestock-imports/ 65 ... Dƣơng Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC Chuyên ngành :... tài Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định Salbutamol mẫu nƣớc tiểu thịt lợn phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc 10 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Salbutamol. .. bơm mẫu đến khâu cho kết cuối trình phân tích điện di mao quản 1.3.2 Giới thiệu detector đo độ dẫn không tiếp xúc C4D Trong phương pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn loại detector ý, có độ