NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ LẠNH VÀ MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TRÊN BAO PHẤN HOA MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) RESEARCH ON THE IMPACTS OF REFRIGERATION AND ENVIRONMENTAL TREATMENT TO THE POSSIBILITY OF THE CALLUS ON THE PEPPER FLOWERS (MOMORDICA CHARANTIA L.) Tóm tắt: Mướp đắng vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu Mục đích báo nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến phát sinh callus từ bao phấn Mướp đắng invitro Bao phấn qua tiền xử lý lạnh (4oC) thời gian ngày cấy môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 2mg/l 2,4-D 2mg/l KIN tạo callus hiệu đạt tỷ lệ phát sinh callus 77.78% Từ khóa: Mướp đắng, tiền xử lý lạnh Abstract: Bitter gourd is one of the most nutritional and medicinal plant In order to establish a more perfect regeneration system from anther culture, the effect of low temperature pretreatment, ayxin and cytokinin on callus induction in anther culture of bitter gourd were investigated Pretreatment at 4°C for day, callus induction rate was the highest Anther on MS medium supplemented with 0.8% agar, pH 5.75 and mg / l 2,4-D and mg / L KIN formed more and better callus (77.78%) Key words : Bitter melon, Pre-pretreated premixes 1 Đặt vấn đề Mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) , loại dây leo hàng năm [12] Cây có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc trồng rộng rãi vùng nhiệt đới khắp giới Philippines, Malaysia, Australia, nước Châu Phi, Tây Á Mỹ La Tinh [17], [21], [10], [9], [8] Tại Việt Nam, trồng hầu hết tỉnh từ đồng đến trung du [4] Theo Trung tâm rau màu châu Á AVRDC năm 2007, tổng diện tích trồng mướp đắng nước ta 12.000 ha, Philppines 12.000 ha, Thái Lan 3.000 ha, Indonesia 8.000 [5] Tại Pakistan mướp đắng sản xuất 9,92 tấn/ha, Trung Quốc 18,9 tấn/ha trung bình nước Châu Á 13,7 tấn/ha (FAOSTAT 2011) [18] Mướp đắng loại rau ăn giàu chất sắt, carbonhydrate, protein,vitamin C, B1, B2, PP, chất khoáng, protit, lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, caroten [20] Từ mướp đắng chế biến thành nhiều ăn khác nhau, ngũ vị người ưa thích (đắng-cay-chua-chát-ngọt) [3] Bên cạnh đó, mướp đắng có tính hàn nên dân gian thường dùng để trị bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sáng mắt, cảm nắng, giảm ho Trong mướp đắng có chất Alkaloid có công dụng lợi tiểu, giúp lưu thông máu tốt, chống viêm, hạ sốt tăng cường sức khỏe thị lực Loại dầu có hạt mướp đắng giàu cis(c) 9, trasn(t) 11 axit linonic t13, Chanrantin, polypeptide-p, vicine…, hợp chất không làm giảm đường huyết mà cải thiện việc dung nạp glucose giảm cholesterol, triệt tiêu mầm bệnh gây ung thư tá tràng nhiều chứng bệnh nan y khác [1], [5] [6], [4] Mướp đắng vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu nên dần người nông dân trồng với diện tích lớn thu nhập cao Nhưng giống sử dụng chủ yếu giống địa phương có khả thích nghi cao, chống chịu sâu bệnh tốt, song suất lại thấp Ngoài ra, giống nhập từ công ty nước giống lai F1 có suất độ đồng cao, giá thành hạt giống cao nhiều giống chưa qua khảo nghiệm tính thích ứng ảnh hưởng đến hiệu sản xuất Một số giống lai nước nhập nội trồng liên tục qua nhiều năm làm suy giảm nguồn gen Nên việc tạo giống nước theo yêu cầu sản xuất phù hợp với sinh thái vùng canh tác, cho suất cao ngày trở nên cần thiết Bên cạnh công tác tạo giống lai chủng phương pháp truyền thống thường tốn nhiều thời gian công sức Thông qua thụ phấn cưỡng chọn lọc liên tục 7-8 hệ nhận dòng để đánh giá khả kết hợp giống Phương pháp nhiều trường hợp không cho dòng bố mẹ đồng hợp tử cặp allen Vì vậy, việc áp dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro tạo giống mướp đắng từ bao phấn rút ngắn thời gian tạo dòng tuyệt đối xuống hệ, từ cho phép giảm chi phí, tăng hiệu trình tạo giống mướp đắng có suất cao, khả thích nghi chống chịu với điều kiện Việt Nam [14], [13] Trên giới, trình tạo mướp đắng đơn bội in vitro nghiên cứu từ năm 2008, có đạt số thành tựu dừng lại giai đoạn tạo callus mà chưa cho phép thu thực tế Trên giới, năm 2010, T Yang cộng qua nghiên cứu tạo callus từ bao phấn mướp đắng, sau xử lý lạnh oC ngày môi trường MS có bổ sung 2,4-D 0,5mg/l Năm 2015 M Usman cộng nghiên cứu thành công tạo callus từ bao phấn mướp đắng môi trường MS có bổ sung NAA kết hợp với BAP ( 3,22+0,88 µm/l) Bao phấn trước nuôi cấy tạo callus phải qua xử lý lạnh 4oC Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chọn đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng (Momordica charantia L.) invitro” Đối tượng phương pháp 2.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu khổ qua lai F1 Diago 26 trồng thôn Bầu Tròn xã Đại An huyện Đại Lôc tỉnh Quảng Nam Vật liệu nghiên cứu là bao phấn thu từ giống khổ qua lai F1 Diago 26 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến phát sinh callus đơn bội Thu hái nụ hoa mướp đắng vào buổi sáng từ 6h đến 7h sáng Nụ hoa đặt đĩa pestri hay túi polyethylene Khử trùng nụ hoa mướp đắng sau tách lấy bao phấn cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 2,4-D; KIN; NAA; BAP nồng độ thay đổi (0-2) mg/l đơn lẻ kết hợp Đánh giá khả phát sinh callus sau tuần, tuần tuần nuôi cấy thông qua tiêu đánh giá sau: Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100 Số callus/mẫu (%) = x 100 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tiền xử lý lạnh (4 oC) đến khả phát sinh callus đơn bội Chọn thời gian tiền xử lý lạnh (4 oC) (0 ngày; ngày; ngàu; ngày; ngày) ảnh hưởng tốt đến khả phát sinh callus Thu hái nụ hoa đặt đĩa pestri hay túi polyethylene Tiền xử lý lạnh (4 oC) khử trùng sau tách lấy bao phấn cấy vào môi trường nuôi cấy có khả phát sinh callus tốt Đánh giá khả phát sinh callus sau tuần, tuần tuần nuôi cấy thông qua tiêu đánh giá sau: Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100 Số callus/mẫu (%) = x 100 2.2.3 Xử lí số liệu Mỗi thí nghiệm tiến hành 30 mẫu bố trí lặp lại lần Số liệu xử lí thống kê xử lí cách sử dụng phần mềm phân tích thống kê SPSS theo phương pháp Turkey với α = 0,05 Kết biện luận 3.1 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến phát sinh callus đơn bội Trong trình tạo callus nuôi cấy bao phấn, việc bổ sung nhiều chất ĐHST yếu tố thiếu sử dụng loại môi trường Trong Auxin nhóm kích thích sinh trưởng nhà khoa học sử dụng chủ yếu để kích thích phận bào sinh trưởng mô sẹo Mỗi chất riêng lẻ kết hợp với cho hiệu phát sinh callus khác Sử dụng giống khổ qua lại F1 Diago 26, khử trùng mẫu Cồn 70o 30 giây; NaOCl 5% phút; HgCl 0.1% phút, nụ hoa có kích thước 3-5 mm để thí nghiệm Kết phát sinh callus chất ĐHST thể bảng sau: Bảng 3.1 Sự ảnh hưởng 2,4-D; KIN; BA đến phát sinh callus Thời Tỷ lệ gian Số 2,4-D KIN BA phát sinh phát callus/bình callus sinh (mg/l) (mg/l) (mg/l) (%) (%) callus (tuần) 0.5 0 0 1.5 0 0 0.5 0 0 1.5 0 0 0.5 0 0 1.5 0 Chú thích: Dấu “–“: tượng phát sinh callus Hình thái callus - Qua bảng kết bảng 2.1 cho ta thấy chất ĐHST 2,4-D; KIN; BA nồng độ đơn lẽ khác không cho phát sinh callus đơn bội Theo Y Tang cộng thành công việc tạo callus đơn bội mướp đắng môi trường MS có bổ sung 0.5mg/l 2,4-D phần lớn callus bị hóa nâu [22] Nhưng thí nghiệm không cho phát sinh callus môi trường MS có bổ sung 0.5mg/l 2,4-D khác kiểu gen điều kiện ngoại cảnh trồng giống Qua kết trình bày bảng 2.2 cho thấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D kết hợp với KIN có ảnh hưởng đến phát sinh callus mướp đắng Ở nồng độ 1mg/l 2,4-D kết hợp với 0.5mg/l KIN sau tuần cho tỷ lệ phát sinh callus 28.89% số callus/bình thấp 13.33% với callus màu vàng đậm, nồng độ 1mg/l 2,4-D kết hợp với 1mg/l KIN sau tuần cho tỷ lệ phát sinh callus 17.78% số callus/bình 10.67% với callus màu vàng đậm Khi tăng nồng độ 2,4-D lên 2mg/l nồng độ KIN lên 2mg/l sau tuần có cảm ứng callus cao 66.67% số callus/bình 66.67% callus màu vàng Ở nồng độ 2,4-D kết hợp KIN lại không thấy có phát sinh callus Bảng 3.2 Sự ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với KIN đến phát sinh callus 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1.5 Tỷ lệ phát sinh callus (%) - 0.5 2,4KIN D (mg/l) (mg/l) Số Thời gian callus/bình phát sinh (%) callus (tuần) - - 28.89 b 13.33 b 17.78 c 10.67 b 1 1.5 1.5 1.5 1.5 2 1.5 0.5 1.5 0.5 1.5 - - - 2 66.67a 66.67a 2.5 - - Hình thái callus Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng đậm Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng đậm Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng - Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p