Header Page of 133 Kỹ1thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng MỤC LỤC A MỞ ĐẦU B NỘI DUNG Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Các bước kỹ thuật chuyển gen Một số phương pháp chuyển gen thực vật 3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 3.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 11 3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 12 3.2.1 Chuyển gen súng bắn gen (gene gun) 12 3.2.2 Chuyển gen xung điện (electroporation) 14 3.2.3 Chuyển gen vi tiêm (microinjection) 14 3.2.4 Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 15 3.2.5 Chuyển gen phương pháp hóa học 15 3.2.6 Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) 16 Lợi ích nguy trồng chuyển gen 16 4.1 Lợi ích 16 4.2 Nguy tiềm ẩn 18 Những thành tựu, triển vọng chủ yếu tạo giống trồng chuyển gen 20 Các hướng tạo trồng chuyển gen 21 6.1 Chuyển gen kháng sâu 21 6.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 22 6.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh 22 6.4 Chuyển gen tạo sản xuất protein động vật 24 6.5 Chuyển gen thay đổi hàm lượng chất lượng chất dinh dưỡng 24 6.6 Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc 25 Quy trình tạo hoa hồng xanh kỹ thuật RNA interference (RNAi) 26 C KẾT LUẬN 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ2thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng A MỞ ĐẦU Một kỹ thuật công nghệ tế bào thực vật kỹ thuật chuyển gen Trước đây, để tạo giống nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại gen hai cá thể thực vật tạo thể lai mang tính trạng mong muốn Phương pháp thực cách chuyển hạt phấn từ sang nhụy hoa khác Tuy nhiên phép lai chéo bị hạn chế thực cá thể loài (lai gần), lai cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ tạo lai Tuy nhiên, lai gần phải nhiều thời gian thu kết mong muốn thông thường tính trạng quan tâm lại không tồn loài có họ hàng gần Kể từ năm 1984, lúc người ta bắt đầu tạo trồng chuyển gen đến có bước tiến lớn Nhiều trồng quan trọng chuyển gen đời lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen chuyển gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả sản xuất loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống lúc đưa vào loài trồng gen mong muốn có nguồn gốc từ thể sống khác nhau, không loài có họ gần mà loài xa Phương pháp hữu hiệu cho phép nhà tạo giống thực vật thu giống nhanh vượt qua giới hạn kỹ thuật tạo giống truyền thống Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen kỹ thuật đưa gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn plasmid tế Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ3thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng bào chủ gắn gen tế bào chủ, tồn tái với gen tế bào chủ Gen lạ tế bào chủ hoạt động tổng hợp protein đặc hiệu, gây biến đổi đặc điểm có làm xuất đặc điểm thể chuyển gen Nhìn chung, việc ứng dụng chuyển gen có lợi ích rõ rệt sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những chuyển gen “thế hệ thứ nhất” giúp giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa học hướng đến việc tạo chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng giá trị dinh dưỡng có đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến Lợi ích trồng hướng trực tiếp vào người tiêu dùng Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ngô khoai tây - Những giống ngô trồng điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khỏe từ đậu nành cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm có nguy tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật Bao gồm: - Mối nguy hiểm việc vô tình đưa chất gây dị ứng làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả phát tán gen biến nạp trồng sang họ hoang dại Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ4thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với chất độc tiết từ chuyển gen - Nguy chất độc tác động tới sinh vật loại sinh vật cần diệt, làm cân sinh thái Nhìn chung, điểm chưa rõ ràng chuyển gen với khả tạo giống trồng có giá trị kinh tế, công nghệ có vai trò phủ nhận Tuy vậy, số vấn đề đáng lo ngại Để giải vấn đề kết luận thu phải dựa thông tin tin cậy có sở khoa học Triển vọng công nghệ chuyển gen thực vật lớn, cho phép tạo giống trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho người mà chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, luôn có Đối với phát triển công nghệ sinh học kỷ XXI công nghệ chuyển gen có vị trí đặc biệt quan trọng Có thể nói công nghệ chuyển gen hướng công nghệ cao công nghệ sinh học đại phục vụ sản xuất đời sống Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ5thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng B NỘI DUNG Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: - Không phải toàn tế bào thể tính toàn (totipotency) - Các khác có phản ứng không giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hoàn toàn khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập ADN ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các ADN (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ6thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Trong đó, ADN virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) Các bước kỹ thuật chuyển gen Từ người ta khám phá thí nghiệm chuyển gen thực nhờ loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, nhà khoa học tin Agrobacterium chuyển gen vào tất trồng Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc (một mầm) mà hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bắn gen vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) Đến nay, nhờ cải tiến vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Quá trình chuyển gen thực qua bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cADN từ thư viện genomic ADN) - Gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E coli - Tách chiết ADN plasmid - Biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác kể - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ7thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) Nguyên liệu để thực biến nạp tế bào thực vật riêng rẽ, mô hoàn chỉnh Cản trở lớn tiếp nhận ADN phần lớn sinh vật thành tế bào Muốn làm thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym điều kiện thích hợp người ta tạo tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng Sau biến nạp người ta tách enzym phân giải tế bào phát triển, thành tế bào tạo thành Các tế bào biến nạp nuôi cấy môi trường nhân tạo thích hợp với chất kích thích sinh trưởng để tạo thành hoàn chỉnh Sau phương pháp phân tích genome PCR, Southern blot, Northern blot thực để tìm xác biến đổi gen Một số phương pháp chuyển gen thực vật Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu chuyển gen trực tiếp chuyển gen gián tiếp 3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens * Nguyên lý chung Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen thực vật phương pháp hiệu phổ biến nhờ vào khả gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật cách xác ổn định Sự chuyển gen thực vật dùng A tumefaciens dựa nguyên lý hình sau Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ8thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Hình1 Agrobacterium mang plasmid gây khối u thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid chứa gen vir vùng gen cần chuyển (T-DNA) Gen quan tâm chèn vào vùng T-DNA Các tế bào tổn thương thực vật tiết hợp chất bảo vệ, hợp chất kích thích biểu gen vir Agrobacterium Vir protein tạo T-strand từ vùng T-DNA Ti-plasmid Sau vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển Trong tế bào thực vật, protein vir tương tác với T-strand tạo phức hệ (T- complex) Phức hệ vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào gen thực vật biểu gen quan tâm Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of 133 Kỹ9thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Bộ gen vi khuẩn Ti plasmid Hình Vi khuẩn A.tumefaciens Cụ thể sau: Phương pháp sử dụng Ti plasmid A.tumefaciens Ti plasmid Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào Ti plamid gồm hai thành phần: T- DNA vùng Vir T- DNA chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, nhờ mà gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào TDNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục (auxin, cytokinie), gen tổng hợp chất Opine gen gây khối u Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, đoạn vùng xâm nhập vào phân tử ADN thực vật Trong plasmid vị trí T- DNA giới hạn bờ trái bờ phải Vùng Vir phụ trách khả lây nhiễm Chúng gồm nhóm từ VirA đến VirG VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp Để thiết kế vector dùng biến nạp: trước hết cắt gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, sau gắn thêm gen thị (kháng thuốc chất diệt cỏ) với đoạn điều khiển phù hợp để chọn thể biến nạp cuối gắn gen cần biến nạp Footer PageThủy ofHồng 133 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ10 thuật * Các plasmid Agrobacterium sử dụng công nghệ gen thực vật gồm có loại: vector liên hợp vector nhị thể - Vector liên hợp (Cointegrated vector) Vector liên hợp dựa tái tổ hợp plasmid Một vector liên hợp gồm có: vị trí để ghép gen quan tâm, thường vị trí có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E.coli Gen thị kháng sinh giúp cho chọn lọc vi khuẩn E.coli, Agrobacterium gen chọn lọc hoạt động tế bào thực vật Như vector liên hợp hình thành từ plasmid mang trình tự ADN mong muốn plasmid có chứa vùng vir gen vùng bờ lặp lại T-ADN Sau tái tổ hợp, vector liên hợp tạo dùng cho chuyển gen vào thực vật - Vector nhị thể (Binary vector) Vector nhị thể hệ thống dùng plasmid riêng biệt: cung cấp TADN độc tính gây khối u, plasmid Ti plasmid có khả thâm nhập vào tế bào thực vật (mang gen vir) Plasmid thứ mang gen chọn lọc thực vật gen ghép vào gen thực vật Khi plasmid đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, sản phẩm mang gen vir đưa T-AND vào tế bào thực vật, TADN nằm phân tử ADN khác * Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen thu nhiều kết quả, đặc biệt chuyển gen vào lúa mì lương thực quan trọng Nhiều giống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt giống lúa Golden rice có chứa hàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường Nhờ giống lúa giải vấn đề khó khăn thiếu vitamin A nước phát triển, đặc biệt Châu Phi * Ưu điểm - Gen bị đào thải Footer PageThủy 10 of 133 Hồng 10 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ22 thuật Tinh thể protein độc tố vi khuẩn vào côn trùng bị enzym protease phân giải thành đoạn peptit, có đoạn khối lượng khoảng 68.000 dalton chứa khoảng 1200 axit amin làm hỏng ruột côn trùng Các gen mã hóa độc tố nằm plasmid vi khuẩn, gọi chung Cry (crystal) Hình Chuyển gen kháng sâu bệnh 6.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Thuốc diệt cỏ glyphosat thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt, dễ tự phân hủy gây ô nhiễm môi trường Cơ chế diệt cỏ thuốc kìm hãm hoạt động enzym có tên enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS) Enzym EPSPS có chức chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng có tên axit sikimic Axit sikimic không hình thành làm rối loạn toàn trình trao đổi chất cỏ làm cỏ chết Cây trồng tạo có hàm lượng hoạt tính enzym EPSPS cao gấp lần so với trồng bình thường hoàn toàn chống chịu với thuốc diệt cỏ glyphosat 6.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh Có nhiều cách tạo kháng virus, chuyển gen mã hóa protein vỏ virus, chuyển gen tạo enzym phân giải virus (ví dụ enzym ribozyme), Footer PageThủy 22 of 133 Hồng 22 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ23 thuật chuyển gen có trình tự đối (antisens) với ARN virus Các đối khóa lại chép phiên mã ARN virus Kỹ thuật chuyển gen mã hóa vỏ protein virus thường sử dụng phổ biến Virus có cấu tạo phần: phần lõi axit nucleic (ADN ARN) phần vỏ protein Khi có mặt gen mã hóa protein vỏ virus tế bào gây hiệu ứng kìm hãm tổng hợp protein vỏ gen tạo vỏ virus Do virus không nhân lên Nhiều loại trồng chuyển gen tạo vỏ nhiều loại virus nên kháng virus gây bệnh như: đu đủ kháng với virus gây bệnh đốm vòng; thuốc kháng với virus khảm dưa chuột; thuốc kháng với virus khảm alfa; khoai tây kháng với virus X, virus Y; khoai tây kháng với virus xoăn lá; cam, quýt kháng bệnh virus gây tàn lụi tristeza … Hình Cây thuốc chuyển gen kháng virus CMV đối chứng Hình Lá đu đủ chuyển gen kháng PRSV đối chứng (PRSV: Papaya ringspor virus, gây bệnh đốm vòng) Footer PageThủy 23 of 133 Hồng 23 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ24 thuật 6.4 Chuyển gen tạo sản xuất protein động vật Các nhà khoa học tìm cách giải trình tự gen mã hóa cho protein động vật, thiết kế lại, sau chuyển gen vào thực vật, biến thực vật thành thể sản xuất protein động vật Ví dụ: gen tổng hợp lactoferrin protein có sữa người, chuyển vào khoai tây, lúa thu khoai tây, lúa có khả tổng hợp lactoferrin Một hướng quan trọng khác sản xuất “thực phẩm chức năng” Điều có nghĩa cần chuyển nhiêu gen tổng hợp protein có tác dụng kháng nguyên vào đối tượng trồng rau, đậu, ăn Do tạo vacxin Nhờ ăn rau, đậu, hoa, trồng chuyển gen tạo vacxin để thay cho việc tiêm vacxin phòng bệnh Hình Thực phẩm chức 6.5 Chuyển gen thay đổi hàm lượng chất lượng chất dinh dưỡng Đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein chứa nhiều methionin vào đậu tương ngô, kết làm tăng loại protein giàu methionin lên 8% tổng số protein có hạt Footer PageThủy 24 of 133 Hồng 24 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ25 thuật Người ta chuyển thành công gen mã hóa cho việc tổng hợp chất thaumatin (chất có độ gấp hàng nghìn lần so với đường mía) vào khoai tây Kết toàn thân, lá, rễ củ khoai tây Hình Hạt gạo vàng Người ta chuyển nhóm gen mã hóa cho enzym chuyển hóa pyrophosphat thành β- caroten Gạo có hàm lượng β- caroten giải vấn đề thiếu vitamin A cho người 6.6 Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc Hình 10 Đa dạng màu hoa Màu sắc hoa, đặc biệt hoa có màu xanh, nhung đen có giá trị Trong mô cánh hoa, tế bào biểu bì thường chứa sắc tố Footer PageThủy 25 of 133 Hồng 25 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ26 thuật tạo màu sắc hoa Có nhóm anthocyanin phát dẫn xuất chất pelargonidin, cyanidin delphinidin Các sắc tố dẫn xuất pelargonidin thường có màu da cam, hồng đỏ; cyanidin có màu đỏ màu hoa cà; delphinidin có màu tía, màu xanh màu xanh đen Sự phối hợp nhóm anthocyanin tạo phổ màu sắc hoa rộng Trên sở biết gen mã hóa cho enzym tham gia vào biến đổi sắc tố, người ta chuyển gen mã hóa, gen ức chế hoạt động enzym nhằm điều khiển hướng chuyển hóa sắc tố, từ tạo hoa có màu sắc khác Quy trình tạo hoa hồng xanh kỹ thuật RNA interference (RNAi) Hội nghị hoa hồng giới 2006 tổ chức thành phố Osaka từ ngày 11- 17/5/2006 Trong hội nghị ban tổ chức đưa triển lãm nhiều giống hoa hồng đẹp ấn tượng Tuy nhiên trội hội nghị lần hoa hồng xanh tạo kỹ thuật RNAi hợp tác nhà khoa học hai công ty Florigene Suntory trợ giúp mặt kỹ thuật Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO) Hoa hồng xanh coi chén thánh (Holy Grail) nhà lai tạo hoa hồng kể từ năm 1840 Khi hiệp hội làm vườn Anh Bỉ treo giải thưởng 500.000 francs cho người tạo hoa hồng màu xanh Các nhà di truyền học phân tử công ty Florigene Suntory đoạt giải thưởng này, giải thưởng làm nhụt chí nhà lai tạo hoa hồng truyền thống cách kết hợp yếu tố cũ, yếu tố mới, yếu tố vay mượn cuối yếu tố tạo màu xanh Yếu tố tạo màu xanh hoa hồng gen delphinidin mà Footer PageThủy 26 of 133 Hồng 26 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ27 thuật nhà di truyền công ty Florigene clone từ loài hoa păng-xê để tổng hợp trực tiếp màu xanh hoa hồng Yếu tố vay mượn gen iris nhằm tạo enzyme DFR (the dihydroflavonol reductase), enzyme hoàn thành chu trình phản ứng tổng hợp delphinidin hoa hồng Yếu tố gen nhân tạo Gen tạo nhóm nhà di truyền học công ty Suntory kỹ thuật RNA interference, viết tắt RNAi Kỹ thuật tư vấn viện CSIRO nhằm mục đích tắt hoạt động gen hình thành màu đỏ hoa hồng Chính gen đánh bại nỗ lực nhóm nghiên cứu Florigene nhằm làm hoạt hóa chu trình delphinidin hoa hồng gần thập kỷ Vì vậy, nhà khoa học Suntory tạo gen “câm lặng” để vượt qua khó khăn kỹ thuật RNAi Trong trồng có loại phân tử gọi anthocyanin coi sắc tố chủ đạo hoa, trái mô tế bào khác Thông thường, màu hoa bắt nguồn từ anthocyanin với có mặt chất carotenoid màu vàng Ngoài ra, anthocyanin dihydrokaempferol (DHK) lại enzyme chi phối cho chu trình hình thành sắc tố trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin delphinidin Gen cyanidin mã hóa enzyme làm thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành chu trình cyanidin dẫn đến biểu màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà Trong gen delphinidin không diện hoa hồng mã hóa enzyme tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành tổng hợp màu theo chu trình delphinidin Một loại enzyme khác có tên gọi dihydroflavinol reductase (DFR) hỗ trợ màu thị ba chu trình Enzyme quan trọng tạo màu cánh hoa Chính mà đột biến gen DFR cho hoa có màu trắng Trong hoa hồng gen delphinidin để hình thành Footer PageThủy 27 of 133 Hồng 27 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ28 thuật màu theo chu trình Chu trình delphinidin hình thành màu đỏ xanh hoa tác động DRF pH Để tạo hồng màu xanh, nhà nghiên cứu Florigene cần loại hồng trắng gene DFR bị bất hoạt Vào năm 2001, TS.Waterhouse thảo luận việc sử dụng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gen mong muốn để sau thay gen khác Do đó, nhà khoa học công ty Florigene nhận lợi ích việc dùng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế hoạt động gen DFR hoa hồng đỏ dẫn đến ức chế chu trình cyanidin sau chuyển gen delphinidin với gen DFR hoàn toàn nhằm hoàn chỉnh chu trình tổng hợp delphinidin hoa hồng Cùng lúc nhà nghiên cứu công ty Suntory, Nhật Bản có ý tưởng cách dùng kỹ thuật RNAi để ức chế gen DFR sau họ tạo dòng (clone) gen delphinidin từ loài hoa păng-xê (pansy) gen DFR từ hoa iris Các gen DFR hoa hồng iris tương tự chia sẻ nhiều đoạn mã DNA, kỹ thuật RNAi tinh tế ức chế gen DFR hoa hồng mà không ảnh hưởng đến gen DFR hoa iris việc tạo cấu trúc ức chế gen có tác dụng tạo phân tử dsRNA kẹp tóc (hairpin dsRNA) với trình tự tương đồng với gen DFR hoa hồng Vì để tạo hồng xanh, nhà khoa học Suntory áp dụng gen Một gen nhân tạo dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gen DFR hoa hồng làm cho hoa hồng không biểu màu Sau chuyển gen delphinidin từ loài hoa păng-xê gen DFR từ loài hoa iris tạo hoa hồng có hàm lượng delphinidin cao cánh hoa Tuy nhiên, phải lưu ý yếu tố ảnh hưởng đến màu xanh cánh hoa độ pH tế bào lý loài hoa có chu trình anthocyanin lại có màu khác Khi nồng độ pH Footer PageThủy 28 of 133 Hồng 28 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ29 thuật tế bào mang tính kiềm sắc tố anthocyanin thường trở nên xanh pH đất không ảnh hưởng hay ảnh hưởng đến pH tế bào cánh hoa Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền Cánh hoa hồng thông thường có nồng độ pH khoảng 4,5 Chính vậy, để tạo cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp hạn chế Vì vậy, nhà khoa học nghĩ đến kỹ thuật ức chế gen kỹ thuật RNAi nhằm xác định gen ảnh hưởng đến tính axít cánh hoa hay điều chỉnh màu cánh hoa theo hướng khác Hình 11 Quy trình hình thành hồng xanh với hỗ trợ kỹ thuật RNAi Nguồn hình từ CSIRO (http://www.csiro.au/files/files/p29z.pdf) Hình 12 Hoa hồng xanh (blue rose) Footer PageThủy 29 of 133 Hồng 29 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ30 thuật Bông hồng xanh sản phẩm tạo từ việc ứng dụng kỹ thuật RNAi Đây hàng loạt ứng dụng RNAi nghiên cứu y sinh công cụ hữu ích cho việc tìm hiểu khám phá chức bí ẩn gen thời đại nghiên cứu hậu genome (post- genomic era) Footer PageThủy 30 of 133 Hồng 30 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ31 thuật C KẾT LUẬN Công nghệ tạo trồng chuyển gen ngày phát triển tạo hàng trăm giống trồng chuyển gen khác mang nhiều đặc tính quý Tuy nhiên vấn đề trồng chuyển gen (GMOs- Genetically Modified Organisms) vấn đề tranh cãi, chí gặp phải phản đối gay gắt từ nhiều nhà khoa học Sản phẩm chuyển gen bị nhiều người tiêu dùng lo ngại Các sản phẩm chuyển gen phải dán nhãn để người tiêu dùng lựa chọn Nhiều nước chưa cho phép nhập sản phẩm chuyển gen trồng chuyển gen Các phương pháp nhận biết GMOs cấu trúc phân tử GMOs Việc nhận biết GMOs cần thiết nhiều ứng dụng để đánh giá mức độ hạt giống hay việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm số quốc gia Vì nhiều kỹ thuật phân tích phát triển để đáp ứng nhu cầu Việc phát GMOs dẫn xuất thực nhờ nhận biết phân tử (ADN, ARN protein) mà phân tử có nguồn gốc từ gen chèn (hoặc gen biến đổi) Có ba phương pháp để xác định GMOs là: phương pháp khuyếch đại dựa sở nucleotit; phương pháp dựa cở sở protein; phương pháp dựa sở phát hoạt tính enzym * Phương pháp khuếch đại dựa sở nucleotit: bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP (Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trình tự axit nucleic (NASBA), kỹ thuật dấu vân tay (RFLP, AFLP, RAPD…), lai mẫu dò, chép trình tự trì liên tục (3SR) khuếch đại enzym chép Q Footer PageThủy 31 of 133 Hồng 31 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ32 thuật * Phương pháp dựa sở protein: bao gồm điện di gel SDS chiều, điện di gel SDS hai chiều, phân tích Western blot kỹ thuật ELISA (Enyme linked immunosorbent assays) * Phương pháp dựa sở phát hoạt tính enzym: phương pháp không thích hợp với thực phẩm qua chế biến lúc protein bị biến tính Cho đến phương pháp phát triển để phát GMOs dẫn xuất GMOs chủ yếu dựa việc phát ADN, vài phương pháp phát triển để phát protein ARN Điều có nhiều lý do, ADN làm nhân lên hàng triệu thời gian ngắn nhờ kỹ thuật PCR Việc phân tích ARN protein trình phức tạp thời gian lâu ADN phân tử bền vững, ARN lại không ổn định Tính bền vững protein lại khác nhau, phụ thuộc vào loại protein Thường có mối tương quan số lượng GMOs ADN ADN biến đổi di truyền nhân, mối tương quan không xảy ADN ADN nhân (trong sinh vật nhân chuẩn, thể nhiễm sắc nhiễm sắc thể sinh vật nhân sơ) Trong lại nhiều mối tương quan số lượng GMOs protein ARN Cuối thân thể bị biến đổi di truyền bị tác động mức ADN Hiện nay, tất GMOs thương mại hoá thể bị biến đổi ADN nhân Tuy có nhiều kỹ thuật khác kỹ thuật lại có tính đặc hiệu mặt hạn chế riêng Phương pháp dựa sở protein Phương pháp nhờ vào liên kết đặc hiệu protein kháng thể Kháng thể tác nhân bảo vệ thể chống lại xâm nhập vi Footer PageThủy 32 of 133 Hồng 32 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ33 thuật khuẩn virus Khi kháng thể nhận phân tử lạ liên kết với phân tử này, phân tích phát GMOs phức tạp mối liên kết nhận biết nhờ phản ứng hình thành sắc tố Đây kỹ thuật ELISA, kháng thể cần thiết để nhận biết protein không sinh không nhận protein Protein phải làm từ thân GMOs tổng hợp thư viện thành phần axit amin protein biết rõ Kỹ thuật phát protein đặc hiệu sử dụng ELISA thích hợp với việc phân tích nguyên liệu thô Phương pháp khuyếch đại dựa sở nucleotit + Phương pháp dựa sở ARN: phương pháp nhờ vào liên kết đặc hiệu phân tử ARN phân tử ADN ARN tổng hợp gọi đoạn mồi (primer) Primer phải bổ sung với trình tự nucleotit điểm khởi đầu phân tử ARN Kết phân tử tách đôi tương tự ADN Thường liên kết ARN primer dẫn đến chuyển hóa phân tử ARN thành phân tử ADN thông qua trình chép ngược Cuối cùng, ADN nhân lên nhờ PCR Hoặc ARN phiên mã thành hàng trăm copy phân tử ARN gốc trình lặp lại nhờ sử dụng phân tử ARN copy mẫu chuẩn kỹ thuật NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) + Phương pháp dựa sở AND: chủ yếu nhờ vào nhân đôi ADN đặc hiệu với kỹ thuật PCR Kỹ thuật dùng để xác định sản phẩm GM, với đoạn mồi (primer) thiết kế dựa trình tự điều tiết gen cấu trúc đoạn gen chuyển Các đoạn primer thiết kế có vài đặc điểm đặc biệt sử dụng để sàng lọc sản phẩm phát sản phẩm đặc hiệu Hai mạch ADN tổng hợp có vai trò quan trọng chuỗi phản ứng trùng hợp này, mạch ADN bổ sung với Footer PageThủy 33 of 133 Hồng 33 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ34 thuật mạch cặp mồi Primer thứ cặp đôi mã hoá cho chuỗi ADN nhân đôi, primer thứ bắt cặp với mạch ADN lại không mã hoá chuỗi ADN Trong phản ứng PCR, giai đoạn chu kỳ: phân tử ADN tách đôi Giai đoạn 2, diễn bắt cặp đoạn primer với chuỗi ADN bổ sung chúng Giai đoạn tạo thành hoàn hảo chuỗi ADN gốc nhờ bổ sung nucleotit thích hợp để kết thúc đoạn primer Khi chu trình hoàn thành ta lặp lại chu trình này, chu kỳ kết thúc số lượng lại tăng lên gấp đôi, kết sản phẩm khuếch đại nhanh Sau 20 chu kỳ, số lượng tăng gấp triệu lần Tuy nhiên, chu kỳ định số lượng sản phẩm khuếch đại bị ức chế, không tăng lên Kỹ thuật PCR không thích hợp để phát thực phẩm qua chế biến mức độ cao đoạn ADN thực phẩm bị đứt thành mảnh nhỏ Tuy nhiên, PCR kỹ thuật phổ biến sử dụng rộng rãi, phương pháp nhạy có tính đặc hiệu cao, phát axit nucleic khối lượng nhỏ Kỹ thuật PCR không sử dụng để xác định sản phẩm GM mà sử dụng vào mục đích định lượng, định tính Vì mà có quantitative- PCR, multiplex- PCR, real- time PCR, qualitative- PCR… Để tuân theo ngưỡng dán nhãn GMOs có thành phần thực phẩm, real- time PCR, quantitative competitive PCR (QC- PCR) ứng dụng nhiều phòng thí nghiệm để kiểm soát thức sản phẩm thực phẩm Khi đưa gen chèn vào thể thực vật gen thường chứa trình tự điều khiển chứa gen đặc hiệu (gen quy định tính trạng mong muốn) Hiện nay, hầu hết thực vật chuyển gen có chứa trình tự khởi động promoter 35S CaMV (small subunits of cauliflower mosuic virus) Footer PageThủy 34 of 133 Hồng 34 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ35 thuật virus khảm súp lơ đoạn kết thúc terminator NOS (Nopalin synthase) plasmid vi khuẩn Agrobacterium, trình tự mã hoá gen chuyển Chính mà sử dụng PCR để xác định xem có phải GMOs hay không, thường sử dụng cặp primer 35S primers NOS primers đặc hiệu cho gen chuyển, primer tổng hợp phần hay toàn trình tự gen Footer PageThủy 35 of 133 Hồng 35 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ36 thuật TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Quốc Dung Công nghệ chuyển gen ĐH Huế, 2006 Trịnh Đình Đạt Công nghệ sinh học Tập bốn NXB Giáo dục http://vietsciences.org http://agbiotech.com.vn http://sinhhocvietnam.com.vn http://isa-cnsh.org http://www.hcmbiotech.com.vn http://kenh14.vn Footer PageThủy 36 of 133 Hồng 36 ...Header Page of 133 Kỹ2 thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng A MỞ ĐẦU Một kỹ thuật công nghệ tế bào thực vật kỹ thuật chuyển gen Trước đây, để tạo giống nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền... 133 Hồng 15 Header Page of chuyển 133 gen thực vật & ứng dụng Kỹ1 6 thuật Phương pháp chuyển gen hóa chất áp dụng với nhiều loài thực vật khả chuyển gen với tần số chuyển gen thấp Tuy nhiên, với... cải tiến vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Quá trình chuyển gen thực qua bước