Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số:62.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS NGUYỄN THỊ LAN PGS TS PHẠM CÔNG HOẠT Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN BÁ HIÊN Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS TÔ LONG THÀNH Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng Phản biện 3: PGS.TS CÙ HỮU PHÚ Hội Thú y Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn nòi giống, lứa tuổi Bệnh xuất Mỹ năm 1987 (Keffaber, 1989), nhanh chóng sau bệnh lan sang Canada sau lan sang nước Châu Âu Năm 1991, virus tìm thấy Hà Lan (Terpstra et al., 1991) Năm 1998, bệnh phát Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực Châu Á Từ năm 2005 trở lại đây, bệnh lây lan khắp nước toàn giới Bệnh tai xanh loại virus gây ra, virus công đại thực bào dẫn đến tượng suy giảm miễn dịch lợn, tạo điều kiện cho virus, vi khuẩn gây bệnh khác công.Tác nhân gây bệnh - virus PRRS (PRRSV) thành viên giống Arterivirus, họ Arteriviridae, Nidovirales (Collins et al., 1992) PRRS lần ghi nhận Việt Nam vào năm 1997, thực tế cho thấy virus tồn không ngừng biến đổi, cần có nghiên cứu PRRSV Việt Nam, để thấy rõ có khác biệt hay không với chủng cổ điển phân lập giới trả lời cho câu hỏi vắc-xin PRRS sử dụng mà dịch bệnh thường xuyên xảy Nguyên nhân chưa có thông tin xác chủng PRRSV thực tế lưu hành Việt Nam, đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus Trong nghiên cứu gần Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam nghiên cứu số triệu chứng lâm sàng, đặc điểm bệnh lý lợn mắc PRRS tự nhiên phân lập số chủng PRRSV gây bệnh từ đàn lợn nuôi số tỉnh phía Bắc Việt Nam môi trường tế bào Marc 145 Trong chủng phân lập được, có chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 phân lập từ lợn có triệu chứng bệnh tích điển hình lợn mắc PRRS, gây tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết cao Tuy nhiên chưa đánh giá hết đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus Để phục vụ mục đích lựa chọn chủng chế tạo vắc-xin, đánh giá hiệu vắc-xin sản xuất chế phẩm sinh học phòng, trị bệnh cho vật nuôi việc nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus phân lập vô quan trọng cấp thiết 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu chung Mục tiêu luận án nhằm chọn chủng virus PRRS tiềm có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ nghiên cứu chuyên sâu như: sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu virus phân lập biến chủng dùng dịch tễ học phân tử 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Xác định số đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Xác định số đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ số tỉnh phía Bắc Việt Nam 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Phạm vi không gian nghiên cứu: Nghiên cứu thực đối tượng chủng virus PRRS HUA 01 phân lập tỉnh Hải Dương (năm 2013) chủng virus PRRS HUA 02 phân lập tỉnh Hưng Yên (năm 2013) Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y phòng thí nghiệm môn bệnh lý, khu nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu thực từ năm 6/201412/2016 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Những vắc-xin sử dụng để phòng bệnh Việt Nam chưa mang lại hiệu rõ rệt Điều cho thấy có sai khác đáng kể tính kháng nguyên chủng virus PRRS gây bệnh đàn lợn Việt Nam với chủng virus PRRS vắc-xin nhập ngoại mà kháng thể kháng virus PRRS có lợn tiêm phòng bảo hộ chúng khỏi chủng virus PRRS thực địa Nghiên cứu tương đồng kháng nguyên chủng virus PRRS phân lập chủng virus vắc-xin cho phép xác định tính tương đồng chủng virus này, từ đưa thông tin xác lưu hành chủng virus PRRS Việt Nam Đồng thời cho phép lựa chọn chủng virus PRRS thích hợp để sử dụng làm vắc-xin Luận án nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử số chủng virus PRRS phân lập từ trước nghiên cứu cần thiết để lựa chọn chủng virus điển hình cho virus gây bệnh Việt Nam có tiềm để sản xuất vắc-xin, thử độc lực vắc-xin chế phẩm sinh học nhằm phục vụ cho chẩn đoán, phòng, trị bệnh cho lợn 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Các thông tin khoa học, kết nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử 02 chủng PRRSV phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam sở khoa học quan trọng cho nghiên cứu sâu PRRS nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng, nghiên cứu sản xuất vắc-xin, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán, bảo tồn nguồn gene virus thực địa với đặc tính sinh học rõ ràng đầy đủ Kết luận án đặc tính sinh học sinh học phân tử độc lực số chủng PRRSV có ích cho lĩnh vực thú y nói riêng lĩnh vực công nghệ sinh học nói chung Tạo tiến khoa học, phát triển hướng nghiên cứu công nghệ sinh học lĩnh vực thú y 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết luận án đưa thông tin đặc tính sinh học, sinh học phân tử số chủng virus PRRS nghiên cứu để lựa chọn chủng virus tiềm dùng để chế vắc-xin phòng bệnh chế kháng nguyên chẩn đoán bệnh làm chủng cường độc để thử hiệu lực vắcxin Như chủng virus giúp ích cho công ty sản xuất vắc-xin sở nghiên cứu Sản xuất vắc-xin nước, giúp lệ thuộc vào nhập vắc-xin chủ động việc phòng chống dịch PRRS nhằm giảm thiểu tối đa thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi, giúp phát triển ngành chăn nuôi bền vững PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn giới Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) ghi nhận lần báo cáo thiệt hại ngành công nghiệp chăn nuôi Mỹ Tại ổ dịch có biểu triệu chứng lâm sàng PRRS báo cáo Mỹ vào cuối năm 80 kỉ trước (1987) người ta thấy số lượng lợn chết điều kiện bình thường tăng lên lợn chậm lớn Các triệu chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi lợn sau cai sữa, chậm lớn, giảm suất tỷ lệ tử vong tăng (Keffaber, 1989) Hai năm sau ổ dịch có triệu chứng lâm sàng tương tự báo cáo CHLB Đức (1990) Năm năm sau kể từ có báo cáo bệnh, năm 1991 virus tìm thấy lần Hà Lan (Terpstra et al., 1991) Sau không lâu, virus PRRS Mỹ đặt tên ATCC VR – 2332) (Collins et al., 1992) 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn Việt Nam Lần lịch sử vào năm 1997, PRRS phát đàn lợn nhập từ Mỹ vào tỉnh miền Nam Kết kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập có huyết dương tính với PRRS Toàn số lợn xử lý vào thời gian Tuy nhiên, năm tiếp theo, nghiên cứu bệnh trại lợn giống tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết dương tính với bệnh khác nhau, từ 1,3% 68,29% (Cục Thú y, 2007) Theo thống kê Cục Thú y, đợt dịch xảy vào ngày 12/3/2007 sau lây lan khắp nước Từ năm 2007 đến nay, PRRS vấn đề thời tính nguy hiểm 2.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS Virus PRRS virus RNA chuỗi đơn dương, virus xếp vào Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins et al., 1992) Họ Ateriviridae có giống Aterivirus bao gồm hai thành viên là: Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sảy thai viêm phổi ngựa non; Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV) gây rối loạn hô hấp sinh sản lợn 2.2.2 Phân loại virus PRRS Về tính đa dạng di truyền, virus PRRS có hai prototyp, phân lập châu Âu (virus Lelystad-LV) phân lập Bắc Mỹ (VR-2332) Ngoài khác biệt lần phân lập người ta chứng minh có biến dị di truyền mạnh hai typ phân lập, khẳng định qua phân tích trình tự Nucleotid Aminoacid khung đọc mở (ORFs) LV VR-2332 Trình tự Aminoacid VR-2332 so với LV 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6) 74% (ORF7) Phân tích trình tự cho thấy virus tiến hóa đột biến ngẫu nhiên tái tổ hợp gene Theo Murtaugh et al (1995), Meng et al (1995) Nelsen et al (1999) chủng virus gây bệnh động vật cảm thụ với bệnh cảnh giống chúng lại đại diện cho genotyp khác biệt 2.2.3 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học virus PRRS 2.2.3.1 Tính chất nuôi cấy virus PRRS Có nhiều dòng tế bào sử dụng để nuôi cấy virus Tuy nhiên virus PRRS nhân lên hai loại tế bào, là: đại thực bào phế nang lợn (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) tế bào thận khỉ (Marc 145, CL2621) 2.2.3.2 Một số nghiên cứu khả nhân lên virus PRRS môi trường tế bào Marc 145 thông qua khả gây bệnh tích tế bào Nghiên cứu Martha et al (2009) sử dụng dòng tế bào đại thực bào phế nang (PAM) MA104 để phân lập virus PRRS từ mẫu thu thập Nghiên cứu Fang et al (2006) chọn chủng virus PRRS YA phân lập từ phổi lợn mắc triệu chứng cấp tính với PRRS tỉnh Trung Quốc xác định thuộc serotype Bắc Mỹ độc lực cao 2.2.3.3 Một số nghiên cứu quy luật nhân lên virus PRRS môi trường tế bào Nghiên cứu Fang et al (2006) thực nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng virus điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào Marc-145 Virus tiến hành gây nhiễm môi trường Marc 145 với giá trị MOI = 0,1 Nghiên cứu Han et al (2007) tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng virus dòng tế bào MA 104 môi trường nuôi cấy tế bào bình T25 với giá trị MOI x 104 PFU Nguyễn Thị Lan Lương Quốc Hưng (2012) nghiên cứu đặc tính sinh học số chủng phân lập Việt Nam 2.2.4 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus PRRS Dựa phân tích phát sinh loài virus phân lập khác giới (Nelson et al., 1993) PRRSV phân biệt thành hai kiểu gene: loại I, European gienotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện chủng Lelystad (LV), gồm subtype xác định đó, subtype chia thành 12 clade khác nhau, subtype chia thành clade (Shi et al., 2010); loại II: Northern American gienotype gồm virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu chủng virus Bắc Mỹ ATCC - VR2332 PRRSV phân lập Trung Quốc định thành viên kiểu gene II Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy PRRSV khác kháng nguyên, độc lực đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan, 2007) Sợi đơn RNA virus bao gồm gene có khoảng 15 kb, mã hóa ORFs Bộ gene PRRSV bao gồm hai gene polymerase ORF1a ORF1b bảy gene cấu trúc ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, Một số nghiên cứu khác gene ORF5: ORF5 gene mã hóa cho glycoprotein xuất phần lớn bề mặt virus PRRS Trình tự protein GP5 dự đoán có chứa vùng trình tự tín hiệu (từ amino acid 1-32), vùng trình tự ectodomain ngắn (từ amino acid 32-64 amino acid 89-109) vùng trình tự endodomain (từ amino acid 110-200) (Li and Murtaugh, 2012; Kim et al., 2014) Nghiên cứu mức độ tương đồng gene ORF5 cho thấy, chủng virus PRRS lưu hành Việt Nam có mức độ tương đồng cao với chủng Trung Quốc (Metwally, 2010) Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy PRRSV khác kháng nguyên, độc lực đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan, 2007) Những nghiên cứu cho thấy có khác biệt tính di truyền virus phân lập từ vùng địa lý khác Bản thân virus nhóm có thay đổi chuỗi nucleotid cao đến 20% trình tự số lượng ribonucleotide, điển hình chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007) Nghiên cứu Đỗ Hải Quỳnh cs (2016) phân tích đa dạng di truyền gene ORF5 số chủng virus phân lập miền Bắc Việt Nam từ năm 2011-2013 mức độ tương đồng nucleotide chủng virus nghiên cứu với chủng JXA1 cao 2.3 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS) 2.3.1 Truyền nhiễm học 2.3.1.1 Loài vật mắc bệnh PRRSV gây bệnh cho lợn lứa tuổi, nòi giống mẫn cảm lợn lợn nái mang thai Thông thường virus PRRS gây bệnh cho lợn không gây bệnh cho người động vật khác Tuy nhiên, số loại gia cầm vịt trời (Mallard duck) chứng minh mẫn cảm với virus PRRS virus nhân lên loài vịt (Zimmerman et al., 1997) 2.3.1.2 Cơ chế sinh bệnh Virus có đặc điểm thích hợp với đại thực bào, đặc biệt đại thực bào vùng phổi Đây tế bào có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, virus hấp phụ thực trình nhân lên tế bào phá huỷ Virus nhân lên bên đại thực bào, sau phá huỷ giết chết đại thực bào (tới 40%) Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do lợn bệnh thường dễ dàng bị nhiễm khuẩn kế phát (Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan, 2007) 2.3.2 Triệu chứng bệnh tích Biểu triệu chứng lâm sàng bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường kế phát số vi sinh vật khác Theo tác giả Lê Văn Năm (2007), Phạm Ngọc Thạch Đàm Văn Phải (2007) lợn theo mẹ có tỷ lệ ốm chết cao Lợn sau cai sữa, lợn vỗ béo có tỷ lệ chết cao thứ Nái nuôi nái mang thai có tỷ lệ ốm, chết thấp Bệnh tích tập trung phổi Các ổ viêm thường gặp thuỳ đỉnh, song thấy thuỳ khác không xuất đối xứng Các ổ viêm, áp xe thường có màu xám đỏ, rắn, Mô phổi lồi có màu đỏ xám loang lổ tuyến ức hay đá granito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi bị phù nề tích nước nặng PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Bộ môn bệnh lý thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thời gian: từ tháng 6/2014 tới 12/2016 3.2 ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ mẫu bệnh phẩm thu thập từ 02 trang trại thuộc tỉnh Hải Dương Hưng Yên vào năm 2013 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ, hóa chất, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào Khôi phục tế bào; Cấy chuyển tế bào; Thu tế bào 3.4.2 Phƣơng pháp gây nhiễm virus Gây nhiễm virus lên môi trường tế bào; Quan sát bệnh tích tế bào; Thu virus 3.4.3 Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) Tế bào Marc 145 chuẩn bị khay 96 giếng (2,0 x 104 tế bào/giếng) Huyễn dịch virus pha loãng theo số 10 đem ủ bề mặt tế bào lớp giếng theo thứa tự đánh dấu trước (25µl/giếng), độ pha loãng lặp lại lần Sau ủ, dung dịch trì DMEM (10% TBP) bổ sung vào (100 µl/giếng) CPE quan sát hàng thứ sau gây nhiễm TCID50 xác định theo công thức Spearman-Karber 3.4.4 Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn nhân lên virus Tế bào Marc 145 chuẩn bị vào khay 96 giếng (5×104 tế bào/giếng) nuôi mô tả Virus PRRS phân lập chủng virus vắc-xin gây nhiễm lên tế bào MOI = 0.01 Sau ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus hút bỏ môi trường nuôi dưỡng rửa 0.5 ml PBS Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng Virus giải phóng tế bào virus tế bào thu riêng từ dịch phần tế bào lại bình gây nhiễm thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 sau gây nhiễm virus Tiến hành xác định hiệu giá ống virus thu để định lượng virus Đường biểu biễn nhân lên virus xây dựng có biến log10 TCID50 thời điểm thu virus 3.4.5 Phƣơng pháp RT-PCR Quy trình tách chiết RNA tổng số thực theo hướng dẫn kèm Kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức) Mẫu RNA sau tách chiết tiến hành phản ứng RT-PCR theo Kit Qiagen One-step RT-PCR 3.4.6 Phƣơng pháp Realtime RT-PCR Thự phản ứng Realtime RT-PCR theo TCVN 8400-21:2014 3.4.7 Phƣơng pháp giải trình tự gene Trong nghiên cứu sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm tiến hành Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y Quá trình thực giải trình tự bao gồm bước: Tinh sản phẩm phản ứng RT-PCR, thực phản ứng PCR sequence, tinh sản phẩm PCR sequence 3.4.8 Phƣơng pháp gây bệnh thực nghiệm Bước 1: Chọn lợn Bước 2: Theo dõi lợn trước gây nhiễm Bước 3: Gây nhiễm cho lợn Bước 4: Theo dõi lợn sau gây nhiễm 3.4.9 Phƣơng pháp khám lâm sàng Tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê biểu lợn số ổ dịch từ xuất dấu hiệu bệnh lý đến hết thời gian theo dõi 3.4.10 Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể Lợn thí nghiệm mổ khám theo quy trình quy định TCVN 8402:2010 3.4.11 Phương pháp làm tiêu vi thể quan sát bệnh tích tiêu Thực theo quy trình làm tiêu vi thể môn Bệnh lý Thú y 3.4.12 Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch Thực theo quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3.4.13 Xử lý số liệu Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại sở trình tự gene chủng virus thu nhận phần mềm Genetyx MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) Để xử lý số liệu thống kê như: thân nhiệt lợn thí nghiệm trước sau gây nhiễm, hàm lượng kháng thể lợn thí nghiệm, luận án sử dụng Microsoft Office Excel 2007 để phân tích sớm 24 sau gây nhiễm Bệnh tích tế bào chủng virus PRRS HUA 02 xuất sau 36 gây nhiễm tế bào bị phá hủy nhiều 60 đến 84 sau gây nhiễm Bảng 4.4 Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 qua đời cấy chuyển Virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 Đời 3,16 x 105 1,74 x 106 Hiệu giá (TCID50/25µl) Đời 6,67 x 105 1,74 x 106 Đời 3,16 x 105 1,74 x 106 4.1.4 Kết nghiên cứu xác định đƣờng biểu diễn nhân lên 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 Cả chủng virus vắc-xin 02 chủng virus nghiên cứu thể chúng xâm nhập nhân lên tế bào mạnh hay yếu tùy thời điểm định Như vậy, nhân lên virus nuôi cấy môi trường tế bào trình liên tục đồng Trong đó, thời điểm phát triển mạnh tế bào hay tế bào chủng virus không giống hoàn toàn toàn thời gian sau đem gây nhiễm virus môi trường tế bào Marc 145 Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Lan Lương Quốc Hưng (2012) Nguyễn Bá Hiên cs (2015) Hình 4.1 Hình biểu diễn nhân lên chủng virus PRRS HUA 01 Hình 4.2 Hình biểu diễn nhân lên chủng virus PRRS HUA 02 11 Qua nghiên cứu số đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02, thấy chủng virus PRRS nghiên cứu chủng virus PRRS vắc-xin có khả gây bệnh tích tế bào môi trường Marc 145, có quy luật nhân lên môi trường tế bào giống Virus giải phóng tế bào có hiệu giá cao virus tế bào Thời điểm hiệu giá virus đạt cao xác định khoảng 60 đến 84 sau gây nhiễm 4.1.5 Nghiên cứu khả gây bệnh 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 4.1.5.1 Kết xét nghiệm lợn trước gây nhiễm virus Các lợn thí nghiệm chọn có thân nhiệt ngưỡng sinh lý bình thường, hàm lượng kháng thể kháng virus PRRS, mặt virus gây bệnh thể 4.1.5.2 Kết gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 cho lợn thí nghiệm a Kết nghiên cứu tiêu virus huyết thân nhiệt lợn gây bệnh thực nghiệm * Kết nghiên cứu tiêu virus huyết lợn gây bệnh thực nghiệm Kết cho thấy chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 sau ngày gây nhiễm thứ có xuất virus PRRS máu, đến ngày thứ sau gây nhiễm thấy virus xuất dịch ngoáy mũi lợn thí nghiệm Trong đó, lợn đối chứng cho kết âm tính hoàn toàn khỏe mạnh Hàm lượng virus máu đạt cao ngày số lô gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 đạt cao ngày số lô gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 * Thân nhiệt lợn gây bệnh thực nghiệm PRRSV Hình 4.3 Thân nhiệt trung bình lợn sau gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (0C) Lợn thí nghiệm gây nhiễm sau ngày, nhiệt độ dao động phạm vi sinh lý bình thường, sau - ngày gây bệnh, lợn bắt đầu có biểu 12 sốt, theo nghiên cứu này, thân nhiệt trung bình lợn thí nghiệm đạt mức cao vào ngày số sau gây nhiễm sốt kéo dài khoảng 13 ngày Kết nghiên cứu phù hợp với công bố Ishibata et al (2000), Li et al (2014) Nguyễn Thị Lan cs (2014) b Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể lợn thí nghiệm Tiến hành kiểm tra tạo kháng thể kháng virus PRRS phương pháp ELISA để đánh giá khả kích thích miễn dịch 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02, kết thể hình 4.4 Hình 4.4 Hàm lƣợng kháng thể trung bình lợn thínghiệm đƣợc gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 Lô TN1: Lô lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 Lô TN2: Lô lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 Lô ĐC: Lô lợn đối chứng lô đối chứng Từ ngày thứ sau gây nhiễm thấy xuất kháng thể kháng virus PRRS thể lợn TN1.2, TN1.3 lô gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 lợn TN2.1, TN2.2 lô gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 Kháng thể tạo kháng thể kháng lại chủng virus PRRS HUA 01, chủng virus PRRS HUA 02 gây nhiễm Đến ngày thứ tất lợn thí nghiệm xuất kháng thể kháng virus PRRS chủng gây nhiễm Hàm lượng kháng thể tăng dần đạt cao vào ngày thứ 13 sau gây nhiễm tất lợn thí nghiệm c Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn gây nhiễm thực nghiệm chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Triệu chứng chủ yếu mắc PRRS bao gồm: sốt cao, ho, khó thở, tím tai, sưng mí mắt, chảy nước mũi, phát ban, táo bón tiêu chảy Kết nghiên cứu phù hợp với công bố Halbur et al (1995), Kim et al (2015), Leng et al (2012) Park et al (2014) 13 Hình 4.5 Mí mắt sƣng, có nhiều rử Hình 4.6 Lợn xuất huyết d Nghiên cứu biến đổi bệnh lý lợn thực nghiệm * Kết bệnh t ch đại thể lợn gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Kết thúc thí nghiệm tiến hành mổ khám lợn thí nghiệm để quan sát bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm 02 chủng virus PRRS nghiên cứu Bảng 4.5 Bệnh tích đại thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Lô gây nhiễm PRRS HUA 01 5/5 5/5 4/5 5/5 4/5 5/5 3/5 5/5 4/5 Tỷ lệ % (+) 100 100 80 100 80 100 60 100 80 Lô gây nhiễm PRRS HUA 02 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 5/5 4/5 5/5 4/5 Tỷ lệ % (+) 100 100 100 100 80 100 80 100 80 Xuất huyết 5/5 100 5/5 Sung huyết 5/5 100 Xuất huyết 5/5 100 Cơ quan Bệnh tích quan Phổi Viêm kẽ phổi Phổi xuất huyết Mặt cắt phổi nhớt Viêm màng phổi Viêm phổi hóa mủ Phổi hoại tử Phổi nhục hóa Phổi tụ máu Khí phế thũng Hạch phổi Hạch amidan STT 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Tỷ lệ % (+) 0 0 0 0 100 0/6 5/5 100 0/6 5/5 100 0/6 Lô đối chứng Kết cho thấy mổ khám lợn thí nghiệm 02 lô gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 chủng virus PRRS HUA 02 có biểu bệnh tích phổi, hạch lympho chiếm tỷ lệ cao Các bệnh tích chủ yếu phổi viêm, xuất huyết, mặt cắt phổi nhớt, phổi tụ máu, viêm kẽ phổi, có nhiều dịch viêm lòng phế quản, hạch phổi hạch amidan: sưng, xuất huyết, hạch ruột xuất huyết, lách sưng, thận xuất huyết Kết phù hợp với nhận định nhiều tác giả nghiên cứu 14 Phạm Ngọc Thạch Đàm Văn Phải (2007), Done et al (1996) Nguyễn Thị Lan cs (2010) Hình 4.7 Hạch bẹn nông sưng, xuất huyết Hình 4.8 Phổi xuất huyết * Kết bệnh t ch vi thể lợn gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Kết bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6 Bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Lô gây Lô gây nhiễm PRRS nhiễm HUA 01 PRRS HUA STT Cơ quan Bệnh tích quan (n=15) 02 (n=15) Tỉ lệ Tỉ lệ n+ n+ % % Xuất huyết 15 100 15 100 Sung huyết 15 100 15 100 Phổi Thâm nhiễm tế bào viêm 15 100 15 100 Phế quản- phế viêm 13 86,7 15 100 15 100 15 100 Hạch Xuất huyết 15 100 15 100 lympho Sung huyết Tăng sinh nang lympho 12 80 15 100 Sung huyết 40 46,7 Gan Thoái hóa tế bào 60 12 80 13 86,7 15 100 Lách Xuất huyết Thoái hóa tế bào 13 86,7 13 86,7 Viêm kẽ thận 14 93,3 15 100 Thận Sung huyết 14 93,3 14 93,3 Xuất huyết 12 80 14 93,3 Lô đối chứng (n=18) n+ 0 0 0 0 0 0 0 Tỉ lệ % 0 0 0 0 0 0 0 Ghi chú: n+ số tiêu có bệnh tích vi thể Qua kết bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02, thấy biểu bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm tập trung chủ yếu phổi, hạch lympho 15 bệnh tích có gan, lách, thận, ruột, não, dày tim Mức độ nặng nhẹ bệnh tích vi thể 02 lô thí nghiệm tương tự e Kết nghiên cứu phân bố virus PRRS lợn thực nghiệm Để xác định phân bố virus PRRS quan lợn, tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch nhằm xác định có mặt kháng nguyên PRRSV Bảng 4.7 Kết xác định virus PRRS lợn gây bệnh thực nghiệm phƣơng pháp hóa mô miễn dịch Lô gây nhiễm Lô gây nhiễm Lô đối chứng PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 (n=18) (n=15) (n=15) n+ Tỉ lệ % n+ Tỉ lệ % n+ Tỉ lệ % +++ 12 80 13 86,67 0 Phổi ++ 20 13,33 0 0 0 18 100 +++ 13 86,67 13 86,67 0 Hạch lympho ++ 13,33 13,33 0 0 0 18 100 ++ 46,67 60 0 Lách + 46,67 40 0 6,66 0 18 100 ++ 46,67 60 0 Thận + 40 40 0 13,33 0 18 100 Gan + 12 80 14 93,33 0 20 6,67 0 Ruột + 13 86,67 13 86,67 0 13,33 13,33 18 100 Ghi chú: +++ : Đám, hạt bắt màu nâu vàng nhiều rõ; + : Đám, hạt bắt màu nâu vàng ít; ++ : Đám, hạt bắt màu nâu vàng trung bình - : Không có đám, hạt bắt màu nâu vàng n: Số tiêu hóa mô miễn dịch ST T Cơ quan Mức độ phân bố virus Chúng phát virus phổi, hạch, tim, lách, gan, thận, ruột non, dày, não Tỷ lệ nhiễm cao xác định phổi, thấp mẫu dày, não Ở phổi, kháng nguyên virus tập trung nhiều đại thực bào vùng phổi, tế bào biểu mô vách phế nang, phế quản Tại hạch lympho: virus phân bố lan tràn toàn tổ chức hạch lympho Virus nằm tế bào bạch cầu, lâm ba cầu, tế bào lympho Ngoài virus phân bố số quan khác như: lách, thận, gan,… Qua kết nhuộm hóa mô miễn dịch quan lợn gây 16 nhiễm virus PRRS chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 tương tự mức độ vị trí phân bố virus quan 4.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM 4.2.1 Kết phản ứng RT-PCR Sau tách chiết RNA từ chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02, tiến hành thực phản ứng RT-PCR với cặp mồi phát gene ORF5 phát gene ORF7 720pb 372pb A B Hình 4.9 Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) ORF5 (hình B) [Hình A: Đoạn gene ORF7 có kích thước 372bp; Hình B: Đoạn gene ORF5 kích thước 720bp, thang chuẩn M 100bp; Từ trái qua phải: giếng 1: PRRS HUA 01, giếng 2: PRRS HUA 02, giếng 3: đối chứng âm, giếng 4: đối chứng dương] Qua hình A, B kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 02 chủng nghiên cứu với cặp mồi ORF7 cặp mồi ORF5 Vạch band DNA phát sáng có kích thước 372bp trùng với thiết kế đoạn mồi ORF7 720 bp trùng với thiết kế cặp mồi ORF5 4.2.2 Kết giải trình tự gene chủng virus PRRS nghiên cứu Cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, đỉnh màu giản đồ xác nhận loại nucleotide, nucleotide khác tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác đọc tia laser cho hiển thị màu tương ứng Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh cây, Cytosine cho màu đen Chuỗi gene đoạn ORF7 có độ dài 372bp chuỗi gene đoạn ORF5 có độ dài 603bp Như việc tách chiết RNA tổng số, trình thực RT-PCR giải trình tự thực thành công 4.2.3 Kết truy cập ngân hàng gene 4.2.3.1 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn ORF7 02 chủng virus nghiên cứu số chủng tham chiếu Đoạn gene ORF7 qua xử lý trình tự gene thu đoạn gene có độ dài 372bp chủng nghiên cứu chủng virus tham chiếu Qua việc so 17 sánh trình tự nucleotide chủng virus PRRS chủng virus tham chiếu, 34 vị trí sai khác nucleotide trình bày hình 4.10 Hình 4.10 Kết so sánh trình tự gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu 4.2.3.2 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn ORF5 02 chủng virus nghiên cứu số chủng tham chiếu Chúng nhận thấy trình tự gene ORF5 chủng virus nghiên cứu giải trình tự gene có sai khác tương đối thành phần nucleotide với khác so với chủng virus tham chiếu Đoạn gene ORF5 qua xử lý trình tự gene thu đoạn gene có độ dài 603bp chủng nghiên cứu chủng virus tham chiếu Qua việc so sánh trình tự nucleotide chủng virus PRRS chủng virus tham chiếu, 75 vị trí sai khác nucleotide trình bày hình 4.11 Như vậy, so sánh thành phần nucleotide đoạn gene ORF7 hai chủng nghiên cứu chủng tham chiếu chủng có độ sai khác nucleotide 9,13% tổng số nucleotide đoạn gene ORF5 12,43% tổng số nucleotide 18 Hình 4.11 Kết so sánh trình tự gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 4.2.3.3 Kết so sánh trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu Sau xác định trình tự nucleotide cần xác định tiếp thành phần amino acid đoạn gene để có kết xác biến đổi mức độ phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 Kết đề tài cho thấy chủng virus PRRS nghiên cứu chủng virus tham chiếu có sai khác trình tự amino acid mã 19 hóa tương ứng từ đoạn gene ORF7 10 vị trí đoạn gene ORF5 tương 32 vị trí Điều dẫn đến sai khác tính kháng nguyên chủng virus PRRS nghiên cứu 4.2.4 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide chủng virus nghiên cứu Qua kết giải trình tự đoạn gene ORF7 ORF5 chủng PRRS nghiên cứu, tiến hành xử lý chương trình MEGA6 để so sánh mức độ tương đồng nucleotide chủng nghiên cứu tham chiếu với chủng virus vắc-xin Kết trình bày bảng 4.8 4.9 Bảng 4.8 Sự tƣơng đồng trình tự nucleotide gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%) PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 HENZK1/ China/2014 HCM.D06/ Vietnam/2010 ATCC_VR2332 JXA1 PRRS HUA 01 100,00 98,64 PRRS HENZK1/ HCM.D06/ ATCC_ HUA 02 China/2014 Vietnam/2010 VR2332 JXA1 100,00 98,37 99,73 100,00 96,43 97,34 97,03 100,00 93,13 98,92 93,44 99,73 93,13 99,46 91,57 97,65 100,00 93,74 100,00 Bảng 4.9 Sự tƣơng đồng trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%) PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 HCMC-3336/ Vietnam/2010 ZQ5-GD-11/ China/2014 ATCC_VR2332 JXA1 PRRS PRRS HCMC-3336/ Hua 01 Hua 02 Vietnam/2010 100,00 97,29 100,00 99,67 97,29 100,00 97,98 87,98 98,32 99,33 87,41 98,66 97,98 87,97 98,66 ZQ5-GD-11/ ATCC_ China/2014 VR2332 100,00 88,20 99,33 JXA1 100,00 88,19 100,00 Kết cho thấy chủng PRRS nghiên cứu có mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 gene ORF5 đạt tỷ lệ cao 98,64% - 100% 97,29% - 100% Như thành phần nucleotide chủng giống tương đối cao Sự tương đồng nucleotide gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ 93,13% - 99,73% 87,41% - 99,67% Điều cho thấy gần gũi mối quan hệ di truyền chủng PRRS nghiên cứu chủng virus tham chiếu 20 4.2.5 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu Dựa mã hóa nên amino acid tương ứng từ gene ORF7 gene ORF5, phần mềm phân tích kết trình bày bảng 4.10, bảng 4.11 Bảng 4.10 Sự tƣơng đồng amino acid mã hóa từ gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%) PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 HENZK1/China/2014 HCM.D06/Vietnam/2010 ATCC_VR2332 JXA1 PRRS PRRS HENZK1/ HCM.D06/Vi ATCC_ JXA1 HUA 01 HUA 02 China/2014 etnam/2010 VR2332 100,00 100,00 100,00 99,20 99,20 100,00 93,99 95,07 94,06 100,00 95,15 95,15 94,32 83,10 100,00 100,00 100,00 99,20 96,07 95,15 100,00 Bảng 4.11 Sự tƣơng đồng amino acid mã hóa từ gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%) PRRS PRRS HCMC-3336/ ZQ5-GD-11/ ATCC_ Hua 01 Hua 02 Vietnam/2010 China/2014 VR2332 JXA1 PRRS HUA 01 100,00 PRRS HUA 02 94,26 100,00 HCMC-3336/ Vietnam/2010 98,97 94,28 100,00 ZQ5-GD-11/ China/2014 96,37 97,94 96,38 100,00 ATCC_VR2332 87,51 84,24 87,55 86,51 100,00 JXA1 96,89 96,38 97,94 98,46 87,05 100,00 Kết cho thấy chủng PRRS nghiên cứu có mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 đạt tỷ lệ cao 100,0% 94,26% - 100,0% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động 93,99% - 100% 84,24% - 98,97% Điều cho thấy tương đồng kết so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide trình tự amino acid 4.2.6 Kết xây dựng sinh học phân tử chủng virus nghiên cứu 4.2.6.1 Kết xây dựng phả hệ gene ORF5 Từ kết phân tích nguồn gốc phát sinh loài theo sai khác nucleotide gene ORF5 hình 4.12 cho thấy: chủng virus PRRS HUA 01và PRRS HUA 02 mà nghiên cứu nằm nhánh phát sinh thuộc sublineage 8.7 thuộc lineage 21 AB856285/Viet nam/2012/HUA-Vet lab P RRS3 HQ540646/HCMC-3336/Viet nam/2010 61 JQ860389/Viet nam/2012/DT JQ860378/Viet nam/2010/DN11 HUA-P RRS-01 AB856287/Viet nam/2013/HUA-Vet lab P RRS5 45 AB856284/Viet nam/2011/HUA-Vet lab P RRS2 JQ860362/Viet nam/2008/DN444 JQ860382/Viet nam/2012/CT C1 84 53 JQ860391/Viet nam/2012/HG.RV2 AB856286/Viet nam/2012/HUA-Vet lab P RRS4 KM244763/Viet nam/2013/MN1 AB856283/Viet nam/2011/HUA-Viet labP RRS1 77 LC102500/Viet nam/2015/KT Y P RRS 02 55 JQ860372/Viet nam/2009/DN292 52 Sublineage 8.7 JQ860375/Viet nam/2010/DN1 Lineage EF112445/China/2006/JXA1 KP 771739/China/2014/NVDC-SC1-2014 LC102501/Viet nam/2015/KT Y P RRS 03 34 KC263023/China/2011/HUAY2-11 99 66 KU556995/China/2014/HENHB1 45 JN642707/China/2010/SHZ-2010 KC263033/ZQ5-GD-11/China/2014 KF699846/Viet nam/2013/HUA/HP 76 61 LC102499/Viet nam/2015/KT Y P RRS 01 98 HUA-P RRS-02 FJ536165/China/2004/NB/04 35 AY032626/China/1995/CH-1a EF532801/USA/2004/INGELVAC AT P 12 AF176476/USA/2000/P RRSV55 AF339494/USA/2001/98-31701-1 21 22 AY656993/USA/2005/SDSU73 Lineage EU556160/USA/2008/2000-5424 U66380/USA/1996/34075-NE Lineage 23 U87392/USA/1990/AT CC VR-2332 43 96 11 Lineage AB546105/Japan/2008/Miyagi08-2 AF121131/T aiwan/1997/MD-001 AY297118/T hailand/2002/02SP 10 48 Lineage GU187014/Singapore/2009/BCL-P S 100 DQ779791/USA/1998/P rime-P ac Lineage Lineage Lineage EU758940/USA/2007/P RRSV0000008973 M96262/Net herlands/1991/Lelyst ad virus Lineage PRRSV type 0.2 Hình 4.12 Cây sinh học phân tử dựa trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu Hai chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 nằm line khác với line từ đến line thuộc PRRS type (Bắc Mỹ), khác với nhánh phát sinh chủng PRRS type (Châu Âu) 4.2.6.2 Kết xây dựng phả hệ gene ORF7 Chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 mà nghiên cứu nằm nhánh phát sinh thuộc Line Khác với line line thuộc PRRS type (Bắc Mỹ), khác với nhánh phát sinh chủng PRRS type (Châu Âu) Kết luận: Hai chủng nhánh với chủng độc lực cao Trung Quốc thuộc PRRS type (Bắc Mỹ) Điều chứng tỏ có lây truyền bệnh qua biên giới quốc gia giới 22 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Kết nghiên cứu đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS HUA 01 virus PRRS HUA 02 - 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 thích nghi tốt gây bệnh tích tế bào môi trường tế bào Marc 145 - Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 24 gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, sau 36 sau gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 CPE đạt 100% 60 bong tróc hoàn toàn 72 sau gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 CPE đạt 80% 60 100% 72 sau gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 Từ 84 – 108 sau gây nhiễm tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy - Cả chủng virus PRRS nghiên cứu chủng virus PRRS vắc-xin có quy luật nhân lên môi trường tế bào giống Virus giải phóng tế bào có hiệu giá cao virus tế bào - Thời điểm hiệu giá virus đạt cao xác định khoảng 60 đến 84 sau gây nhiễm - Kết khả gây bệnh 02 Chủng PRRS HUA 01 PRRS HUA 02: + 02 chủng PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 gây nhiễm lợn thí nghiệm có độc lực với triệu chứng bệnh tích điển hình lợn mắc PRRS Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn gây nhiễm là: sốt, ho, khó thở, giảm ăn, phát ban, sưng phù mí mắt + Chỉ tiêu virus huyết: sau gây nhiễm 03 ngày xuất virus PRRS máu sau 05 ngày thấy virus xuất dịch ngoáy mũi, virus kéo dài máu đến hết thời gian theo dõi thí nghiệm (21 ngày) + Bệnh tích đại thể chủ yếu lợn thí nghiệm: phổi viêm, xuất huyết hạch lympho: sưng, tụ máu, xuất huyết Thận xuất huyết điểm Lách nhồi huyết + Bệnh tích vi thể chủ yếu lợn thí nghiệm: Phổi xuất huyết, phế quản - phế viêm, tế bào viêm tràn lan phổi Hạch lympho xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, nang lympho tăng sinh Thận có tượng viêm kẽ thận, xuất huyết + Sự phân bố virus nghiên cứu qua phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy lợn gây nhiễm thực nghiệm, virus PRRS tập trung chủ yếu hạch lympho phổi 2) Kết nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 - Đã xác định trình tự nucleotide amino acid đoạn gene ORF5 ORF7 02 chủng virus PRRS nghiên cứu Đoạn gene ORF5 có kích 23 thước 603 bp mã hóa cho 200 amino acid Glycoprotein (GP5) Đoạn gene ORF7 có kích thước 372 bp mã hóa cho 123 amino acid protein N - Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 ORF5 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ cao 98,64% - 100% 97,29% - 100% - Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ 93,13% - 99,73% 87,41% - 99,67% - Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 02 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ cao 100,0% 94,26% - 100,0% - Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động 93,99% - 100% 84,24% - 98,97% Điều cho thấy tương đồng kết so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide trình tự amino acid - Hai chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 có nhánh phát sinh với chủng độc lực cao Trung Quốc thuộc PRRS type (Bắc Mỹ) Cả hai chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình, nên lựa chọn hai chủng virus nghiên cứu làm chủng virus tiềm quỹ gene Học viện, nhằm phục vụ cho việc chọn chủng giống gốc để sản xuất vắc-xin PRRS, đánh giá hiệu lực loại vắc-xin PRRS Việt Nam, chế phẩm sinh học kít chẩn đoán nhanh, kháng nguyên dùng chẩn đoán,… nhằm phòng, trị bệnh PRRS 5.2 KIẾN NGHỊ Đề nghị tiếp tục tiến hành nghiên cứu sâu ổn định đặc tính sinh học, sinh học phân tử, tính kháng nguyên khả gây bệnh 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 qua nhiều đời cấy chuyển để lựa chọn chủng giống gốc để sản xuất vắc-xin phòng PRRS Đề nghị mở rộng nghiên cứu chủng virus PRRS phân lập số tỉnh thuộc miền Trung, miền Nam so sánh đặc tính sinh học, khả gây bệnh xây dựng sinh học phân tử, đồ dịch tễ để có nhìn tổng quát mối quan hệ di truyền chủng virus lưu hành vùng, miền Việt Nam, nhằm lựa chọn chủng virus đại diện cho chủng virus gây bệnh nước để sản xuất vắc-xin sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phục vụ cho công tác chẩn đoán, phòng trị bệnh cho lợn 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lê Thị Toan, Nguyễn Thị Lan, Lương Quốc Hưng, Lê Huỳnh Thanh Phương Phạm Công Hoạt (2016) Tính kháng nguyên chủng virus HUA-PRRS01 phân lập Việt Nam Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, tập 14, số 9: 1402-1409 Lê Thị Toan, Nguyễn Thị Lan, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Ngọc Nguyễn Thị Hoa (2016) Nghiên cứu độc lực chủng virus PRRS HUA 02 phân lập miền Bắc Việt Nam lợn Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, tập 14, số 12: 1919-1933 ... yếu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Xác định số đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 02 chủng virus PRRS HUA. .. nhiễm virus PRRS chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 tương tự mức độ vị trí phân bố virus quan 4.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH... 4.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM 4.1.1 Kết nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) 02 chủng virus PRRS HUA 01,