Header Page of 126 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HOÀNG THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2014 Footer Page of 126 Header Page of 126 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hoàng Thị Lan Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2013 Footer Page of 126 Header Page of 126 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam- người thầy định hướng, truyền dạy kiến thức khoa học giúp đỡ vượt qua trở ngại khó khăn suốt thời gian thực luận án Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp hoàn thành thủ tục cần thiết trình làm nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành PGS TS Vũ Mạnh Hùng- Học viện Quân Y, PGS TS Nguyễn Văn Chương, Chủ nhiệm Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103, ThS Nguyễn Thị Hương-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, TS Đoàn Lan Phương- Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên giúp đỡ số thử nghiệm động vật thực nghiệm, phân tích thành phần hàm lượng axít béo không bão hoà Bên cạnh đó, nhận giúp đỡ, bảo tận tình cô chú, anh chị, bạn đồng nghiệp làm việc phòng Công nghệ Tảo: TS Hoàng Thị Minh Hiền, ThS Ngô Thị Hoài Thu, ThS Đinh Thị Ngọc Mai, KS Lê Thị Thơm, KS Nguyễn Cẩm Hà, KTV Đỗ Thị Là, ThS Đinh Đức Hoàng, ThS Bùi Đình Lãm, ThS Hoàng Sỹ Nam, ThS Nguyễn Đình Hưng Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Luận án thực khuôn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu đánh giá khai thác hoạt chất từ tảo biển” (2007-2008) đề tài “Nghiên cứu xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng Việt Nam nuôi sinh khối số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn nuôi trồng thuỷ sản” (20082010) thuộc chương trình công nghệ sinh học thủy sản Bộ NN PTNT PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Lan Anh Footer Page of 126 Header Page of 126 ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Lan Anh Footer Page of 126 Header Page of 126 iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Hệ thống phân loại, kĩ thuật phân lập định tên chi Schizochytrium 1.1.1 Hệ thống phân loại 1.1.2 Kĩ thuật phân lập định tên 1.1.2.1 Kĩ thuật phân lập 1.1.2.2 Các kĩ thuật định tên 1.2 Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA) 1.2.1 Giới thiệu chung -3 PUFA 1.2.2 Vai trò -3 PUFA sức khoẻ người 1.2.3 Sản xuất ω-3 PUFA từ vi tảo 12 1.3 Đặc điểm sinh học chi Schizochytrium 14 1.3.1 Đặc điểm sinh thái 14 1.3.2 Ảnh hưởng số yếu tố lên sinh trưởng, tích lũy lipit -3 14 PUFA Schizochytrium 1.3.2.1 Ảnh hưởng nguồn C N 14 1.3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ muối 16 1.3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 17 1.3.3 Con đường sinh tổng hợp DHA chi Schizochytrium 20 1.4 Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng nói chung chi 23 Schizochytrium nói riêng cho sản xuất -3 PUFA 1.4.1 Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng cho sản xuất -3 PUFA 23 1.4.2 Sản xuất DHA quy mô lớn chi Schizochytrium 25 Footer Page of 126 Header Page of 126 iv 1.5 1.5.1 Những ứng dụng sinh khối chi Schizochytrium Ứng dụng nuôi trồng thủy sản 1.5.2 Sản xuất thức ăn cho gia súc, gia cầm 31 1.5.3 Sản xuất dầu sinh học giàu omega-3 32 1.5.4 Sản xuất nhiên liệu sinh học 33 1.6 Tình hình nghiên cứu vi tảo biển dị dƣỡng Việt Nam 34 27 27 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu 37 2.1.1 Mẫu vật 37 2.1.2 Vi sinh vật 37 2.1.3 Các sinh phẩm 37 2.1.4 Động vật thí nghiệm 37 2.2 Hoá chất 38 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 38 2.4 Môi trƣờng 39 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.5.1 Phân lập chi Schizochytrium 40 2.5.2 Chụp ảnh hình thái tế bào kính hiển vi điện tử quét (SEM) 40 2.5.3 Các phương pháp sinh học phân tử 41 2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ chủng Schizochytrium spp 41 2.5.3.2 Nhân gen kỹ thuật PCR 41 2.5.3.3 Tinh sản phẩm PCR 42 2.5.3.4 Tách dòng gen 42 2.5.3.5 Xác định trình tự gen 44 2.5.4 Xác định sinh trưởng chủng Schizochytrium spp 44 Footer Page of 126 Header Page of 126 v 2.5.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng Schizochytrium spp 45 2.5.6 Xác định hàm lượng lipít sinh khối tảo 45 2.5.7 Phân tích thành phần hàm lượng axít béo sinh khối Schizochytrium spp 46 2.5.8 Phương pháp nhuộm lipít b ng ile ed 46 2.5.9 Phương pháp xác định đường khử b ng DNSA 46 2.5.10 Nghiên cứu tính an toàn viên Algal Omega -3 47 2.5.10.1 Nghiên cứu độc tính cấp Algal Omega -3 47 2.5.10.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 47 2.5.11 Nghiên cứu hiệu lực chế phẩm Algal Omega- 49 2.5.11.1 Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn mê lộ 49 2.5.11.2 Nghiên cứu mô hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện 49 2.5.11.3 Nghiên cứu mô hình gây suy giảm lực tâm thần kinh 51 2.5.12 Nghiên cứu sử dụng sinh khối tảo S mangrovei PQ6 làm giàu luân 51 trùng (Brachionus plicatilis) Artemia 2.5.12.1 Xác định lượng tảo thời gian làm giàu thích hợp cho luân trùng Artemia 51 2.5.12.2 So sánh việc sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 tươi, khô chất cường hoá Golden Power việc làm giàu Artemia 52 2.5.12.3 So sánh việc sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 tươi, men bánh mì vi tảo biển quang tự dưỡng 52 2.5.12.4 Sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) 53 2.5.12.5 Nghiên cứu sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 làm giàu Artemia 56 làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 2.6 Footer Page of 126 Xử lý số liệu 57 Header Page of 126 vi Chƣơng III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm sinh học đại diện thuộc chi vi tảo biển 58 58 Schizochytrium 3.1.1 Phân lập chủng Schizochytrium spp từ mẫu thu thập 58 vùng rừng ngập mặn Việt Nam 3.1.2 Tuyển chọn số chủng thuộc chi Schizochytrium tiềm cho việc sản xuất DHA 59 3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng thuộc chi 61 Schizochytrium tiềm 3.1.3.1 Một số đặc điểm hình thái điển hình 61 3.1.3.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng tiềm 63 3.1.3.3 Phân tích hàm lượng lipít, axít béo tổng số DHA chủng tiềm 68 3.1.3.4 Bảo quản giống 70 3.1.4 Phân loại chủng tiềm 72 3.1.4.1 So sánh số đặc điểm hình thái chủng tuyển chọn với số 72 loài đại diện thuộc chi Schizochytrium 3.1.4.2 Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa 18S rRNA 74 3.2 Công nghệ nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 hệ thống lên men 79 3.2.1 Sinh trưởng chủng PQ6 bình lên men 10 lít 79 3.2.2 Sinh trưởng chủng PQ6 bình lên men 30 lít tự tạo 83 3.2.3 Xây dựng quy trình nuôi trồng chủng PQ6 bình lên men 30 lít tự tạo 87 3.2.4 Phân tích thành phần dinh dưỡng sinh khối vi tảo thu 89 3.3 Bƣớc đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 sản xuất viên thực phẩm chức nuôi trồng thủy sản 90 Footer Page of 126 Header Page of 126 vii 3.3.1 Sản xuất viên Algal Omega- từ sinh khối khô chủng PQ6 90 3.3.1.1 Quy trình tạo viên Algal Omega-3 90 3.3.1.2 Nghiên cứu tính an toàn hiệu lực viên Algal Omega-3 (AO-3) 93 3.3.2 Ứng dụng sinh khối chủng PQ6 nuôi trồng thủy sản 102 3.3.2.1 Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm giàu Artemia luân trùng 102 (Brachionus plicatilis) 3.3.2.2 Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu Artemia làm thức 117 ăn sống cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 3.3.2.3 Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu luân trùng 119 Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) Chƣơng IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 121 4.1 Đặc điểm sinh học chủng Schizochytrium phân lập 121 4.2 Nuôi trồng chủng tiềm PQ6 hệ thống lên men 127 4.3 Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức nuôi trồng thủy sản 135 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 139 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO 143 PHỤ LỤC Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tiếng Việt AA Arachidonic acid (C20:4-6) Axít arachidonic AO-3 Algal Omega- Algal Omega- ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase ASTM American Society for Testing and Hiệp hội vật liệu thử nghiệm Hoa Materials Kỳ CCT Chuột cống trắng Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng DHA Docosahexaenoic acid (C22:6-3) Axít docosahexaenoic DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic DO Dissolved oxygen Oxy hòa tan DPA Docosapentaeoic acid (C22:5-6) Axít docosapentaeoic E.coli Escherichia coli Vi khuẩn E.coli EPA Eicosapentaenoic acid (C20:5-3) Axít eicosapentaenoic FAME Fatty acid methyl ester Các axít béo dạng methyl ester GPYc Glucose-Polypepton- Yeast Môi trường phân lập Schizochytrium extract- chloramphenicol gồm glucose-polypepton- cao nấm men- chloramphenicol IPTG isopropylthio-β-galactoside isopropylthio-β-galactoside KLCT Khối lượng thể Khối lượng thể KLK Khối lượng khô Khối lượng khô Footer Page 10 of 126 Header Page 177 of 126 161 THESIS ABSTRACT Study on some biological characteristics and potential application of heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 Introduction Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are important components of cellular structures and functions in a wide variety of organisms Many studies have shown that the consumption of lower amount of ω-3 PUFAs enhance incidence of cardiovascular, cancer, diabetes, and neuropsychiatric diseases Among ω-3 PUFAs, DHA (docosahexaenoic acid, C22:6ω -3) plays a key role in improving neural and retinal development in infants and lowering the incidence of certain cardiovascular diseases However, humans lack enzymes needed to synthesize ω-3 PUFAs, so DHA cannot be synthesized and must be supplied through the diet Marine fish is the essential source of general PUFAs including DHA Because of oxidative stability, the presence of undesirable fatty acids, typical fishy smell, unpleasant taste as well as the possibility of heavy metal contamination, fish oil is not an ideal source of PUFAs Therefore, the finding of other alternative sources is very important to be carried out not only in Vietnam but also in the world Schizochytrium is a heterotrophic marine algal genus belonging to Stramenopiles kingdom, Labyrinthulomycota phylum, Thraustochytriidae (thraustochytrid) family These algae are spherical and unicellular The ectoplasmic network forms a branched network of plasma membrane extensions, associated with an organelle termed sagenogenetosome at the periphery of the cell Currently, apart from Crypthecodinium cohnii and Ulkenia, Schizochytrium is considered as a potential source for commercial DHA production because of fast growth, high lipid and fatty acid content, especially DHA Vietnam has a coastline of about 3200 km with the climate varying from subtropical in the northern to tropical in the southern part of the country This climate type contributes to the diversity of marine organisms including marine microalgae Footer Page 177 of 126 Header Page 178 of 126 162 such as Schizochytrium Therefore, exploitation and application of Schizochytrium genus in producing commercial DHA and in supplementary food for human and animal are a feasible prospect and potentiality in Vietnam The aims of the thesis content are (1) having a culture collection of heterotrophic marine microalgae strains which were isolated from Vietnam coasts and mangrove forest and screening some potential strains for -3 PUFA production; (2) choosing a potential strain for biomass culturing in order to make Algal Omega-3 capsule (rich in DHA content) and enrichment Artemia and rotifer after that these zooplankton were used as live feed for some marine animal’s larvae (blue crab and sea bass larvae) Methods Isolation of Schizochytrium: Heterotrophic marine microalgae Schizochytrium species were isolated from floating, decomposed leaves (Rhizophora apiculata belonging to the family of mangrove, Rhizophoraceae) found on the coast of Phu Quoc island in the Kien Giang province, mangrove forests in Tien Yen- Quang Ninh, Diem Dien- Thai Binh, Tinh Gia- Thanh Hoa, Thi Nai- Binh Dinh using the pine pollen technique reported by Yokochi et al (2001) Morphological observation: Living cells in the colony on agar plate and M1 liquid medium were observed with Olympus CX21, BX51 light microscopes and SEM (JSM-5410L, Japan) Phylogenetic classification: CCTATCAGCTGTCGATGGTA-3’ using and primers Laby Laby F: R: 5’5’- GTTAAGACTACGATGGTATCTAA-3’ to amplify a partial 18S rRNA gene from genomic DNA The PCR products were transformed into E coli DH5α by using TOPO cloning kit, then the DNA plasmids were sequenced using an autosequencerABI PRISM 3100 Avant genetic Analyzer Sequences were edited and manipulated using MEGA3 software for sequence comparison; multiple sequence alignments were performed using each of the sequences gathered from the present study and 18S rRNA sequences of Schizochytrium retrieved from GenBank Genetic distance values were calculated by using the aligned DNA sequences according to the Kimura two- Footer Page 178 of 126 Header Page 179 of 126 163 parameter model The phylogenetic tree was inferred by using the neighbor-joining (NJ) algorithm in MEGA3 software and the applied bootstrap analysis from 1,000 bootstrap replications Cell growth: The growth rate of Schizochytrium in broth medium was determined by cell density using a Burker-Turk chamber and dry cell weight (dried at 1050C until attaining constant weight) Physiological studies of Schizochytrium: The effect of carbon (glucose, saccharose, maltose, glycerol, and fructose) and nitrogen (ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium nitrate, sodium nitrate, and N-P-K fertilizer) sources, salt concentration (0.0‰-30.0‰ that of seawater), glucose (1.5%-18%), and yeast extract (0.4%-1.2%) concentrations, culture temperature (150C-370C), and initial pH (4.0-9.0) on cell growth of potential strains were determined using batch cultures in 250 mL Erlenmeyer flasks based on M1 medium in shaken flasks at 200 rpm for d of cultivation Lipid and fatty acids analysis: Total lipid content was determined by Bligh and Dyer method (1959) Composition and PUFAs content were identified using a gas chromatography HP6890 Rapid lipid quantification can be done by using the lipidspecific fluorescent dye- Nile Red (Jara et al 2003) Residual glucose concentrations: were analyzed by 3,5- dinitrosalicylic acid (DNSA) method (Miller, 1959) Safety assessment and effect of Algal Omega-3 product - Acute toxicity study of Algal Omega-3: Mice (Swiss) were given different doses of Algal Omega-3 (20-50 g/kg of body weight) They were observed for clinical signs including mortality and moribundity for 72 h and estimated death of individuals in test group and LD50 value (Abrham, 1978; Turner, 1965) - Sub-chronic toxicity study of Algal Omega- was followed to Abrham (1978), WHO and Viet Nam Ministry of Health regulations about effect and safety of natural products Effect of Algal Omega-3 was determined on body weight gain, haematologic parameters, liver and kidneys’ function, heart in rabbit Footer Page 179 of 126 Header Page 180 of 126 164 - The effect of Algal Omega-3: was determined by food- finding reflex in Labyrinthian way, conditioned-electrical shock and potential central nerve deficiency model following to Abrham (1978),Turner (1965) and Knoll (1971) Study on enrichment rotifers (Brachionus plicatilis) and Artemia with S mangrovei PQ6 biomass-live feed for some marine animal’s larvae (blue crab larvae and sea bass) - Determine optimum microalgal concentration and time needed for enrichment of rotifers and Artemia: Rotifers and Artemia were fed with S mangrovei PQ6 biomass at a range from 50 to 350 ppm Enrichment was carried out at two periods (7 and 15 hours) The total lipid and fatty acid profile in rotifers and Artemia after enrichment period were analyzed - Artemia was enriched with dried, fresh biomass of S mangrovei PQ6 and Golden Power product for 15 hours The total lipid and fatty acid profile in rotifers and Artemia after enrichment period were analyzed - Rotifers were fed on mixed algae (Isochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Chaetoceros glacilis, and Chlorella sp.) and enriched with baker’s yeast and S mangrovei PQ6 biomass The total lipid and fatty acid profile in rotifers after feeding and enrichment periods were analyzed - Artemia was enriched with S mangrovei PQ6 biomass for 15 hours after that Artemia was fed on blue crab larvae (Scylla serrata Forskal, 1775) Survival rate and interim period of larvae were compared to control (unenriched Artemia fed group) - Rotifers and Artemia were enriched with S mangrovei PQ6 biomass after that they were fed on sea bass larvae (Lates calcarifer Bloch, 1790) Survival and growth rates of larvae were compared to control (enriched with A1 DHA Selco-commercial product) Results A total of 33 Schizochytrium strains belonging to new Schizochytrium genus in Vietnam were isolated from 120 samples of floating, decomposed leaves found out in mangrove forests of Phu Quoc island- Kien Giang, Tien Yen- Quang Ninh, Diem Dien- Thai Binh, Tinh Gia- Thanh Hoa, Thi Nai- Binh Dinh Among them, four strains Footer Page 180 of 126 Header Page 181 of 126 165 including PQ6, PQ7, TH16 and TB17 were chosen based on their growth and total lipid content to conduct further researches Biomass and total lipid content ranges from 11.64 to 18.60 g dry cell weight-DCW per liter and 30.44 to 38.67% of DCW after days of cultivation The highest growth rate of these strains were obtained under optimal experimental condition as 6.0% glucose, 1.0% yeast extract, 50% artificial seawater, pH and at 280C In addition, carbon and nitrogen sources could be replaced by glycerol, ammonium acetate, sodium nitrate, or fertilizer N–P–K In optimal conditions, the fatty acid profile was estimated with the main fatty acids in all the four strains were palmitic acid (ranging from 36.95 to 42.60% of total fatty acid - TFA) and DHA (ranging from 38.07 to 43.52% of TFA) DHA yields were from 1.57 to 2.30 g/l PQ6 strain also contained a small amount of AA (arachidonic acid; C20:4) and EPA (eicosapentaenoic acid, C20:5 ω-3) less than 1% of TFA whereas both TH16 and TB17 strains possessed high DPA (docosapentaenoic acid, C22:5ω-3) content (8.74 and 8.13% of TFA, respectively) Based on nucleotide sequence analysis of partial 18S rRNA gene from genomic DNA and some morphological characteristics, PQ6, TH16, and TB17 strains were identified as a Schizochytrium mangrovei Raghukumar 1988 (re-classified into Aurantiochytrium mangrovei R Yokoyama D Honda 2007) And PQ7 strain was identified as a Schizochytrium limacinum Honda & Yokochi 1998 (re-classified into Aurantiochytrium limacinum R Yokoyama D Honda 2007) The nucleotide sequence of partial 18S rRNA gene of PQ6, PQ7, TH16 and TB17 strains were submitted to the GenBank with accession number EU728656, GU295222, EU728657, GU295221, respectively In and 10 L fermenters, after 96 hours of cultivation, dry biomass and total lipid content were 23.70 ± 0.85 and 25.34 ± 0.56 g/l; 38.56 ±1,78 and 46.23 ±1.68% of DCW DHA yields were 8.71 g/l (in L fermenter) and 11.55 g/l (in 10 L fermenter) In “home-made” 30 L fermenter, after 168 hours of cultivation, dry biomass, total lipid content and DHA yield were 29.87±2.14 g/l; 55.60±1.08 % of DCW, 4.58 g/l, respectively Footer Page 181 of 126 Header Page 182 of 126 166 Although biomass of PQ6 strain contained moderate protein and carbohydrate (14.55 and 17.78% of DCW), but it possessed high lipid content (50.60% of DCW) as well as rich in macro and micro-elements In addition, the heavy metals as Pb, Cd, As, Hg were low and within the recommended guidelines for food according to Ministry of Health (2011) Algal Omega-3 capsule made from biomass of PQ6 was studied on safety assessment and effect on animal models We could not find LD50 value It means that Algal Omega-3 was not toxic The obtained results of studying semichronic toxicity indicated that there are no significant changes on body weight, hemogram, and kidney functions in rabbit However, AST enzyme activity in liver was increased slightly Thus, it must be considered for using a long time In mouse test, Algal Omega-3 helped for formation of conditioned reflex in the short time and slowed down the extinguishable process of reflex A time for avoidance of conditioned-electrical shock and learning stable reflex in rat can be decreased by Algal Omega-3 The established reflex, however, is more stable in experimental rats than that in control In experiments with potential central nerve deficiency mouse, Algal Omega-3 also helped to fast recover their reflex The obtained results allowed us to make the conclusion that Algal Omega-3 can be used for human trail in order to increase in memory in young people and prevent from senile in old people Biomass of PQ6 strain also was used for enrichment of rotifers and Artemia The obtain results have shown that feeding on PQ6 dry biomass concentration of 300 ppm for 15 hours is optimum in the total lipid, EPA and DHA contents in enriched Artemia Lipid and EPA contents increased 1.83 and 1.64 times compared to control formula (un-enriched) DHA content reached up 2.292 % of TFA compared with no the detection of this fatty acid in control formula In case of rotifers, the optimum feeding concentration and enrichment time were 300 ppm of PQ6 dry biomass, hours, respectively Total lipid content increased in 1.38 times compared to control formula EPA and DHA contents reached up 1.308 and 7.330% of TFA compared with no the detection of these fatty acid in control formula Footer Page 182 of 126 Header Page 183 of 126 167 Golden Power - one of commercial products for enrichment of Artemia can be replaced by PQ6 fresh biomass Total lipid and DHA contents in Artermia which were enriched by PQ6 fresh biomass increased in 2.6 and 1.16 times, respectively, compared to control formula (Artemia was enriched by Golden Power) Total lipid content in rotifer enriched by PQ6 fresh biomass was higher 1.9-2.7 times more than in other formulas feeding and enrichment by photoautotrophic microalgae such as Chaetoceros gracilis, Chlorella sp., Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana and baker’s yeast DHA content in rotifer enriched by PQ6 fresh biomass reached up 1.165% of TFA compared with no the detection of this fatty acid in other formulas Survival rate of blue crab larvae that fed on Artemia enrichment was increased in 1.3 times and the interim period was shortened 1.18 times compared to control (unenriched with PQ6 fresh biomass) For sea bass, survival and growth rates of larvae which fed on rotifers and Artemia enriched with PQ6 fresh biomass increased in 1.18 and 1.17 times compared to enrich with A1 DHA Selco Footer Page 183 of 126 Header Page 184 of 126 Phụ lục Hình P1 Các ống giữ giống đưa vào bảo quản -80oC Phụ lục 2 Hình P2 Ảnh minh họa trình nuôi trồng thu hoạch sinh khối chủng PQ6 1- Giống gốc giữ thạch; 2- Nhân giống cấp I; 3, 4- Nuôi trồng hệ thống bình 10 30 l; 5- Ly tâm thu sinh khối sau lên men; 6- Sinh khối tươi chủng PQ6 bảo quản hộp nhựa Footer Page 184 of 126 Header Page 185 of 126 Phụ lục Hình P3 Quá trình sấy phun khô sinh khối chủng PQ6 tạo bột nguyên liệu sản xuất viên thực phẩm chức Phụ lục Hình P4 Viên thực phẩm chức Algal Omega-3 Footer Page 185 of 126 Header Page 186 of 126 Phụ lục Đánh giá hiệu dung nạp viên thực phẩm chức Algal Omega-3 điều trị suy nhược thần kinh- SNTK Người thực hiện: PGS TS Nguyễn Văn Chương, Chủ nhiệm Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103 Phương pháp nghiên cứu - Bệnh nhân uống viên Algal Omega - ngày, chia làm lần (sáng chiều), trước bữa ăn 10 phút, liên tục tháng khám lâm sàng, thống kê theo mẫu bệnh án thống nhất, làm xét nghiệm trước dùng Algal Omega - sau đợt điều trị tiến hành Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103, Học Viện Quân Y, Bộ Quốc Phòng - Các tiêu lâm sàng cận lâm sàng trước sau đợt điều trị so sánh với từ nhận xét tác dụng điều trị Algal Omega - Đánh giá tiêu lâm sàng - Đánh giá triệu chứng lâm sàng trước điều trị diễn biến sau điều trị: bệnh nhân tự lượng giá theo chủ quan người với mức độ khác ; - Tần số mạch: xác định cách bắt mạch động mạch quay cổ tay thời gian phút; - Huyết áp động mạch: Được đo huyết áp kế Trung Quốc, bệnh nhân tư nằm, trước đo bệnh nhân nghỉ 10 phút; - Trí nhớ, ý: Được đánh giá test tâm lý; - Đánh giá khả tập trung di chuyển ý phương pháp Schulte: Cho đối tượng xem bảng có 25 số từ - 25 xếp cách lộn xộn, sau yêu cầu đối tượng xếp lại số theo thứ tự từ nhỏ đến lớn, bấm thời gian thực bảng khác lấy giá trị trung bình Dựa vào thời gian trung bình để tính kết Footer Page 186 of 126 Header Page 187 of 126 Các tiêu cận lâm sàng - Điện não: Đánh giá số, biên độ, tần số sóng  sóng  điện não; - Điện tim: Đánh giá thay đổi điện tim; - Các số huyết học: xác định theo phương pháp thường quy ; - Các số sinh hoá máu AST, ALT, Ure, Creatinin, Bilirubin, Cholesterol,Triglycerid, Glucose phân tích khoa huyết học khoa sinh hoá – Bệnh Viện 103, Học Viện Quân Y, Bộ Quốc Phòng Các số liệu xử lý theo phương pháp thống kê thường dùng y học Kết sơ Với phương pháp trình bày phần Phương pháp nghiên cứu, tiến hành đánh giá hiệu dung nạp viên thực phẩm Algal Omega-3 việc điều trị suy nhược thần kinh 30 bệnh nhân Bệnh viện 103 có độ tuổi trung bình 38,8±3,9, chiếm chủ yếu bệnh nhân nữ (53,33%) Các đối tượng chủ yếu làm công tác hành chính, chuyên môn kỹ thuật, học tập (56,67%) với nửa số họ có thời gian mắc bệnh 13-24 tháng Sau tóm tắt số kết phần thử nghiệm 2.1 Sự biến đối triệu chứng lâm sàng Sau tháng dùng viên Algal Omega-3, triệu chứng lâm sàng bệnh nhân có biểu nặng lên; tỉ lệ không đỡ thấp (3,4 % 10,3%); tỉ lệ hết triệu chứng thay đổi khoảng 7,1% (đau đầu)- 42,86% (các nóng lạnh) Cao triệu chứng: nóng, lạnh (42,86%), vã mồ hôi (34,8%); nóng nảy cáu gắt (28,6%), buồn chán (27,6%); đau mỏi bắp (21,4%); Tỷ lệ triệu chứng đỡ nhiều thay đổi khoảng 14,29% - 75%, tỷ lệ cao triệu chứng sau: đau đầu (75%); mệt mỏi (62,1%); rối loạn giấc ngủ (62%) hay quên (57,1%) Tỷ lệ đỡ thay đổi khoảng 14,3% (đau đầu) 56,0% (lo âu căng thẳng đầu óc) Footer Page 187 of 126 Header Page 188 of 126 Nhìn chung, kết cải thiện triệu chứng lâm sàng cho thấy bệnh nhân mức độ đỡ nhiều chiếm 73,3%, tiếp đến đỡ (20%) hết triệu chứng (6,7%) tỉ lệ không đỡ nặng lên Như vậy, viên thực phẩm chức Algal Omega -3 cải thiện tốt triệu chứng bệnh nhân có hội chứng SNTK sau 01 tháng điều trị, đặc biệt hiệu triệu chứng đau đầu, mệt mỏi, rối loạn giấc ngủ, lo âu căng thẳng đầu óc hay quên 2.2 Thay đổi khả ý, trí nhớ bệnh nhân SNTK Thay đổi trí nhớ ngắn hạn sau tháng dùng viên thực phẩm chức năng: tỉ lệ bệnh nhân kiểm tra test nhớ 10 từ đạt điểm tăng thêm 40% (từ 10% lên 50%), tỉ lệ điểm test trung bình giảm 36,6% (từ 83,3 % xuống 46,7%) số điểm test trung bình tăng thêm điểm (từ 5,37  0,39 lên 6,37  0,3) Thay đổi khả tập trung di chuyển ý sau tháng điều trị: tỉ lệ tăng thêm 30% (từ 16,7% lên 46,7%), tỉ lệ trung bình giảm 26,7% (từ 76,7% xuống 50%) Thời gian trung bình hoàn thành test giảm bớt 10,74 giây (từ 55,37  10,39 xuống 44,63  4,78) Như ta thấy sau điều trị, bệnh nhân suy nhược thần kinh có trí nhớ khả tập trung di chuyển ý tốt rõ rệt so với trước điều trị 2.3 Thay đổi điện não, điện tim Biến đổi điện não: theo Vũ Đăng Nguyên 1994, nhịp  tăng mức độ hưng phấn vỏ não giảm: nhịp  giảm trạng thái tăng cường hưng phấn vỏ não Trong hội chứng suy nhược thần kinh thể cường biểu tăng hưng phấn; thể nhược biểu tăng ức chế Điện não đồ người bình thường có số  thấp Khi  tăng biểu trạng thái căng thẳng thần kinh, hưng phấn lo âu Trong suy nhược thần kinh thấy nhịp nhanh, sóng nhọn biên độ thấp; suy nhược thần kinh thể cường: sóng nhanh, pic  biên độ thấp; suy nhược thần kinh thể nhược: thấy sóng chậm biên độ thấp Footer Page 188 of 126 Header Page 189 of 126 Trong nhóm nghiên cứu thấy sóng  có tần số, số, biên độ tăng, so sánh trước sau điều trị thấy khác có ý nghĩa Tần số, số, biên độ sóng  giảm có ý nghĩa thống kê Điều cho thấy hoạt động điện não sau điều trị giảm kích thích điều hoà Biến đổi nhịp tim: nhóm nghiên cứu gặp số thay đổi điện tim như: nhịp chậm xoang, nhịp nhanh xoang, Bloc nhánh, thiếu máu tim Đây rối loạn nhịp hay gặp hội chứng suy nhược thần kinh chống định dùng thuốc Các rối loạn không thay đổi trước sau điều trị chứng tỏ viên thực phẩm chức Algal Omega - không ảnh hưởng tới hoạt động tim 2.4 Ảnh hưởng Algal Omega -3 lên số chức thể Có hai bệnh nhân có biểu đau bụng, lỏng nhẹ trình tham gia nghiện cứu, tiếp tục hoàn thành liệu trình điều trị Bệnh nhân đau bụng, lỏng tự hết mà không cần dùng thêm thuốc khác để điều trị Sau tháng điều trị, tần số tim số huyết áp động mạch bệnh nhân nhóm đối tượng nghiên cứu không thay đổi (p > 0,05) Trước điều trị tần số tim huyết áp động mạch 73,9  0,6 115,04  5,03; sau điều trị 71,1  4,11 116,9  2,3 Như vậy, viên Algal Omega -3 chưa cho thấy có ảnh hưởng đến biến đổi tần số tim huyết áp Về số lượng hồng cầu, huyết sắc tố số lượng bạch cầu thay đổi (p > 0,05) Trước điều trị số lượng hồng cầu huyết sắc tố 4,00  0,09 (x 1012/ l) 125,71  4,13 (g/ l); sau điều trị 4,07  0,05 (x 1012/ l) 124,52  3,37 (g/l) Điều chứng tỏ viên Algal Omega -3 không làm biến đổi số lượng hồng cầu, huyết sắc tố Qua xem xét chức gan thận chuyển hoá lipid, thấy hàm lượng AST, ALT, Bilirubin, ure, Creatinin, Cholesterol, Triglycerid máu không thay đổi sau tháng điều trị Footer Page 189 of 126 Header Page 190 of 126 Phụ lục hình 3.13 Thời gian nuôi pH Glucose MĐTB 0h 6,42 902,13 1,50,11 12 h 6,78 76,913,84 6,871,54 24 h 7,01 54,694,23 14,053,49 48 h 7,53 53,693,89 36,603,05 72 h 7,84 45,703,70 43,182,86 96 h 7,93 24,044,25 46,502,61 120 h 8,05 20,403,12 46,203,21 12 h 6,95 72,143,14 16,122,43 24 h 7,02 60,502,56 30,102,56 48 h 7,14 50,103,42 42,242,24 72 h 7,65 47,824,43 45,603,45 96 h 8,11 5,013,35 49,712,56 120 h 8,12 2,120,18 49,252,21 Phụ lục hình 3.14 Thời gian nuôi pH Glucose MĐTB 0h 6,90 90,02,12 1,900,12 Phụ lục hình 3.16 Thời gian nuôi pH Glucose MĐTB 0h 6,79 90,003,14 2,560,37 12 h 7,23 80,406,43 78,125,28 24 h 7,42 30,615,21 109,057,64 48 h 7,68 16,124,52 120,125,07 Ghi : MĐTB- Mật độ tế bào Footer Page 190 of 126 72 h 7,96 2,220,68 130,147,67 96 h 8,02 1,950,02 130,066,56 120 h 8,07 0,220,00 128,323,64 Header Page 191 of 126 Footer Page 191 of 126 ... 126 VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hoàng Thị Lan Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI. .. dụng chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU  Có sưu tập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium phân lập từ số vùng biển, vùng rừng ngập mặn Vi t... KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN  Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium vào danh sách chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Vi t Nam;  Có dẫn liệu khoa học đặc điểm hình thái, sinh