Header Page of 126 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMA EVANSI) LƢU HÀNH Ở VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan TS Phạm Thị Tâm Thái Nguyên, năm 2013 Footer Page 1Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 ii Công trình đƣợc hoàn thành tại: KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan TS Phạm Thị Tâm Phản biện 1: PGS.TS Đặng Xuân Bình Phản biện 2: TS Phan Hồng Phúc Luận văn đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận văn họp tại: Vào hồi ngày tháng năm 2013 Có thể tìm hiểu luận văn trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Và thƣ viện Trƣờng/Khoa:…………………………… Footer Page 2Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn mà sử dụng chƣa đƣợc công bố công trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hiền Footer Page 3Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 iv LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đề tài, nỗ lực thân, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình thầy giáo, cô giáo, tập thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp trƣờng Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp chuyên ngành Thú y xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên TS Phạm Thị Tâm, khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình bảo, tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên giúp hoàn thành khóa học nâng cao chất lƣợng luận văn - Phòng quản lý đào tạo sau đại học tạo điều kiện cho suốt trình học tập trƣờng Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn đến ngƣời thân, gia đình động viên, giúp đỡ hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hiền Footer Page 4Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 v Mục lục Trang MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu đề tài Điểm đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC 1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại tiên mao trùng 1.1.2 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng 1.1.3 Đặc điểm bệnh lý lâm sàng bệnh 10 1.1.4 Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 13 1.1.5 Phƣơng pháp phát ADN tiên mao trùng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) .19 1.1.6 Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa .19 1.2 VECTOR TÁCH DÒNG 22 1.2.1 Khái niệm 22 1.2.2 Các loại vector tách dòng 23 1.2.3 Plasmid pCR 2.1 24 1.3 VECTOR BIỂU HIỆN 27 1.3.1 Khái niệm 27 1.3.2 Các hệ thống biểu gen .27 CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 VẬT LIỆU 30 2.1.1 Sinh phẩm nghiên cứu 30 2.1.2 Hóa chất môi trƣờng .30 2.1.3 Thiết bị .33 Footer Page 5Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 vi 2.1.4 Cặp mồi dùng nghiên cứu 34 2.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 34 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .34 2.3.1 Nghiên cứu điều kiện tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi 34 2.3.2 Nghiên cứu biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi 34 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35 2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu .35 2.4.2 Tách chiết ADN tổng số 35 2.4.3 Kiểm tra ADN hệ gen máy đo quang phổ 36 2.4.4 Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 37 2.4.5 Phƣơng pháp điện di gel agarose .38 2.4.6 Tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Tách dòng xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 47 3.2 Biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .64 Kết luận 64 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 Footer Page 6Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 vii CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADN Acid deoxyribonucleic CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis cDNA DNA bổ xung (complementary DNA) dNTP Deoxynucleotid triphotphat ddNTP Dideoxynucletid triphotphat EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG Isopropyl β – D – thiogalactoside MCS Multi clonding site PBS Phosphat Buffered Saline RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfat SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide TEA Tris – axit acetic - EDTA VAT Variant Antigen Tupe VSG Variant Surface Glucoprotein Footer Page 7Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 3.1 Thành phần điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn RoTAT 1.2 52 Bảng 3.2 Thành phần điều kiện phản ứng giải trình tự gen 54 Bảng 3.3 Tổng hợp mức độ tƣơng đồng gen RoTAT 1.2 chủng T.evansi phân lập với trình tự NCBI 56 Bảng 3.4 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Bam HI .59 Bảng 3.5 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Xho I 59 Bảng 3.6 Thành phần điều kiện phản ứng nối gen 59 Footer Page 8Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 ix DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Vector tách dòng pCR 2.1 25 Hình 1.2 Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT 1.2 26 Hình 3.1 Hình ảnh ký sinh trùng máu chuột bạch 47 Hình 3.2 Kết tách chiết ADN tổng số .48 Hình 3.3 Kết sản phẩm PCR gel agarose 1,5% .49 Hình 3.4 Kết biến nạp gen RoTAT 1.2 vào vi khuẩn E.coli DH10b 51 Hình 3.5 Kết tách chiết ADN plasmid 51 Hình 3.6 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 /R1.2 53 Hình 3.7 So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 chủng T.evansi HB với trình tự GeneBank 54 Hình 3.8 So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 chủng T.evansi LS với trình tự GeneBank 55 Hình 3.9 So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 chủng T.evansi TN với trình tự GeneBank 55 Hình 3.11 Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt anzyme giới hạn Bam HI Xho I 58 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme Bam HI Xho I 60 Hình 3.13 Sơ đồ cấu trúc vector pET 32a(+) .61 Hình 3.14 Kết điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 gel SDS-PAGE .62 Hình 3.15 Kết Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng 6xHis 63 Hình 3.16 Kết Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng T.evansi 63 Footer Page 9Số of hóa 126.bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 10 of 126 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bệnh Trypanosoma (Trypanosomiasis) bệnh truyền lây ngƣời gia súc ký sinh trùng đơn bào (Protozoa) lớp trùng roi (Flagellata) gây Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma, nhƣ: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vavax, Trypanosoma siminae… Bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi thấy loài động vật, trâu, bò động vật mẫn cảm với động vật đơn bào Trâu, bò mắc bệnh thể cấp tính thƣờng sốt cao 41 – 41,70C với triệu chứng thần kinh nhƣ ngã quỵ, kêu rống, vòng tròn, thuỷ thũng hầu, ức, nách, chân, háng Trƣờng hợp bệnh nặng, vật đột ngột sốt cao, bụng chƣớng to lăn chết Trâu, bò mắc bệnh thể cấp tính chết sau – 15 ngày Ở thể mãn tính, triệu chứng lâm sàng nhẹ bệnh kéo dài – tháng, vật ngày gầy, da khô mốc, niêm mạc mắt tụ máu màu đỏ tía, có chấm máu, chảy nƣớc mắt mắt có nhiều dử đặc nhƣ keo, niêm mạc mắt vàng nhạt hay sẫm Sức khoẻ trâu, bò suy yếu dần, ăn, nhai lại, phân táo có lẫn máu tháo phân lỏng, mùi thối khắm, có vật ỉa màng ruột, nát đoạn Theo số liệu Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân cs (2004), Phan Văn Chinh (2006), bệnh tiên mao trùng xuất nhiều vùng nƣớc, với tỷ lệ mắc cao: trâu 13 – 30%, bò – 14%, tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20% Cũng theo báo cáo tác giả trên, tỷ lệ mắc Trypanosoma evansi gia súc vùng núi trung du cao vùng đồng ven biển Trong đó, nƣớc ta, chăn nuôi gia súc nhai lại để cung cấp sức kéo, thịt, sữa lại tập trung chủ yếu tỉnh miền núi trung du vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp cho phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại, nhƣng sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn đoán điều trị địa phƣơng yếu kém; dẫn tới hệ bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng gây thiệt hại lớn Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 10 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 64 of 126 55 Hình 3.8 So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 chủng T evansi LS với trình tự GeneBank Hình 3.9 So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 chủng T evansi TN với trình tự GeneBank Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 64 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 65 of 126 56 Bảng 3.3 Tổng hợp mức độ tƣơng đồng gen RoTAT 1.2 chủng T evansi phân lập với trình tự NCBI Trình tự kiểm tra Accession AB259839.1 T.evansi HB EF495337.1 AF317914.1 AB259839.1 T.evansi LS EF495337.1 AF317914.1 AB259839.1 T.evansi TN EF495337.1 AF317914.1 Chiều dài (bp) Loài Trypanosoma evansi RoTat 1.2 gene for variable glycoprotein, partial cds Trypanosoma evansi variable surface glycoprotein mRNA, partial cds Trypanosoma evansi clone RoTat1.2 variable glycoprotein (VSG) mRNA, complete cds Trypanosoma evansi RoTat 1.2 gene for variable glycoprotein, partial cds Trypanosoma evansi variable surface glycoprotein mRNA, partial cds Trypanosoma evansi clone RoTat1.2 variable glycoprotein (VSG) mRNA, complete cds Trypanosoma evansi RoTat 1.2 gene for variable glycoprotein, partial cds Trypanosoma evansi variable surface glycoprotein mRNA, partial cds Trypanosoma evansi clone RoTat1.2 variable glycoprotein (VSG) mRNA, complete cds Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 65 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ surface (VSG) surface surface (VSG) surface surface (VSG) surface Độ bao Giá trị phủ E Độ tƣơng đồng 286 100 0.0 100 286 100 0.0 99 286 100 0.0 99 205 100 0.0 100 205 100 0.0 99 205 100 0.0 99 205 100 0.0 100 205 100 0.0 99 205 100 0.0 99 Header Page 66 of 126 57 Kết bảng 3.3, cho thấy đoạn trình tự plasmid pJET-RoTAT 1.2 mà tạo dòng đƣợc giải với mồi M13 có độ tƣơng đồng cao (99 100%) với trình tự gen RoTAT 1.2 chủng T evansi công bố 3.2 Biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 Trong nghiên cứu này, vector pET 32a (+) đƣợc lựa chọn để biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng Với ƣu điểm có khả tạo số lƣợng lớn tế bào vật chủ, có promoter hoạt động mạnh, có gen kháng kháng sinh thị để chọn lọc tế bào chứa plasmide tái tổ hợp, pET 32a (+) đƣợc sử dụng quy trình sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp khác biểu mức độ cao gen vi khuẩn E coli Plasmid pJET-RoTAT 1.2 chứa trình tự đoạn gen RoTAT 1.2 sau đƣợc tinh đƣợc sử dụng trực tiếp để thực phản ứng PCR khuếch đại gen RoTAT 1.2 Vector biểu đƣợc thiết kế theo sơ đồ thể hình 3.11 Gen RoTAT 1.2 vector pET 32a(+) đƣợc cắt lần lƣợt với enzyme Bam HI, đƣợc điện di tinh kit High Pure Product purification kit (Roche) Sau đó, sản phẩm tinh tiếp tục đƣợc cắt với Xho I Thành phần điều kiện phản ứng cắt với enzyme đƣợc trình bày bảng 3.4 3.5 Sản phẩm xử lý enzyme cuối đƣợc tinh điện di kiểm tra gel agarose 0,8% trƣớc thực phản ứng ghép nối với Kết điện di thể hình 3.12 cho thấy, sản phẩm cắt enzyme gen RoTAT 1.2 vector pET 32a(+) xuất băng nhất, có kích thƣớc khoảng 0,2 kb 5,9 kb, tƣơng tự nhƣ kích thƣớc lý thuyết gen vector Kết chứng tỏ, sản phẩm PCR sau cắt hai enzyme cắt giới hạn Bam HI Xho I có chất lƣợng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích thƣớc ban đầu gen Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 66 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 67 of 126 58 Hình 3.10 Sơ đồ tóm tắt trình thiết kế vector biểu gen RoTAT1.2 Hình 3.11 Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt anzyme giới hạn Bam HI Xho I M: thang chuẩn 10 kb, 1: sản phẩm cắt gen RoTAT 1.2, 2: sản phẩm cắt vector pET 32a (+) Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 67 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 68 of 126 59 Bảng 3.4 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Bam HI Thành phần Điều kiện xử lý Thể tích (µl) H 2O 60 Đệm 10x 15 pET 32a (+)/ RoTAT 1.2 70 Bam HI Tổng Ủ 370C 150 Bảng 3.5 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Xho I Thành phần Điều kiện xử lý Thể tích (µl) H 2O 33 Đệm 10x 10 pET 32a (+)/ RoTAT 1.2 54 XhoI Tổng Ủ 370C 100 Sản phẩm cắt enzyme giới hạn đƣợc tinh kit QIAEX II Gel Extraction Kit Qiagen đƣợc ghép nối với nhờ phản ứng nối có thành phần điều kiện bảng 3.6 Bảng 3.6 Thành phần điều kiện phản ứng nối gen Thành phần phản ứng Thể tích(µl) Đệm 10x RoTAT 1.2 cắt Bam HI Xho I 10 pET 32a(+) cắt Bam HI Xho I T4 ligase Tổng 20 Điều kiện Ủ 160C qua đêm Sản phẩm phản ứng ghép nối gen đƣợc biến nạp vào tế bào E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt chọn lọc môi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 68 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 69 of 126 60 Ampicillin với nồng độ 100 μg/ml Các khuẩn lạc trắng có khả chứa vector tái tổ hợp đƣợc lựa chọn để tách chiết plasmide cắt enzyme cắt giới hạn Từ số khuẩn lạc đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên, thu đƣợc plasmide tái tổ hợp đƣợc chứng minh hình 3.12 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme Bam HI Xho I M: thang chuẩn 10 kb; 1: Sản phẩm PCR gen RoTAT 1.2; 2: sản phẩm cắt pET 32a/ RoTAT 1.2 với enzyme Bam HI Xho I Kết hình 3.13 cho thấy: enzyme giới hạn cắt plasmid thành hai băng có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc gen RoTAT 1.2 vector pET 32a(+) Để khẳng định gen RoTAT 1.2 đƣợc chèn vào vector biểu khung chiều đọc, không xuất lỗi trình chép ADN, vector pET 32a/RoTAT đƣợc tinh để xác định lại trình tự nucleotide so sánh với trình tự GenBank Trình tự plasmid tái tổ hợp chứa đoạn ADN mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 có kích thƣớc khoảng 205 bp khung dịch mã đƣợc xác định với chuỗi polypeptide chứa đoạn tín hiệu đầu N tƣơng ứng với 68 acid amin Nhƣ kết luận, thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2 Plasmid tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào E coli BL21(DE3) phƣơng pháp sốc nhiệt nuôi cấy đĩa LB có chứa kháng sinh ampicillin 37oC, qua đêm Chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3)pLysS chủng vi khuẩn mang đặc tính di Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 69 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 70 of 126 61 truyền đƣợc biến đổi thích hợp cho việc biểu protein tái tổ hợp từ nhóm vector pET Chủng mang plasmid pLysS mã hóa cho lyzozyme giúp kiểm soát chặt chẽ việc cảm ứng biểu protein tái tổ hợp so với chủng BL21(DE3) thông thƣờng Protein RoTAT 1.2 đƣợc biểu dạng dung hợp đầu C với đoạn 6xHis Sự biểu protein RoTAT 1.2 E coli BL21(DE3) bƣớc đầu đƣợc phân tích phƣơng pháp SDS-PAGE Western blot Các dòng tế bào E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2 thu từ đĩa nuôi cấy tiến hành nuôi cấy lắc môi trƣờng lỏng LB có chứa ampicilin 100 μg/ml, 370C qua đêm đến pha ổn định Từ dịch nuôi cấy này, vi khuẩn lại tiếp tục đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin 100 μg/ml, lắc khoảng để OD600 đạt từ 0,6 - bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối 1mM Điều kiện cảm ứng IPTG 370C máy lắc với tốc độ 200 rpm Đoạn gen mã hoá cho protein RoTAT 1.2 đƣợc chèn vào vùng MCS vector pET 32a(+) biểu protein có kiểm soát T7 promoter (hình 3.13) Trên vector pET 32a(+) có chứa gen lacI mã hoá cho protein ức chế gắn vào vùng operator lac promoter T7, ngăn cản phiên mã có cảm ứng IPTG Protein RoTAT 1.2 đƣợc biểu theo chế kiểm soát âm hệ thống operon lac chất cảm ứng IPTG đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy Hình 3.13 Sơ đồ cấu trúc vector pET 32a(+) Tế bào vi khuẩn tái tổ hợp sau cảm ứng đƣợc thu nhận, xử lý điện di gel SDS - PAGE 12,5% Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 70 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 71 of 126 62 Hình 3.14 Kết điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 gel SDS-PAGE (M: thang chuẩn; giếng 1-2: E coli BL21 - pET32/RoTAT 1.2 cảm ứng với IPTG; giếng 3-4: E coli BL21- pET32/ RoTAT 1.2 không cảm ứng với IPTG; giếng 5: E coli BL21 - pET32) So sánh hình ảnh điện di đồ mẫu có chất cảm ứng IPTG, đồng thời so sánh kích thƣớc với thang protein chuẩn thấy: mẫu có cảm ứng với IPTG (đƣờng chạy số - 2) xuất băng protein có kích thƣớc nằm khoảng 8kDa (tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết protein RoTAT 1.2 có gắn đuôi His-tag) mẫu không cảm ứng với IPTG (đƣờng chạy số - 4) không thấy xuất băng Hơn nữa, mẫu nuôi E coli BL21- pET32 không bổ sung IPTG (đƣờng chạy số 5) không thấy xuất băng protein (hình 3.14) Nhƣ vậy, băng protein xuất có nhiều khả protein tái tổ hợp đích mà cần biểu Để khẳng định chắn khả biểu gen RoTAT 1.2, tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng T evansi kháng thể đặc hiệu kháng 6xHis Protein RoTAT 1.2 sau đƣợc phân tích gel polyacrylamide, chuyển sang màng nitrocellulose cho phản ứng với kháng thể đặc hiệu sau đƣợc gắn với protein A gắn peroxidase, màu TMB Kết Western blot protein RoTAT 1.2 với kháng thể kháng đuôi 6xHis kháng thể kháng T evansi (hình 3.15, 3.16) cho thấy tín hiệu lai với hai loại kháng thể đƣợc tìm thấy vị trí nhƣ dự kiến (8kDa) phù hợp với kết Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 71 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 72 of 126 63 điện di SDS-PAGE Nhƣ vậy, biểu thành công kháng nguyên RoTAT 1.2 tiên mao trùng T evansi vi khuẩn E coli BL21(DE3) Hình 3.15 Kết Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng 6xHis Vạch 1, 2, 3: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 không cảm ứng IPTG; vạch 4, 5, 6: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pETRoTAT 1.2 có cảm ứng IPTG Hình 3.16 Kết Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng T evansi Vạch 1, 2, 3: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 không cảm ứng IPTG; vạch 4, 5, 6: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pETRoTAT 1.2 có cảm ứng IPTG Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 72 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 73 of 126 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Qua trình tiến hành nghiên cứu đề tài thu đƣợc kết sau: 1.1 Đã tách dòng xác định đƣợc trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập từ tỉnh Hòa Bình, Lạng Sơn Thái Nguyên Trình tự gen tƣơng đồng 99% - 100% với trình tự GeneBank Tách chiết thành công ADN tổng số theo Kit GeneJET Genomic ADN purification hãng Thermo, đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Sản phẩm PCR chủng tiên mao trùng phân lập đƣợc kiểm tra gel agarose 1,5% có kích thƣớc phù hợp theo tính toán lý thuyết 205 bp Kết biến nạp gen RoTAT 1.2 vào vi khuẩn E coli DH10b đƣợc nuôi cấy đĩa thạch có xuất khuẩn lạc màu trắng Tách chiết ADN plasmid, đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Các ADN plasmid có kích thƣớc tƣơng ứng 3,2 kb Các dòng plasmid tái tổ hợp sau kiểm tra phản ứng PCR thấy xuất băng sáng có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2 205 bp Trình tự gen RoTAT 1.2 chủng T evansi HB, T evansi LS, T evansi TN tƣơng đồng 99% - 100% với trình tự GeneBank 1.2 Đã biểu thành công gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 T.evansi hệ thống vi khuẩn biểu E coli BL21(DE3) Kháng nguyên có trọng lƣợng 8kDa, đƣợc xác định phƣơng pháp điện di SDS-PAGE Western blot Sản phẩm PCR sau cắt hai enzyme cắt giới hạn Bam HI Xho I có chất lƣợng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích thƣớc ban đầu gen Thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2 Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 73 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 74 of 126 65 Sự biểu protein RoTAT 1.2 E coli BL21(DE3) đƣợc phân tích kiểm chứng phƣơng pháp SDS - PAGE Western blot Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 T evansi hệ thống vi khuẩn biểu E coli BL21(DE3) để thu đƣợc lƣợng lớn kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán bệnh cho gia súc Việt Nam Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 74 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 75 of 126 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994), Công nghệ gen công nghệ sinh học ứng dụng nông nghiệp đại Nxb nông nghiệp, Hà Nội [2] Phạm Chiến, Nguyễn Đức Tân, Lê Đức Quyết (1999), “Kết khảo sát ký sinh trùng đƣờng máu đàn bò huyện Mi Dinh Daklak", Kết hoạt động KHKT Thú y, tr 53 [3] Nguyễn Quốc Doanh (1999), Một số đặc tính sinh học T evansi (Steel, 1885), bệnh học chúng gây ra, quy trình bảo quản sử dụng giống T evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Hà Nội [4] Lƣơng Văn Huấn, Lê Hữu Khƣơng (1997), Ký sinh bệnh ký sinh gia súc, gia cầm, Nhà xuất Đại học Quốc gia – TP.HCM [5] Nguyễn Đăng Khải (1995), "Về triệu chứng sảy thai bệnh tiên mao trùng trâu bò T evansi", Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y tập III, số 1, tr 69 - 71 [6] Phạm Sỹ Lăng (1982), Một số đặcđiểm dịch tễ học bệnh tiên mao trùng trâu, bò Trypanosoma evansi tỉnh phía Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ khoa học Thú y [7] Lê Ngọc Mỹ (1994), "Phƣơng pháp ELISA phát kháng nguyên phƣơng pháp ký sinh trùng học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (T evansi) trâu bò mắc bệnh tự nhiên", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số [8] Phan Cự Nhân (2001), Di truyền học động vật Nxb khoa học kỹ thuật, Hà Nội [9] Đoàn Văn Phúc, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Đăng Khải (1981), “Thí nghiệm dùng Trypamidium điều trị bệnh tiên mao trùng", Thông tin thú y - Viện Thú y, Hà Nội [10] Đoàn Văn Phúc (1994), “Kết ứng dụng số phƣơng pháp huyết học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trâu thực địa", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 75 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 76 of 126 67 [11] Vƣơng Thị Lan Phƣơng (2004), Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi phân lập từ trâu, bò phía Bắc Việt Nam tinh chế kháng nguyên dùng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội [12] Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen Nxb khoa học kỹ thuật, Hà Nội [13] Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen – Nguyên lý ứng dụng Nxb khoa học kỹ thuật, Hà Nội [14] Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật Nxb khoa học kỹ thuật, Hà Nội [15] Lƣơng Tố Thu (1994), "Kết sản xuất Conjugate huỳnh quang chẩn đoán bệnh tiên mao trùng so sánh độ nhạy với phƣơng pháp chuẩn khác", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số [16] Lƣơng Tố Thu, Lê Ngọc Mỹ (1996), "Nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp ngƣng kết nhựa (CATT) để chẩn đoán tình hình bệnh tiên mao trùng (do T evansi) đàn trâu Việt Nam", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập IV, số *Tiếng Anh [17] Barry J D., Tumer C M R (1991), The diamics of antigenic variation and growth of African trypanosomes, Parasitology Today, 7, pp 207 - 21 [18] Davison (1999) Evaluation of diagnostic test for T evansi and then application in epidemiogical studies in Indonesia, PhS thesis Eliburgh [19] De Cosa, Moar W, Lee S, Miller M, Dainell H (2001), Over expression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals Nat Biotechnology [20] Goodner B et al (2001), Genome seguencing of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58 Science 294, 23232328 Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 76 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 77 of 126 68 [21] Hoare C A (1972), The Trypanosomes of MammaIs A zoological monograph, Black well scientific Publication Oxford and Edinburgh trypanosomiasis: Trypanosomelytic factor and the blood incubation infectivity test Trans R Soc Trop Med Hyg, Apr, 96 [22] Luckins A G (1988), Trypanosoma evansi in Asia, Parasitology today, p3 - 49 [23] James C (1998), Global review of commercialized transgenic crops, ISAAA [24] Perry Adkiss cộng sự, (2004) Gennetically Modified Pest-Protfcted Plants: Science and Regulation National Academy of Science [25] Urakawa T Verloo D Moens L Büscher P Majiwa PAO: Trypanosoma evansi: cloning and expression in Spodoptera fugiperda insect cells of the diagnostic antigen RoTat 1.2 [26] Van Montagu Jeff Schell M (2003), Steering Agrobacterium-mediaed plant gene engineering Trends Plant Sci 8, 353-354 [27] Watson J.D Baker T.A (2004), Molecular Biology of the Gene Fifth edition, Pearson Education, Inc, pub Benjamin Cummings Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 77 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 78 of 126 69 Xác nhận tập thể giáo viên hƣớng dẫn Thái Nguyên, ngày… tháng……năm HƢỚNG DẪN HƢỚNG DẪN PGS TS Nguyễn Thị Kim Lan TS Phạm Thị Tâm Sốofhóa Trung tâm Học liệu Footer Page 78 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... tiến hành: Nghiên cứu tách dòng biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành Việt Nam Mục tiêu đề tài - Xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao. .. mao trùng - Tạo đƣợc dòng tế bào vi khuẩn biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng Điểm đề tài - Đề tài xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên Ro-TAT 1.2 tiên mao trùng phân lập Việt Nam. .. tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 biểu đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập Việt Nam 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm đề tài sở cho nghiên