ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LEVOFLOXACIN TRONG DƢỢC PHẨM VÀ NƢỚC TIỂU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LEVOFLOXACIN TRONG DƢỢC PHẨM VÀ NƢỚC TIỂU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH Mã số: 60440118 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN XUÂN TRƢỜNG PGS.TS TỪ BÌNH MINH Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu học tập em hoàn thành luận văn cao học với đề tài “Nghiên cứu xác định Levofloxacin dƣợc phẩm nƣớc tiểu sắc ký lỏng hiệu cao" dƣới hƣớng dẫn bảo hai thầy TS Nguyễn Xuân Trƣờng, PGS TS Từ Bình Minh thầy cô, anh chị, bạn môn Hóa phân tích Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Xuân Trƣờng PGS TS Từ Bình Minh giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cám ơn nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Diệp hỗ trợ em trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô môn Hóa phân tích, bạn học viên lớp cao học K25 tạo điều kiện, giúp đỡ em thời gian thực đề tài Hà Nội, ngày 17 tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thu Hà MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan Levofloxacin 1.1.1.Cấu trúc tính chất lý – hóa Levofloxacin 1.1.2 Tính chất dƣợc học Levofloxacin 1.1.3.Vai trò ứng dụng Levofloxacin 1.1.4.Sự tƣơng tác Levofloxacin với loại thuốc khác 1.2.Một số phƣơng pháp xác định Levofloxacin 1.2.1.Phƣơng pháp điện hóa 1.2.2.Phƣơng pháp phân tích quang học 1.2.3.Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (FPIA) 1.2.4.Phƣơng pháp sắc ký lỏng 1.3.Các phƣơng pháp xử lý mẫu phẩm sinh học 11 1.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 11 1.3.2.Kỹ thuật chiết pha rắn 12 CHƢƠNG II: THỰC NGHIỆM 17 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.2 Đối tƣợng nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Đối tƣợng 17 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phƣơng pháp phân tích 19 2.3.2 Phƣơng pháp định lƣợng Levofloxacin thuốc 19 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu 20 2.4 Xử lý số liệu 21 2.5 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu 21 2.5.1 Thiết bị 21 2.5.2 Dụng cụ 21 2.5.3 Hóa chất, chất chuẩn 22 2.6 Các điều kiện đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích 23 2.6.1 Độ đặc hiệu 23 2.6.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) 23 2.6.3 Độ chụm (độ lặp lại) phƣơng pháp 23 2.6.4 Độ (độ thu hồi) phƣơng pháp 24 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích Levofloxacin thiết bị HPLC 25 3.1.1 Bƣớc sóng hấp thụ cực đại Levofloxacin 25 3.1.2 Khảo sát pha động 25 3.1.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng(LOQ) thiết bị 33 3.1.4 Xây dựng đƣờng chuẩn đinh lƣợng Levofloxacin 34 3.2 Phân tích Levofloxacin dƣợc phẩm 36 3.2.1 Xây dựng quy trình định lƣợng Levofloxacin dƣợc phẩm 40 3.3.2 Độ lặp lại trình xử lý mẫu 40 3.3.3 Phân tích số mẫu thuốc thị trƣờng 41 3.3 Tối ƣu điều kiện quy trình chiết nhằm xác định Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu 43 3.3.1 Khảo sát quy trình chiết lỏng - lỏng 43 3.3.2 Khảo sát quy trình chiết pha rắn 55 3.4 Phân tích mẫu thực tế 67 KẾT LUẬN 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 A.TIẾNG VIỆT 71 B.TIẾNG ANH 71 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Công thức cấu tạo Levofloxacin Hình 1: Phổ hấp thụ Levofloxacin vùng UV-Vis ………………… 24 Hình 2: Sắc kí đồ Levofloxacin với hệ pha động khác 26 Hình 3: Ảnh hƣởng tỷ lệ pha động đến trình định lƣợng Levofloxacin 27 Hình 4: Ảnh hƣởng pH dung dịch đệm đến trình định lƣợng Levofloxacin 28 Hình 5: Ảnh hƣởng nồng độ dung dịch đệm đến trình định lƣợng Levofloxacin 29 Hình 6: Sắc ký đồ Levofloxacin thay đổi tốc độ dòng khác 30 Hình 7: Đƣờng chuẩn Levofloxacin 32 Hình 8: Ảnh hƣởng dung môi chiết đến trình định lƣợng Levofloxacin dƣợc phẩm 34 Hình 9: Sắc ký đồ Levofloxacin mẫu dƣợc phẩm sử dụng dung môi chiết khác 35 Hình 10: Ảnh hƣởng thời gian rung siêu âm đến trình định lƣợng Levofloxacin dƣợc phẩm 36 Hình 11: Sắc ký đồ Levofloxacin mẫu dƣợc phẩm thay đổi thời gian rung siêu âm 36 Hình 12: Độ lặp lại trình xử lý mẫu thuốc 38 Hình 13: Sắc ký đồ phân tích Levofloxacin số mẫu dƣợc phẩm thị trƣờng 40 Hình 14: Sắc ký đồ mẫu nƣớc tiểu sử dụng dung môi chiết khác kĩ thuật chiết lỏng-lỏng 42 Hình 15: Ảnh hƣởng dung môi chiết đến độ thu hồi Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng 43 Hình 16: Ảnh hƣởng tỷ lệ mẫu : đệm phosphat đến độ thu hồi Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng 44 Hình 17: Ảnh hƣởng pH dung dịch đệm đến độ thu hồi Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng 45 Hình 18: Ảnh hƣởng thể tích dung môi chiết đến độ thu hồi Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng 46 Hình 19: Sắc ký đồ Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu tự tạo theo quy trình chiết lỏng – lỏng tối ƣu 47 Hình 20: Sắc ký đồ Levofloxacin nƣớc tiểu sử dụng quy trình chiết lỏnglỏng 48 Hình 21: Đƣờng chuẩn Levofloxacin theo phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng 50 Hình 22: Sắc ký đồ mẫu nƣớc tiểu sử dụng dung môi rửa tạp khác kĩ thuật chiết pha rắn 54 Hình 23: Sắc ký đồ mẫu nƣớc tiểu sử dụng dung môi rửa giải khác kĩ thuật chiết pha rắn 56 Hình 24: Ảnh hƣởng dung môi rửa giải đến độ thu hồi Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết pha rắn 57 Hình 25: Sắc ký đồ Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu tự tạo theo quy trình chiết pha rắn tối ƣu 59 Hình 26: Sắc kí đồ Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu kĩ thuật chiết pha rắn 60 Hình 27: Đƣờng chuẩn Levofloxacin theo phƣơng pháp chiết pha rắn 62 Hình 28 Kết phân tích levofloxacin nƣớc tiểu số bệnh nhân với quy trình (a) lỏng – lỏng (b) chiết pha rắn 65 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thông tin số loại thuốc chứa Levofloxacin thị trƣờng 16 Bảng 1: Sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ dòng pha động 30 Bảng 2: Giới hạn phát (LOD) Levofloxacin 31 Bảng 3: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin 31 Bảng 4: Điều kiện phân tích Levofloxacin phƣơng pháp HPLC 33 Bảng 5: Thông tin mẫu thuốc thị trƣờng 38 Bảng 6: Kết phân tích số mẫu thuốc chứa LEV thị trƣờng 40 Bảng 7: Điều kiện chiết tối ƣu quy trình chiết lỏng – lỏng 46 Bảng 8: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng 49 Bảng 9: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin theo phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng 49 Bảng 10: Kết khảo sát độ chụm phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng 51 Bảng 11: Kết khảo sát độ phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng 52 Bảng 12: Ảnh hƣởng cột chiết pha rắn đến độ thu hồi chất chuẩn Levofloxacin theo quy trình chiết pha rắn 53 Bảng 13: Ảnh hƣởng dung môi rửa tạp đến hiệu suất thu hồi Levofloxacin mẫu nƣớc tiểu theo quy trình chiết pha rắn 55 Bảng 14: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin theo phƣơng pháp chiết pha rắn 61 Bảng 15: Kết khảo sát độ chụm phƣơng pháp chiết pha rắn 63 Bảng 16: Kết khảo sát độ phƣơng pháp chiết pha rắn 63 Bảng 17: Kết phân tích mẫu nƣớc tiểu bệnh nhân đƣợc trình bày bảng 64 Mg (II) tác nhân tạo phức, tránh việc sử dụng dung môi hữu Các điều kiện MAE tối ƣu đƣợc thành lập thông qua chemometric biến nhiệt độ, thời gian chiếu xạ độ ẩm dung môi Ke He, Lee Blaney [27] xác định đồng thời 11 kháng sinh Fluoroquinolone (FQs) mẫu môi trƣờng nƣớc thải phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE) sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo với detecter huỳnh quang Quá trình tách sắc ký 11 FQs đƣợc thực cột pentafluorophenyl 150 mm sử dụng chƣơng trình rửa giải gradient với pha động gồm metanol, acetonitril, đệm phosphat 20 mM (pH = 2,4) Bƣớc sóng kích thích phát xạ lần lƣợt 276 - 296 nm 444 - 506 nm Giới hạn định lƣợng thiết bị 20 - 100 pg khối lƣợng tiêm Trong số 11 FQs xác định đƣợc FQs bao gồm: Ciprofloxacin, Difloxacin, Enrofloxacin, Fleroxacin, Norfloxacin, Moxifloxacin Ofloxacin mẫu nƣớc thải nƣớc bề mặt bốn tháng với nồng độ - 1292; - 504 - 187ng/ l  Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector MS Ping-Fei Fang [39] sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp khối phổ để xác định đồng thời Isoniazid (INH), Rifampicin (RFP) Levofloxacin (LVX) mô chuột huyết tƣơng dùng Gatifloxacin chất nội chuẩn (IS) Các hợp chất I.S đƣợc chiết xuất từ đồng chất mô huyết tƣơng phƣơng pháp tạo tủa protein metanol Việc tách sắc ký chất phân tích đƣợc thực cột Welch C4 (250mmx4.6mm, 5.0microm, Mỹ) 25oC, sử dụng chƣơng trình rửa giải gradient với pha động gồm axit formic 0,05% metanol (93:7) tốc độ dòng ml/ phút Đối với ba chất phân tích, độ thu hồi khoảng 83,3% - 98,8% mô; khoảng 75,5% - 90,8% huyết tƣơng, độ xác từ 91,7% đến 112,0% mô từ 94,6% đến 108,8% huyết tƣơng Giới hạn phát (LOD) cho INH, RFP LVX mô chuột lần lƣợt 0,04, 0,05 0,05µg/ ml huyết tƣơng chuột tƣơng ứng 5,5, 6,0 6,6ng/ ml Đối với mẫu huyết tƣơng, Sung Joong Lee cộng [44] sử dụng phƣơng pháp LC-ESI-MS/MS định lƣợng nồng độ Moxifloxacin (MFX) Levofloxacin (LFX) huyết ngƣời, Enrofloxacin (EFX) đƣợc sử dụng làm chất nội chuẩn (IS) Định lƣợng đƣợc tính toán thông qua phản ứng trình chuyển đổi từ ion mẹ ion M/Z 402,2 → 384,2 cho MFX; 362,2 → 318,2 cho LFX 362,1 → 318,3 cho EFX Độ thu hồi trung bình tƣơng ứng 96,0% 95,5% cho MFX Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng MFX LFX mẫu huyết thu đƣợc từ mƣời bệnh nhân MDR-TB Kết phƣơng pháp áp dụng nhƣ công cụ kiểm định thuốc để phân tích xác MFX LFX thời gian ngắn hạn  Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector UV PDA/DAD Hanwen Sun cộng [19] phát triển phƣơng pháp để xác định đồng thời chất Natri Ceftriaxone, Metronidazole Levofloxacin nƣớc tiểu ngƣời Natri Ceftriaxone, Metronidazole Levofloxacin đƣợc tách cột C18, pha động gồm KH2PO4 1,5 mM (pH 4,5) với Trietylamin 0,0125% - Metanol (70:30), lần lƣợt bƣớc sóng 247, 320 292 nm Giới hạn phát Natri Ceftriaxone, Metronidazole, Levofloxacin tƣơng ứng 0,05; 0,01 0,25 mg/ ml độ thu hồi trung bình nƣớc tiểu ngƣời khoảng 97,73100,7% với độ lệch trung bình tƣơng đối chuẩn (RSD) khoảng 2,5% 3,0% Nghiên cứu tài liệu tham khảo cho việc sử dụng thuốc hợp lý phƣơng pháp luận cho việc nghiên cứu dƣợc động học thuốc kết hợp T Manish Kumar [45] xây dựng phƣơng pháp HPLC để xác định Levofloxacin huyết tƣơng ngƣời với detector UV 235nm với pha động gồm ACN – đệm phosphat (pH = 2,5) đƣợc tách cột C18 tốc độ dòng 1ml/phút Thời gian lƣu Levofloxacin chất nội chuẩn tƣơng ứng 5,9 phút 10,1 phút Độ thu hồi trung bình 85,0% Phƣơng pháp đƣợc áp dụng thành công nghiên cứu dƣợc động học 10 William V Caufied [49] triển phƣơng pháp HPLC xác định đồng thời Zidovudine (AZT) Levofloxacin huyết tƣơng ngƣời Các hợp chất đƣợc tách pha động Na2HPO4 25mM axit trifluoroacetic 0,1% (pH 2,4) - ACN (86:14) cột octadecylsilane với bƣớc sóng phát 266 nm Ciprofloxacin đƣợc sử dụng làm chất nội chuẩn Độ thu hồi trung bình 94,1% với AZT 91,2% với Levofloxacin 84,7% cho chất nội chuẩn Nghiên cứu phù hợp để sử dụng nghiên cứu dƣợc động học theo dõi thƣờng xuyên huyết tƣơng bệnh nhân nhiễm HIV sử dụng loại thuốc 1.3.Các phƣơng pháp xử lý mẫu phẩm sinh học Hàm lƣợng Levofloxacin mẫu phẩm sinh học thƣờng nhỏ việc nghiên cứu phƣơng pháp để xử lý làm giàu mẫu cần thiết Hiện có hai phƣơng pháp chiết thƣờng dùng chiết lỏng – lỏng chiết pha rắn 1.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng Chiết lỏng – lỏng phƣơng pháp chiết dựa theo phân bố khác chất tan hai pha không trộn lẫn vào nhau, thƣờng pha nƣớc pha lại dung môi hữu không tan tan vào nƣớc Quá trình chiết trình chuyển chất tan từ pha nƣớc vào pha hữu đƣợc thực qua bề mặt tiếp xúc hai pha nhờ tƣơng tác hóa học tác nhân chiết chất cần chiết [3] Để có đƣợc kết chiết tốt, trình chiết phải có điều kiện chiết cần thiết Điều kiện chiết chất phân tích vào pha hữu cơ: - Dung môi chiết dịch chiết hai pha không đƣợc trộn lẫn, dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích - Hệ số tách α khác tốt - Cân dịch chiết đạt đƣợc nhanh thuận nghịch, phân lớp phải rõ ràng để giải chiết đƣợc tốt 11 - Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm pH dung dịch, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia,… Phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng áp dụng cho chất vô nhƣ ion kim loại, anion tan nƣớc chất hữu với ƣu điểm thiết bị đơn giản, dung môi dễ bay Phƣơng pháp đƣợc F.A Wong, S.J Juzwin S.C Flor [14] sử dụng để xử lý mẫu huyết tƣơng nƣớc tiểu ngƣời xác định Levofloxacin Huyết tƣơng (0,25ml) nƣớc tiểu (0,01ml) đƣợc thêm 100µl chất nội chuẩn, 250µl dung dịch đệm phosphat sau thêm 4ml diclometan, hỗn hợp đƣợc trộn 30s li tâm 2000 vòng/phút phút Pha hữu đƣợc cô đặc dƣới dòng khí nitơ Phần cặn chiết lại đƣợc hòa tan 100µl pha động hỗn hợp CuSO4.5H2O chứa L-isoleucine - metanol (87,5:12,5) bơm vào hệ thống HPLC phân tích Hiệu suất thu hồi trung bình mức nồng độ khác mẫu huyết tƣơng nƣớc tiểu tƣơng ứng 88 - 98% 87 - 95% Cũng với phƣơng pháp T Manish Kumar, Gurrala Srikanht, J Venkateshwar Rao KRS Sambasiva Rao [43] dùng để xử lý mẫu huyết tƣơng ngƣời xác định Levofloxacin dung môi etylacetat Mẫu huyết tƣơng tự tạo (0,05ml) trộn thêm 50µl chất nội chuẩn Gatifloxacin nồng độ 100ppm đệm phosphat (pH = 2,5) Hỗn hợp đƣợc chiết với 3ml etylacetat sau li tâm 4000 vòng/phút 15 phút 40oC Pha hữu đƣợc bốc dung môi khí nitơ, phần cặn chiết lại pha 400µl pha động bơm vào hệ thống HPLC phân tích Hiệu suất thu hồi trung bình Levofloxacin mẫu huyết tƣơng 85,95% 1.3.2.Kỹ thuật chiết pha rắn Chiết pha rắn dạng sắc ký lỏng đƣợc cải tiến thành hấp thụ pha rắn với chế khác Kỹ thuật dựa nguyên tắc phân bố chất tan hai pha không tan vào Trong chất tan ban đầu pha lỏng (nƣớc 12 dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan dạng rắn (dạng hạt, nhỏ xốp) gọi pha rắn [3,5] Pha rắn (còn đƣợc gọi pha tĩnh) thƣờng hạt silicagel xốp, trung tính, hạt oxit nhôm, silicagel trung tính đƣợc ankyl hóa nhóm –OH gốc hydrocacbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, polyme hữu cơ, lại nhựa than hoạt tính… Các hạt đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ (thƣờng cột có kích thƣớc x 1cm) nén dạng đĩa dày 1-2mm với đƣờng kính 34cm (đĩa chiết) Pha lỏng pha chứa chất cần phân tích, chúng dung môi hữu dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tƣơng tác với chất cần phân tích giữ nhóm (hoặc số nhóm) chất phân tích lại pha rắn, chất lại khỏi cột với dung môi hòa tan mẫu Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực dung môi thích hợp Ví dụ: chất hữu thƣờng đƣợc rửa giải aceton, acetonitrile, methanol,…; kim loại thƣờng đƣợc rửa giải dung dịch axit Thông thƣờng, thể tích rửa giải nhỏ nhiều lần so với thể tích mẫu ban đầu, điều có nghĩa chất phân tích đƣợc làm giàu Điều kiện chiết pha rắn: Pha rắn hay pha lỏng phải có tính chất hấp phụ hay trao đổi chọn lọc với hay nhóm ion định Hệ số phân bố nhiệt động Kb cân chiết phải lớn, để hiệu chiết cao Quá trình chiết phải xảy nhanh, nhanh đạt đến cân nhƣng tƣơng tác hóa học làm hay hỏng chất phân tích Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch cao để rửa giải chất phân tích khỏi pha lỏng 13 Không làm nhiễm bẩn chất phân tích Sự chiết đƣợc thực số điều kiện định, phù hợp, lặp lại đƣợc, đơn giản tốt Hiện chiết pha rắn đƣợc sử dụng phổ biến lĩnh vực phân tích cho mục đích xác định chất vô hữu cơ, kim loại phi kim ƣu điểm sau: - Hiệu suất thu hồi cao - Cân chiết đạt nhanh có tính thuận nghịch - Thích hợp cho mẫu lƣợng nhỏ phân tích lƣợng vết chất - Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, tiến hành hàng loạt - Khả làm giàu làm chất phân tích lớn Trong phƣơng pháp HPLC xác định đồng thời Zidovudine (AZT) Levofloxacin huyết tƣơng ngƣời William V Caufied [46] sử dụng phƣơng pháp chiết pha rắn để làm mẫu huyết tƣơng Cột chiết pha rắn C18 1cc/100mg đƣợc hoạt hóa cột 1ml Metanol, sau với 1ml nƣớc deion 1ml đệm Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) Mẫu huyết tƣơng đƣợc thêm 100µl chất nội chuẩn trƣớc đƣa lên cột chiết, sau rửa tạp lần với 250µl đệm Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4), cuối đƣợc rửa giải với 1,0 ml hỗn hợp đệm NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) – MeOH (95:5) Hỗn hợp thu đƣợc đem cô cạn sau đƣợc pha loãng với pha động Zidovudine Levofloxacin đƣợc tách cột C18, với pha động hỗn hợp NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) : ACN (86:14) Hiệu suất thu hồi Zidovudine 94,1%, Levofloxacin 91,2% chất nội chuẩn 84,7% Chiết pha rắn phƣơng pháp sắc ký lỏng đƣợc phát triển Hing-Biu Lee cộng [20] để xác định ba Fluoroquinolone (FQs) gồm Ofloxacin, Norfloxacin, Ciprofloxacin mẫu nƣớc thải đô thị Các FQs đƣợc chiết cột chiết pha rắn Oasis WCX trao đổi cation yếu Cột đƣợc hoạt hóa 4ml metanol 14 sau 10ml nƣớc pH = 3, mẫu đƣợc đƣa lên cột với tốc độ 10 – 15ml/ phút, rửa tạp 100ml nƣớc pH = sau 5ml metanol, cuối đƣợc rửa giải hỗn hợp metanol, acetonitril axit formic (25:75:5) Hỗn hợp đem bốc dung môi nhiệt độ 40oC cách thổi khí nitơ sau pha loãng với 1ml dung môi pha động Các FQs đƣợc tách cột Zorbax SB-C8 với pha động hỗn hợp actonitril metanol - axit formic - nƣớc (6/12/0,5/81,5), tốc độ dòng chảy 0,2ml/phút Các FQs đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp LC/MS/MS ESI LC/MS Độ thu hồi FQs mẫu nƣớc thải khoảng 87 - 94% với độ lệch chuẩn tƣơng đối 6% Ba FQs đƣợc phát tất mẫu nƣớc thải với nồng độ trung bình khoảng 34 251ng/ l Các Fluoroquinolone kháng sinh tổng hợp đƣợc sử dụng rộng rãi y học Từ mục đích này, O Ballesteros cộng [37] phát triển phƣơng pháp xác định ba Fluoroquinolones sử dụng rộng rãi (Norfloxacin, Ciprofloxacin Ofloxacin) nƣớc tiểu ngƣời phƣơng pháp sắc ký lỏng (LC) kết hợp với khí nén hỗ trợ electrospray ion hóa (ESI) khối phổ (MS) Mẫu nƣớc tiểu trƣớc định lƣợng đƣợc làm phƣơng pháp chiết pha rắn Mẫu nƣớc tiểu đƣợc lấy từ tình nguyện viên khỏe mạnh sau đem ly tâm 10 phút lọc qua màng 0,45µm Cột chiết đƣợc hoạt hóa 2ml metanol 2ml nƣớc, đƣa 10ml mẫu thêm chuẩn lên cột, sau rửa tạp 2ml nƣớc, cuối rửa giải 3ml hỗn hợp ACN - TFA 2% (25:75) Bốc dung môi hỗn hợp thu đƣợc sau pha loãng pha động hỗn hợp acetonitril - đệm amoni acetat (pH = 2,5) (20: 80) Độ thu hồi mẫu nƣớc tiểu ngƣời Norfloxacin 46,0%, Ofloxacin 65,1%, Ciprofloxacin 61,9% Giới hạn phát phƣơng pháp 10ng/ ml ba Fluoroquinolones 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO A.TIẾNG VIỆT Dƣợc điển Việt Nam IV, (2009), nhà xuất Y học, Hà Nội, PL 9.6 Đào Thị Vân Khánh, (2015), Xác định đồng thời số kháng sinh quinolon tôm nước nuôi tôm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký chiết tách, Nhà xuất bách khoa Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thu Thủy (2009), Nghiên cứu xác định Ciprofloxacin (CIP) số dược phẩm phương pháp điện hóa, Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2011), Các phương pháp tách sắc ký, Sách chuyên đề phân tích cho cao học, Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2010), Bài giảng chuyên đề thống kê hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội Trần Cao Sơn, (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật TS Phùng Thị Vinh (2005), Nghiên cứu phương pháp chiết xuất định lượng Norfloxacin dịch sinh học, Đề tài cấp bộ, Viện kiểm nghiệm-Bộ y tế B.TIẾNG ANH A Espinosa-Mansilla, A Munoz de la Pẽna, D Gonzãlez Gómez, F Salinas López (2006), “Determination of fluoroquinolones in urine and serum by using high performance liquid chromatography and multiemission scan fluorimetric detection”, Talanta, 68, pp.1215–1221 68 10 A.Radi, Z El – Sherif (2002), “Determination of levofloxacin in human urine by adsorptive square – wave anodic stripping voltammetry on a glassy carbon electrode”, Talanta, 58, pp.319-324 11 Brian R Overholser, Michael B Kays, Kevin M Sowinski (2003), “Determination of gatifloxacin in human serum and urine by highperformance liquid chromatography with ultraviolet detection”, Journal of Chromatography B, 798, pp.167–173 12 Ester Caro, Rosa M Marcé, Peter A.G Cormack, David C Sherrington, Francesc Borrull (2006), “Novel enrofloxacin imprinted polymer applied to the solid-phase extraction of fluorinated quinolones from urine and tissue samples”, Analytica Chimica Acta, 562, pp.145-151 13 FA Wong, SJ Juzwin, SC Flor (1996), “Rapid stereospecific high-performance liquid chromatographic determination of levofloxacin in human plasma and urine”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 15, pp.765-71 14 F Lombardi, R Ardemagni, V Colzani and M Visconti (1992), “Highperformance liquid chromatographic determination of rufloxacin and its main active metabolite in biological fluids”, Journal of Chromatography, 516, pp 129-134 15 Francisco J Lara, Monsalud del Olmo-Iruela, Ana M García-Campaña (2013), “On-line anion exchange solid-phase extraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection to determine quinolones in water and human urine”, Journal of Chromatography A, 1310, pp 91–97 16 Gaoli Hea, Beining Guoa, Jicheng Yua, Jing Zhanga, Xiaojie Wua, Guoying Cao, Yaoguo Shia and Cheng-yuan Tsaic (2014), “Determination of a novel nonfluorinated quinolone, nemonoxacin, in human feces and its glucuronide conjugate in human chromatography– triple urine and feces quadrupole Chromatography, 29, pp.739-748 69 mass by high-performance spectrometry”, liquid Biomedical 17 Giuseppe Carlucci (1998), “Analysis of fluoroquinolones in biological fluids by highperformance liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 812, pp 343–367 18 Grace K Kim, (2010), "The risk of fluoroquilone-induced tendinophathy and tendon rupture”, The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology, 3(4), pp.49-54 19 Hanwen Sun, Hongliu Wang, Xusheng Ge and Xiaolan Qin (2011), “Simultaneous determination of the combined drugs of ceftriaxone sodium, metronidazole, and levofloxacin in human urine by high-performance liquid chromatography”, International Journal of Science Innovations and Discoveries, 26, pp.216-225 20 Hing-Biu Lee, Thomas E Peart, M Lewina Svoboda (2007), “Determiantion of Ofloxacin, Norfloxacin and Ciprofloxacin in sewage by selective solid-phase extraction, liquid chromatography with fluorescence detection and liquid chromatography-tadem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1139, pp.45-52 21 Hiroyuki Aoki, Yumi Ohshima , Makoto Tanaka, Osamu Okazaki, Hideo Hakusui (1994), “High-performance liquid chromatographic determination of the new quinolone antibacterial agent DU-6859a in human serum and urine using solid-phase extraction with photolysis-fluorescence detection”, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 660, pp 365374 22 Hongyuan Yan and Fengxia Qiao (2014), “Rapid screening of ofloxacin enantiomers in human urine by molecularly imprinted solid-phase extraction coupled with ligand exchange chromatography”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 37, pp.1237–1248 70 23 I Ahmad, R Bano, M.A Sheraz, S Ahmed, T Mirza, S.A Ansari (2013), “Photodegradation of levofloxacin in aqueous and organic solvents: a kinetic study”, Acta Pharmaceutica, 63, pp.223-229 24 I A Shanin, A R Shaimardanov, Nguen Ti Diu Thai, S A Eremin (2015), “Determination of fluoroquinolone antibiotic levofloxacin in urine by fluorescence polarization immunoassay”, Journal of Analytical Chemistry, 70, pp.712-717 25 J Macek, P Ptácek, “Determination of Ofloxacin in human plasma using highperformance liquid chromatography and fluorescence detection”, Journal of Chromatography B, 673, pp.316-319 26 Juan Antonio Ocan˜a Gonza´ lez, Manuel Callejo´n Mocho´ n, Francisco Jose´ Barraga´ n dela Rosa (2000), “Spectrofluorimatric determination of levofloxacin in tablets, human urine and serum”, Talanta, 52, pp.49-56 27 Ke He, Lee Blaney (2014), “Systematic optimization of an SPE with HPLCFLD method for fluoroquinolone detection in wastewater”,Journal of Hazardous Materials, 282, pp.96-105 28 Klaus Borner and Ellen Borner (1992), “Determination of sparfloxacin in serum and urine by highperformance liquid chromatography”, Journal of Chromatography, 579, pp 285-289 29 Krupa M Kothekara , Balasundaram Jayakara , Amit P Khandharb , Rajnish K Mishrac (2007), “Quantitative Determination of Levofloxacin and Ambroxol hydrochloride in Pharmaceutical Dosage Form by ReversedPhase High Performance Liquid Chromatography”, Eurasian Journal of Analytical Chemistry, 2, pp.21-31 30 Lee SJ, Desta KT, Eum SY, Dartois V, Cho SN, Bae DW, Shin SC (2015), “Development and validation of LC-ESI-MS/MS method for analysis of moxifloxacin and levofloxacin in serum of multidrug-resistant tuberculosis 71 patients: Potential application as therapeutic drug monitoring tool in medical diagnosis”, Journal of Chromatography B,1009-1010, pp.138-143 31 Makoto Tanaka, Yumi Oshima, Hiroyuki Aoki, Hideo Hakusui (1995), “Determination of a new fluoroquinolone antimicrobial agent, (S)-10-[(S)-(8amino-6-azaspiro[3,4]octan-6-yl)]-9-fluoro-2,3- dihydro-3-methyl-7-oxo-THpyddo[1,2,3-de][1,4]benzoxazine- 6-carboxylic acid hemihydrate, DV-7751a, in human serum and urine using solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of Chromatography B, 664, pp.401-407 32 Manimala M., Ravindra Reddy K and Hepcykala Rani D (2013), “Development and validation of novel UV spectrophotometric determination of levofloxacin hemi hydrate in bulk and pharmaceutical dosage forms”, Der Pharma Chemica, pp.47-50 33 MARCELLE O KOEPPE, RODRIGO CRISTOFOLETTI,1 EDUARDO F FERNANDES, SILVIA STORPIRTIS, HANS E JUNGINGER, SABINE KOPP,4 KAMAL K MIDHA, VINOD P SHAH, SALOMON STAVCHANSKY, JENNIFER B DRESSMAN, DIRK M BARENDS, (2011), “Biowaiver Monographs for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms: Levofloxacin”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 100(5), pp.16281636 34 Marika Kamberi , Perparim Kamberi , Shigeyuki Nakano (2000), “Determination of grepafloxacin in plasma and urine by a simple and rapid high-performance liquid chromatographic method”, Journal of Chromatography B, 741, pp.295–300 35 M.D Prat, J Benito, R Compañó, JA Hernández-Arteseros, M Granados (2004), “Determination of quinolones in water samples by solid-phase extraction and liquid chromatography with fluorimetric Chromatography A, 1041, pp.27-33 72 detection”, Journal of 36 Michela Sturini, Andrea Speltini, Federica Maraschi, Elisa Rivagli, Antonella Profumo (2010), fluoroquinolones “Solvent-free from soil and microwave-assisted liquid extraction of chromatography-fluorescence determination”, Journal of Chromatography A, 1217, pp.7316-7322 37 O Ballesteros, IToro, V Sanz-Nebot, A Navalón, JLVílchez, J Barbosa (2003), “Determination of fluoroquinolones in human urine by liquid chromatography coupled to pneumatically assisted electrospray ionization mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 798, pp.137-144 38 Osamu Okazaki, Hiroyuki Aoki, Hideo Hakusui (1991), “High-performance liquid chromatographic determination of (S)-(−)-ofloxacin and its metabolites in serum and urine using a solid-phase clean-up”, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 563, pp.313-22 39 Ping-Fei Fang, Hua-Lin Cai, Huan-De Li, Rong-Hua Zhu, Qin-You Tan, Wei Gao, Ping Xu, Yi-Ping Liu,Wen-Yuan Zhang, Yong-Chang Chen, Feng Zhang (2010), “Simultaneous determination of Isoniazid, Rifampicin, Levofloxacin in mouse tissues and plasma by high performance liquid chromatographytandem mass spaectrometry”, Journal of Chromatography B, 878, pp.22862291 40 RESMI MUSTARICHIE, WIWIEK INDRIYATI, IYAN SOPYAN (2011), “Ofloxacin analysis validation method in human blood plasma (in vitro) using solid-phase extraction HPLC”, Open Access Research Journal, pp 80-87 41 Safila Naveed, Najma Sultana, M Saeed Arayne, Huma Dilshad (2014), “A new HPLC method for the assay of levofloxacin and its application in drugmetal interaction studies”, Journal of Scientific and Innovative Research, (1), pp 91-96 42 Shanin, A R Shaimardanov, Nguyen Ti Diu Thai and S A Eremin (2014), “Determination of Fluoroquinolone Antibiotic Levofloxacin in Urine by 73 Fluoresence Polarization Immunoassay”, Journal of Analytical Chemistry 6, pp.712–717 43 S Schulte, T Ackermann, N Bertram, T Sauerbruch1, and W.D Paar (2006), “Determination of the Newer Quinolones Levofloxacin and Moxifloxacin in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection”, Journal of Chromatographic Science, 44, pp.205-208 44 Sung Joong Lee, Kebede Taye Desta, Seok Yong Eum, Veronique Dartois, Sang Nae Cho,Dong-Won Bae, Sung Chul Shin (2016), “ Development and validation of LC-ESI-MS/MS method for analysis of moxifloxacin and levofloxacin in serum of multidrug-resistant tuberculosis patients: Potential application as therapeutic drug monitoring tool in medical diagnosis”, Journal of Chromatography B, 1009-1010, pp.138–143 45 T Manish Kumar, Gurrala Srikanth, J Venkateshwar Rao, KRS Sambasiva Rao (2011), “Development and validation of hplc-uv method for the estimation of levofloxacin in human plasma”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3, pp.247-250 46 Vimal kumar Shahwal, Dr B.K Dubey and Mithun Bhoumick (2012), “Performulation study of Levofloxacin”, International Journal Advances in Pharmaceutics, 1(1) 47 VN Desai , Ozadheoghene E Afieroho, BO Dagunduro1 , TJ Okonkwo and CC Ndu1 (2011), “A Simple UV Spectrophotometric Method for the Determination of Levofloxacin in Dosage Formulations”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 10,pp.75-79 48 World Health Organization, (2010), “Levofloxacin draft proposal for the international pharmacopoeia” 49 William V Caufield and James T Stewart (2002), “Determination of zidovudine and levofloxacin in human plasma by reversed phase HPLC and 74 solid phase extraction”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 25, pp 1791-1805 50 Xinxing Gao, Guocan Yao, Na Guo, Fang An, Xingjie Guo (2007), “A simple and rapid high performance liquid chromatography method to determine levofloxacin in human plasma and its use in a bioequivalence study”, Drug Discov Ther,1(2), pp.136-140 51 Zhi-Ling Zhou, Min Yang, Xi-Yong Yu, Huai-Yan Peng, Zhi-Xin Shan, ShuZhen Chen, Qiu-Xiong Lin, Xiao-Ying Liu, Tie-Feng Chen, Shu-Feng Zhou and Shu-Guang Lin (2007), “A rapid and simple high-performance liquid chromatography method for the determination of human plasma levofloxacin concentration and its application to bioequivalence study”, Biomedical Chromatography, pp.1045-1051 75 ... HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH LEVOFLOXACIN TRONG DƢỢC PHẨM VÀ NƢỚC TIỂU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH Mã số: 60440118 NGƢỜI... độ thấp mẫu nƣớc tiểu Xuất phát từ lý nên chọn nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xác định Levofloxacin dƣợc phẩm nƣớc tiểu sắc ký lỏng hiệu cao" CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan Levofloxacin 1.1.1.Cấu... 2017 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu học tập em hoàn thành luận văn cao học với đề tài Nghiên cứu xác định Levofloxacin dƣợc phẩm nƣớc tiểu sắc ký lỏng hiệu cao" dƣới hƣớng dẫn bảo hai thầy