TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐẶNG MINH HƢƠNG GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN, FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2016 TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐẶNG MINH HƢƠNG GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN, FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH Chuyên ngành: Hóa môi trƣờng Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Giaoo viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Thị Kim Thƣờng Hà Nội – Năm 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Kim Thường giao đề tài tận tình hướng dẫn suốt trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô thuộc Bộ môn Hóa Phân tích Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG HN truyền đạt cho kiến thức vô quý báu suốt trình học tập nghiên cứu khoa Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc với bố, mẹ, gia đình bạn động viên, giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn đề tài QG 15.14 Đại học Quốc gia Hà nội hỗ trợ kinh phí cho thực nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học viên I MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN 1.1.1 Cấu tạo atorvastatin 1.1.2 Dƣợc lực học động học Atorvastatin Dược lực học Dược động học 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU FENOFIBRAT .4 1.2.1 Cấu tạo fenofibrat 1.2.2 Dƣợc lực học động lực học Fenofibrat Dược lực học Dược động học 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN, FENOFIBRAT 1.3.1 Các phƣơng pháp xác định atorvastin Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Phương pháp von-ampe 1.3.2 Các phƣơng pháp xác định fenofibrat Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp cực phổ von-ampe hòa tan 1.4 GIỚI THIỆU PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ 1.4.1 Nguyên tắc phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV) 1.4.2 Các kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan hấp phụ 11 Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (DP) 11 II Kỹ thuật sóng vuông 12 CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.1 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất Error! Bookmark not defined 2.2.1 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2.2 Dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.2.3 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch Error! Bookmark not defined Pha dung dịch Error! Bookmark not defined Pha dung dịch gốc atorvastatin fenofibrat Error! Bookmark not defined 2.3 Xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc atovastatinError! Bookmark not defined 2.3.2 Quy trình xử lý mẫu huyết tương xác định atorvastatin.Error! Bookmark not defined 2.3.3 Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc hỗn hợp atorvastatin fenofibrat Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.1 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ATORVASTATIN TRONG MẪU THUỐC BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE.ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.1.1 Khảo sát điều kiện xác định atorvastatinError! Bookmark not defined Nghiên cứu đặc tính điện hóa atorvastatin Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng pH Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng hấp phụ Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ Error! Bookmark not defined Khảo sát thời gian cân Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng tốc độ quét Error! Bookmark not defined III 3.1.2 Khảo sát khoảng tuyến tính đánh giá phƣơng phápError! Bookmark not defined Khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ)Error! Bookmark not defined Độ lặp lại Error! Bookmark not defined 3.1.3 Áp dụng thực tế phân tích hàm lƣợng atorvastatin mẫu thuốc thị trƣờng Error! Bookmark not defined Phân tích mẫu thuốc Lipivastatin 20mg công ty cổ phần hóa-dược phẩm Mekopha Error! Bookmark not defined Phân tích mẫu thuốc Avastor (10mg) công ty cổ phần Dược phẩm Boston Việt Nam Error! Bookmark not defined 3.1.4 Nghiên cứu quy trình định lƣợng atorvastatin mẫu huyết tƣơng Error! Bookmark not defined Khảo sát thành phần hỗn hợp dung dịch rửa tạp Error! Bookmark not defined Khảo sát hành phần hỗn hợp dung dịch rửa giải Error! Bookmark not defined 3.1.5 Xác định hiệu suất thu hồi atorvastatin mẫu huyết tƣơng.Error! Bookmark not defined 3.2 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG HỖN HỢP ATORVASTATIN VÀ FENOFIBRAT BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.2.1 Khảo sát điều kiện thích hợp Error! Bookmark not defined Nghiên cứu đặc tính điện hóa hỗn hợp atorvastatin fenofibrat Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng pH Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng hấp phụ Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ Error! Bookmark not defined Khảo sát ảnh hưởng tốc độ quét Error! Bookmark not defined 3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính đánh giá phƣơng phápError! Bookmark not defined Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩnError! defined IV Bookmark not Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp Error! Bookmark not defined Đánh giá độ lặp lại phép đo Error! Bookmark not defined 3.2.3 Áp dụng thực tế phân tích số hỗn hợp thuốc thị trƣờng Error! Bookmark not defined Phân tích hàm lượng atorvastatin mẫu thuốcError! Bookmark not defined Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng fenofibrat mẫu thuốc Error! Bookmark not defined Phân tích đồng thời hàm lượng atovastatin fenofibrat mẫu thuốc Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 V DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Tiếng anh Tiếng việt Viết tắt Anodic Stripping Voltammetry Von-ampe hòa tan a-nốt ASV Von-ampe hòa tan hấp phụ AdSV Asorptive Stripping Voltammetry Atorvastatin Ator Cathodic Stripping Von-ampe hòa tan ca-tốt CSV Von-ampe vòng CV Von-ampe hòa tan xung vi phân DPV Voltammetry Cyclic Voltammetry Differential pulse stripping Voltammetry Fenofibrat Feno Hanging Mercury Dropping Điện cực giọt thủy ngân treo Electrode HMDE High Perfomance Liquid Phương pháp sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao 10 Limit of Detection Giới hạn phát 11 Limit of quantityication Giới hạn định lượng LOQ 12 Mercury Film Electrode Điện cực màng thủy ngân MFE Von-ampe hòa tan sóng vuông SqW Điện cực giọt thủy ngân tĩnh SMDE Von-ampe hoà tan SV 13 14 15 Square-Wave Stripping Voltammetry Static Mercury Dropping Electrode Stripping Voltammetry VI HPLC GPPH (LOD) DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab.Error! Bookmark defined Hình 3.1: Đường von-ampe vòng atorvastatin 10-7mol.L-1Error! not Bookmark not defined Hình 3.2: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào pHError! Bookmark not defined Hình 3.3: Sự phụ thuộc cường độ dòng vào hấp phụError! Bookmark not defined Hình 3.4: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào hấp phụError! Bookmark not defined Hình 3.5: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ nồng độ chất phân tích 5.10-7M Error! Bookmark not defined Hình 3.6: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ nồng độ chất phân tích 10-8M Error! Bookmark not defined Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian hấp phụ Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thời gian cân Error! Bookmark not defined Hình 3.9: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian cân Error! Bookmark not defined Hình 3.10: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào tốc độ quét Error! Bookmark not defined Hình 3.11 Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét Error! Bookmark not defined Hình 3.12: Đường von-ampe hòa tan atorvastatin từ 10-8M đến 10-7M Error! Bookmark not defined Hình 3.13 Đường chuẩn atorvastatin từ 10-8M đến 10-7MError! Bookmark not defined Hình 3.14: Đường chuẩn atorvastatin từ 10-7M đến 10-6 MError! Bookmark not defined Hình 3.15: Đường von-ampe hòa tan mẫu thuốc mekophaError! Bookmark not defined VII Hình 3.16 Đường von-ampe hòa tan đo mẫu (10mg) công ty dược phẩm Boston phương pháp thêm chuẩn Error! Bookmark not defined Hình 3.17 Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa tạp Error! Bookmark not defined Hình 3.18 Đường von-ampe phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa giải Error! Bookmark not defined Hình 3.19 Đường von–ampe hòa tan atovastatin mẫu huyết tương Error! Bookmark not defined Hình 3.20: Đường CV atorvastatin fenofibrat.Error! Bookmark not defined Hình 3.21: Đường von-ampe vòng atorvastati fenofibrat phụ thuộc vào tốc độ quét Error! Bookmark not defined Hình 3.22: Phản ứng điện hóa atorvastatin Error! Bookmark not defined Hình 3.23: Phản ứng điện hóa fenofibrat Error! Bookmark not defined Hình 3.24: Sựphụ thuộc cường độ dòng píc vào pHError! Bookmark not defined Hình 3.25: Đường von-ampe hòa tan thay đổi pH từ 5,0 đến 9,0 Error! Bookmark not defined Hình 3.26: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào hấp phụ.Error! Bookmark not defined Hình 3.27: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào hấp phụError! Bookmark not defined Hình 3.28: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thời gian hấp phụ nồng độ chất phân tích 5.10-7M Error! Bookmark not defined Hình 3.29: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ nồng độ chất phân tích 5.10-7M Error! Bookmark not defined Hình 3.30 Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét Error! Bookmark not defined Hình 3.31: Đường von-ampe hòa tan hỗn hợp fenofibrat atorvastatin Error! Bookmark not defined ( fenofibrat : atorvastatin = 1: 3) Error! Bookmark not defined Hình 3.32.Đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc –log C fenofibrat vào cường độ dòng I Error! Bookmark not defined Hình 3.33 Đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc –log C atorvastatin vào cường độ dòng I Error! Bookmark not defined VIII CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN 1.1.1 Cấu tạo atorvastatin Atorvastatin có tên khoa học theo IUPAC: (3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-5-propan-2-ylpyrrol-1-yl]-3,5axit dihydroxyheptanoic biết đến với tên thương mại Lipitor hay Atorva [1] Công thức cấu tạo atorvastatin Hình 1.1: Công thức cấu tạo Atorvastatin Công thức phân tử C33H35FN2O5, khối lượng mol 558,64 (g/mol) Ngoài hoạt chất hay sử dụng thuốc atorvastatin có hoạt chất atorvastatin canxi có công thức cấu tạo hình 1.2 Hình 1.2: Công thức cấu tạo Atorvastatin canxi Atorvastatin canxi có tên khoa học theo IUPAC là: (bR, dR)-2-(rfluorophenyl)-b,ddihydroxy-5-isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl) pyrrole-1hepatanoicacid(1:2)trihydrate Công thức phân tử C18H68CaF2N4O10.3H2O hay (C33H34FN2O5)2Ca.3H2O[1] Atrovastatin canxi có khối lượng mol là1155,34 g/mol[1] Atorvastatin dạng muối Atorvastatin canxi tồn dạng bột tinh thể tan nước: 20,4 µg/mL (pH = 2,1); 1,23 mg/mL (pH = 6,0), tan etanol, tan tốt methanol [1] 1.1.2 Dƣợc lực học động học Atorvastatin Dược lực học Atorvastatin chất ức chế cạnh tranh chọn lọc men khử 3-hydroxy-3methylglutaryl-coemzym A (HMG-CoA), ức chế trình chuyển hóa HMG-CoA thành mevalonat, tiền chất sterol, bao gồm cholesterol Do atovasttin có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol triglicelid máu Dược động học Atorvastatin hấp thu nhanh chóng sau uống, nồng độ thuốc huyết tương tối đa đạt vòng 1-2 Mức độ hấp thu nồng độ atorvastatin tăng tỉ lệ với liều lượng atorvastatin Atorvastatin dạng viên nén có độ khả dụng sinh học 95-99% so với dạng dung dịch Độ khả dụng sinh học tuyệt đối Atorvastatin khoảng 14% độ khả dụng toàn thân hoạt động ức chế men khử HMG-CoA khoảng 30% Khoảng 98 % atorvastatin gắn kết với protein huyết tương.Nồng độ thuốc huyết tương dùng thuốc buổi chiều tối thấp dùng buổi sáng, nhiên nồng độ thuốc huyết tương xấp xỉ 0,25 % cho thấy thấm thuốc vào tế bào hồng cầu thấp, hiệu giảm LDL [2, 3] Thời gian bán hủy atovastatin huyết tương người 14 Dưới 2% lượng atorvastatin uống vào tìm thấy nước tiểu [2, 3] 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU FENOFIBRAT 1.2.1 Cấu tạo fenofibrat Fenofibrat có tên khoa học theo IUPAC propan-2-yl{2-4-[(4-clophenyl) cacbonyl] phenoxy}-2-methylpropanoat biết với tên thương mại tricor, dẫn xuất axit fibric Công thức cấu tạo fenofibrat: Hình 1.3 Công thức cấu tạo Fenofibrat Công thức phân tử fenofibrat: C20H21ClO4 Khối lượng mol (g/mol): 360,831 1.2.2 Dƣợc lực học động lực học Fenofibrat Dược lực học Fenofibrat, dẫn chất acid fibric, thuốc hạ lipid máu Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol gan, làm giảm thành phần gây xơ vữa động mạch làm giảm triglycerid máu Do đó, cải thiện đáng kể phân bố cholesterol huyết tương Dược động học Fenofibrat hấp thu tốt từ đường dày ruột sau uống Trong nghiên cứu người tình nguyện khoẻ mạnh, khoảng 80% liều fenofibrat đánh dấu đồng vị phóng xạ xuất nước tiểu chủ yếu dạng acid fenofibric phức hợp glucuronide 25% tiết phân Nồng độ đỉnh huyết tương acid fenofibric xảy vòng đến sau uống Không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng huyết tương 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN, FENOFIBRAT Atovastatin, fenofibrat xác định nhiều phương pháp khác phương pháp quang học, phương pháp sắc ký, phương pháp von-ampe 1.3.1 Các phƣơng pháp xác định atorvastin Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Atorvastatin mẫu dược phẩm xác định phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng cột C18 [18,20,24], detector UV detector huỳnh quang Các tác giả sử dụng số pha động có thành phần khác acetonnitril: nước cất (85:15) pH=4,5, khoảng tuyến tính atorvastatin khoảng 2-12 mg/ml, hiệu suất thu hồi atorvastatin xác định đạt 99,03% [24]; acetonitril: photphat (C = 0,015 M, pH = 3, tỉ lệ thể tích v/v = 45 : 55) [18] hay pha động hỗn hợp acetonitril : nước = 48 : 52, = điều chỉnh axit orthophotphoric, khoảng tuyến tính thuốc 0,04 - 0,4 mg/mL, hệ số tương quan R2 = 0,999 [20] Thời gian lưu atorvastatin phụ thuộc vào thành phần pha động, detector sử dụng Phương pháp HPLC có ưu điểm cao độ nhạy, độ xác cao, tốn thiết bị đắt tiền quy trình phân tích phức tạp Phương pháp HPLC phù hợp với phòng thí nghiệm kiểm soát chất lượng tuyến trung ương Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Baldha [19] cộng sử dụng phương pháp quang phổ vùng tử ngoại để xác định atorvastatin thuốc hai bước sóng hấp thụ λ = 227 nm 246,5 nm, khoảng tuyến tính từ - 30 mcg/ml Tác giả Jadhav xác định atorvastatin cách cho tạo phức màu xanh với FeCl30,3 % K3[Fe(CN)6]0,02 % Phức màu xanh đo ước sóng hấp thụ cực đại 787 nm Hiệu suất thu hồi atorvastatin canxi đạt khoảng từ 99,26 % đến 100,12 % [19] Phương pháp von-ampe Tác giả Ramadan [17] cộng sử dụng phương pháp cực phổ xung vi phân điện cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) để xác định atorvastatin mẫu dược phẩm Các điều kiện đo tiến hành pH = 7,5, biên độ xung 100mV, khoảng quét - 0,9 V ÷ -1,5V, bước mV, thời gian xung 40 ms, tốc độ quét 5,714 mV/s, giới hạn phát (LOD)là 0,024μg.ml-1 giới hạn định lượng (LOQ) 0,071 μg.ml-1, hiệu suất thu hồi từ 97,0 đến 100,5 % Tác giả Wli Mohammadi [23] xác định đồng thời amlodipin atorvastatin canxi điện cực graphit biến tính bề mặt nano cacbon So với điện cực glassy cabon điện cực graphit có diện tích bề mặt độ dẫn điện tốt nên có độ nhạy tốt Bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ xác định khoảng tuyến tính 2,5 đến 100 µg/ml với độ lệch chuẩn amlodipin 2,7 đến 7,1% atorvastatin canxi 1,8 đến 8,3%, giới hạn phát chất µg/ml điều kiện pH=6 Các điện cực glassy bon điện cực graphene oxit sử dụng để xác định atorvastatin môi trường pH từ 2,0 đến 4,5 phương pháp vonampe hòa tan hấp phụ Hơn nữa, điện cực rắn biến tính có triển vọng ứng dụng phân tích dược môi trường điện cực rắn có khoảng làm việc rộng, không độc hại, thân thiện với môi trường, tự chế tạo 1.3.2 Các phƣơng pháp xác định fenofibrat Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Tác giả [29] nghiên cứu xác định fenofibrat phương pháp đo quang mẫu dược phẩm sử dụng hai thuốc thử khác Với thuốc thử methylen xanh (MTB) fenofibrat phản ứng với MTB dung môi cloroform dùng dịch đệm axit phthalat pH = 2,4 tạo phức chất màu xanh, có cực đại hấp thụ 630nm, khoảng tuyến tính tuân theo Định luật Beer đến 15 mg/ml với độ lệch chuẩn phương pháp 0,86% Ở phương pháp thứ hai, tiến hành phương pháp đầu dựa phản ứng fenofibrat với saffarin tạo thành phức màu hồng độ hấp thụ quang đo 520nm, khoảng tuyến tính thu được: 10 – 30µg/ml độ lệch chuẩn phương pháp 0,903% Đo mẫu dược phẩm 200mg đạt hiệu suất thu hồi phương pháp tương ứng 99,16% 99,35% Một nghiên cứu khác fenofibrat xác định mẫu dược phẩm sử dụng thuốc thử MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride) Dựa việc đo độ hấp thụ fenofibrat hỗn hợp metanol (0,5% MBTH, 0,5% HCl, 1% FeCl3) thu cực đại hấp thụ 596nm, khoảng tuyến tính 2-5µg/ml, độ lệch chuẩn phương pháp 0,7719%, hiệu suất thu hồi 99,36 % [8] Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tác giả N.Jain xây dựng quy trình xác định đồng thời atorvastatin canxi feniobrat phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo sử dụng cột tách C18 (250mmx46mm,5µm) Pha động gồm metanol/đệm acetate pH= 3,7 với tỉ lệ 82:18 (v/v) lọc trước qua màng lọc 0,45µm Tốc độ dòng chảy 1,5ml/min, detector UV-VIS đo bước sóng 248nm, thời gian lưu fenofibrat xác định 9,05 ± 0,2min Khoảng tuyến tính 16-80mg/ml với hệ số tương quan > 99,9% độ lệch chuẩn phương pháp 0,79% Thực xác định thuốc với mẫu dược phẩm 32µg/ml đạt hiệu suất thu hồi 100,6%, hệ số biến thiên 0,0038 [25] Tác giả Suresh Kumar xác định fenofibrat phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao pha đảo sử dụng cột phân tích Inertsil ODS, 250x4,6mm, cột 5µ) Pha động hỗn hợp nước (điều chỉnh đến pH=2,5 với axit ortho phosphoric acetonitril với tỉ lệ 30:70(v/v), tốc độ dòng chảy 1,0 ml/min, detector UV-Vis đo bước sóng 286 nm, thời gian lưu fenofibrat 20,5min, khoảng tuyến tính 1000-3000µg/ml với hệ số tương quan >0,999 Giới hạn xác định giới hạn phát 0,45µg/ml 0,14µg/ml [26] Một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xác định đồng thời ezeimibe, atorvastatin fenofibrate Sử dụng cột tách C18 (5µm, 280mm x 4,6mm) với thành phần pha động hỗn hợp nước - acetonitril nhiệt độ phòng, detector PDA, khoảng tuyến tính fenofibrat 32-160µg/ml với hệ số tương quan 0,994 Giới hạn phát giới hạn định lượng 1,9544µg/ml 3,6225µg/ml tương ứng Độ lệch chuẩn phương pháp nhỏ 2% [27] Phương pháp cực phổ von-ampe hòa tan Tác giả Ceren Yardimci xác định fenofibrat mẫu thuốc phương pháp von-ampe hòa tan sóng vuông điện cực giọt thủy ngân treo (HDME) với điều kiện: Dung dịch đệm borat pH = 9,0 có chứa tetrabutylammoni iodua ( C16H36IN) 0,01M 12,5%(v/v) metanol, thời gian sục khí N2 để loại oxi 10 phút, khoảng đo từ -0,6V đến -1,4V, tốc độ quét 250mV/s, tần số sóng 15Hz, biên độ xung 20mV, bước 4mV, đỉnh píc E=-1,2V, khoảng tuyến tính 0,146-4,96µg/ml, giới hạn phát 0,025µg/ml Tác giả ứng dụng phương pháp để xác định mẫu thuốc có hàm lượng fenofibrat 250mg thu hiệu suất thu hồi 102,44% [28] Hiện nay, phương pháp cực phổ sử dụng hệ xúc tác hướng quan trọng ngành phân tích điện hóa Đặc biệt hệ xúc tác hydro áp dụng với chất hữu làm tăng độ nhạy phân tích giúp nghiên cứu trình điện cực động học phản ứng hóa học Một nghiên cứu sử dụng phương pháp cực phổ dùng xúc tác hydro để xác định fenofibrat Fenofibrate muối axit fenofibric dạng thủy phân chứa nhóm cacbonyl, nhóm nhường 2e/2H+ trình điện phân thành pic tương ứng môi trường axit Trong điều kiện thường, fenofibrat thủy phân hoàn toàn với muối axit fenofibric có pic xuất xác định Khi có mặt K2S2O8 cường độ dòng pic xúc tác, giới hạn phát phương pháp 4.10-5mg/ml Qua tổng quan tài liệu phương pháp xác định atorvastatin fenofibrat cho thấy, phương pháp von-ampe nghiên cứu để xác định chúng mẫu thuốc mẫu sinh học, nhiên đặc tính điện hóa chúng điện cực giọt thủy ngân treo chưa sáng tỏ, đặc biệt chưa thấy có công trình nghiên cứu xác định đồng thời chúng mẫu thuốc Chính vậy, lựa chọn phương pháp von-ampe để nghiên cứu đặc tính điện hóa atorvastatin, fenofibrat ứng dụng phân tích 1.4 GIỚI THIỆU PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ 1.4.1 Nguyên tắc phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV) Quy trình phân tích theo phương pháp AdSV cũng đư ợc thực qua ba giai đoạn: giai đoạn làm giàu động, giai đoạn dừng giai đoạn hòa tan tĩnh [14,15] Phương pháp AdSV giống phương pháp von-ampe hoà tan, có điểm khác so với phương pháp von-ampe hoà tan chế trình làm giàu (hay trình tích luỹ chất bề mặt điện cực), làm giàu cách hấp phụ chất phức chất kim loại với phối tử lên bề mặt điện cực làm việc tiếp xúc dung dịch Sau làm giàu phân cực hoà tan phương pháp von-ampe hoà tan Cơ chế tổng quát giai đoạn làm giàu phương pháp AdSV sau: Trước hết phức ion kim loại với phối tử hữu hình thành sau thêm phối tử vào dung dịch phân tích, phức tích luỹ cách hấp phụ (điện hóa, vật lý, hóa học) lên ranh giới tiếp xúc dung dịch -điện cực làm việc Trong thời gian làm giàu, điện cực làm việc giữ không đổi, dung dịch đo khuấy Thông thường AdSV thực hầu hết loại điện cực dùng von-ampe, ví dụ như: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, điện cực có biến tính hoá học Tuy nhiên hầu hết nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV sử dụng điện cực HMDE điện cực có nhiều ưu điểm: bề mặt tự làm lặp lại, dễ tự động hoá Sau giai đoạn làm giàu giai đoạn dừng để chất phân bố bề mặt điện cực Tiếp theo giai đoạn hòa tan, ghi tín hiệu hòa tan cách quét theo chiều catot, tức quét âm dần để khử chất hấp phụ bề mặt điện cực làm việc, phức chất ion kim loại với phối tử tạo phức chất phân tích (chất hữu cơ) đồng thời ghi tín hiệu hòa tan kỹ thuật von-ampe đó, chẳng hạn: von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), phương pháp gọi von-ampe hòa tan catot hấp phụ xung vi phân (DP-AdSV) von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW) phương pháp gọi von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông (SW-AdSV) Ngược lại, ghi tín hiệu hòa tan cách quét theo chiều anot, tức quét dương dần để oxi hóa chất hấp phụ bề mặt điện cực làm việc ghi tín hiệu hòa tan kỹ thuật von-ampe Đối với phương pháp AdSV, tín hiệu hòa tan thu có dạng đỉnh Thế đỉnh hòa tan (Ep) cường độ dòng đỉnh hòa tan (Ip) phụ thuộc vào yếu tố như: thành phần nền, phối tử ta ̣o phức , pH, thời gian tích lũy, tích lũy, chất của điện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan Trong điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho chất điện hóa chất phân tích dùng để phân tích định tính Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích dung dịch, Ip dùng để phân tích định lượng Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích ion kim loại xác định kĩ thuật cực phổ thông thường (hay trình xác định phức tạp) Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay chất hữu Cũng von-ampe hoà tan thông thường phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ nhạy so với phương pháp đo von-ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ) Ngoài ưu điểm trên, phương pháp AdSV có ưu điểm riêng so với phương pháp SV như: 10 - Độ nhạy AdSV thường lớn nhiều so với ASV kim loại không hoà tan thuỷ ngân mà tạo thành lớp phức đơn phân tử, ví dụ điện cực màng thuỷ ngân - Xác định nhiều kim loại độ chọn lọc cao so với phương pháp ASV CSV lựa chọn nhiều thuốc thử tạo phức bền chọn lọc với kim loại cần phân tích - AdSV đặc biệt tỏ có ưu điểm phân tích chất có hoạt tính sinh học, dược phẩm, (có khả hấp phụ bề mặt điện cực giọt Hg), chất khả khử điện hoá điện cực giọt xác định sau dẫn xuất hoá cách gắn với nhóm dễ khử nitroso, nitro… thủy phân tạo thành chất có hoạt tính điện hóa - Một điểm đặc biệt phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ dựa vào đặc tính hấp phụ ta giải toán liên quan đến trình điện cực, chế phản ứng xảy điện cực - Phương pháp AdSV loại trừ ảnh hưởng yếu tố cản trở cách chọn điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, điện phân làm giàu và thế hấ p phu ̣ làm giàu 1.4.2 Các kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan hấp phụ Trong phương pháp AdSV, kỹ thuật sử dụng để ghi đường von-ampe hòa tan von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), von-ampe xung thường (Normal Pulse - NP) von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW), tên phương pháp gắn thêm tên kỹ thuật đo, chẳng hạn như: Von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân DP-AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ xung thường NP AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông SW-AdSV Trong luận văn, sử dụng kĩ thuật quét xung vi phân kỹ thuật quét sóng vuông Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (DP) Trong kỹ thuật xung vi phân, điện cực phân cực điện áp chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm vào cuối chu kì xung khung điện áp biến đổi chiều người ta đặt thêm xung vuông góc với biên độ 11 thay đổi từ 10-100mV độ dài xung từ 40-100ms Cường độ dòng ghi hai lần, lần thời điểm i1, thường 17ms trước nạp xung lần hai 17ms trước cắt xung, lúc ghi dòng cực phổ tác dụng xung Hai giá trị gửi vào so sánh kết ghi hiệu số hai giá trị Tín hiệu có dạng cực đại Kỹ thuật sóng vuông Theo kỹ thuật này, điện cực phân cực điện áp chiều biến thiên đều, đặt chồng lên điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số từ Hz đến 2000 Hz, biên độ từ đến 50mV Trong chu kỳ xung, dòng đo hai lần: thời điểm (dòng dương I1) thời điểm (dòng âm I2) Dòng thu hiệu hai giá trị dòng (Ip = I1 – I2) Ip hàm áp vào điện cực làm việc Đối với chất có tính thuận nghịch kỹ thuật hòa tan sóng vuông có độ nhạy cao kỹ thuật xung vi phân 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Dược điển Việt Nam (2009), tái xuất lần thứ 4, Nhà xuất Y dược Dược lý học lâm sàng (2009), Trường đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Dược thư quốc gia Việt Nam (2011), Bộ Y tế, Nhà xuất Y học Lê Quốc Hùng, Vũ Thị Thu Hà (2006), “Sự phát triển xu khả sử dụng điện cực màng thủy ngân phân tích điện hóa”, Tạp chí hóa học, Viện hóa học, Viện khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Văn Ri (2012), “Các phương pháp phân tích công cụ”, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên–Đại Học Quốc Gia Hà Nội Phạm Luận (1998),Giáo trình vấn đề sở kỹ thuật xử lý mẫu phân tích, Khoa hóa học, Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Phạm Luận (1989), Sổ tay pha chế dung dịch, Bộ môn hóa phân tích, Khoa hóa học, Đại học Tổng hợp Hà Nội Tạ Thị Thảo (2006), Chuyên đề thống kê hóa phân tích, Đại Học Quốc Gia Hà Nội Từ Vọng Nghi ( 1969) , Phương pháp phân tích cực phổ - Các tập môn phân tích – Khoa hóa học – Đại học Tổng hợp 10 Từ Vọng Nghi, Trần Chương Huyến, Phạm Luận (1990), Một số phương pháp phân tích điện hóa đại, Đại học tổng hợp Hà Nội 11 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2006), “Hóa học phân tích”, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên–Đại Học Quốc Gia Hà Nội 12 Trương Xuân Hà (2014), Thuốc giả ngành công nghiệp tội lỗi, Sức khẻo & đời sống, Cơ quan ngôn luận Y tế, Hà Nội 13 Trung kiên (2015), Sóng ngầm thuốc giả, An ninh thủ đô, Cơ quan công an thành phố Hà Nội, Hà nội 13 Trần Chương Huyến, Nguyễn Thị Kim Thường (2010), Xác định cephalexin phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý sinh học, T.15(3), tr 166-172 14 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 15 Từ Vọng Nghi (2011), Các phương pháp phân tích điện hóa đại, (Chuyên đề cho học viên cao học nghiên cứu sinh chuyên ngành hóa phân tích, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN) 16 Lê Đức Ngọc (1999), Xử lí số liệu kế hoạch hóa thực nghiệm, Đại học Quốc gia Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 ABDul Aziz Ramadan, Hasna Maldil and Bahaa Hafez (2013), “Differential pulse polarography of ator vastatin in pure and pharmaceutical dosage forms using static mercury drop electrode”, Academic Sciences, Vol.5, Issue 1, PP 434-440 18 BaHiA Moussa, Asmaa A, El-Zaler, Marianne A Mahrouse and Maha S Ahmed (2013), “Simultaneous Determination of Amlodipine Besylater and Atorvastatin Calcium in Binary Mixture by Spectrofluorimetry and HPLC Coupled with Fluorescence Detection” 19 Baldha R.G, Patel Vandana B and Mayank Bapna (2009), “Simultaneous Spectrophotometric determination of Atorvastatin Calcium and Ezetimibe in tablet dosage form”, CODEN (USA), Vol.1, No.2, PP 233-236 20 Beata Stanisz and Lukasz Kania (2006), “Validation of HPLC method for determination of atorvastatin in tablets and for monitoring stability in solid 14 phase”, Acta Poloniae Pharmaceutica- Drug Research, Vol 63 No.6, PP 471-476 21 Kishore Kumar Hotha, Narasimha Reddy Yarramu, Thriveni Kandibedala Vijaya Bharathi Dasari, Venkateswarlu Vobalaboina (2012), “Simutaneous determination of Atorvastatin and Glimepiride by LC-MS/MS in Human plasma and Its application to a pharmacokinetic study”, American Jourak of Analutical Chemistry, PP 559-569 22 Swapnil D Jadhav, Manish S Bhatia, Shivaji L Thamake (2010), “Spectrophotometric methods for Estimation of Atorvastatin Calcium form tablet dosage forms”, CODEN (USA), Vol.2, No.3, PP 19478-1953 23 Wli Mohammadi (2013), “Electro- oxidation and simultaneous determination of amlodipine and atorvastatin in commercial tablets using nanotube modified electrode”, Micro & Nano Letters, Volume 8, Issue 8, p 413-417 24 Jaiprakash N Sangshetti (2012), “Development and validation of RP-HPLC method for determination of Atorvastatin calcium and Nicotinic acid in combined tablet dosage form”, Journal of Saudi Chemical Society, Available online 20 December 2012 25 N Jain, R Raghuwanshi, and Deepti Jain(2008)Development and validation of RP-HPLC method for simultaneous estimation of atorvastatin calcium and fenofibrate in tablet dosage forms”,Indian J Pharm Sci, 2008, 70 (2): 263265 26 Suresh Kumar and Rajendraprasad (2010),“Development and Validation of Reversed-Phase HPLC Method for Simultaneous Estimation of Rosuvastatin and Fenofibrate in Tablet Dosage Form”,International Journal of PharmTech Research CODEN (USA), Vol.2, No.3, pp 2016-2021 27 Sahu, Murthy, Srinivas and Swain (2016), “Simultaneous RP-HPLC Method Development and Validation of Atorvastatin, Ezetimibe Fenofibrate”,Sahu et al., Pharmaceut Reg Affairs, 2016, 5:2 15 and 28 Ceren Yardımcı, Nuran Özaltın (2004), “Electrochemical studies and squarewave voltammetric determination of fenofibrate in pharmaceutical formulations”,Analytical and Bioanalytical Chemistry, Volume378,Issue 2, pp 495–498 29 Korany MA, Ismail HI; , Karim Abdel-Hay M, “Determination of etofibrate, fenofibrate, and atorvastatin in pharmaceutical preparations and plasma using differential pulse polarographic and square wave voltammetric techniques”, Journal of AOAC International, 2008;91(5):1051-1058 30 Suma BV, Kannan K, Madhavan V, Chandini R Nayar, “Simultaneous estimation and validation of atorvastatin calcium and nicotinic acid in combined tablet dosage form by RP HPLC method” Int J Pharmacy and Pharm Sci, 2012; 4, (1): 369-372 31 Shah Y, Iqbal Z, Ahmad L, Khan A, Khan MI, Nazir S, Nasir F, “Simultaneous determination of rosuvastatin and atorvastatin in human serum using RPHPLC/UV detection: Method development, validation and optimization of various experimental parameters” J Chromatogr B, 2011; 879(9–10): 557563 32 Dogan-TopalBurcu, UsluBengi, OzkanSibel A,”Investigation of electrochemical behavior of lipid lowering agent atorvastatin calcium in aqueous media and its determination from pharmaceutical dosage forms and biological fluids using borondoped diamond and glassy carbon electrodes” Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening,2007; 10(7): 571-582 33 Erk N, “Development of electrochemical methods for determination of atorvastatin and analytical application to pharmaceutical products and spiked human plasma” Crit Rev Anal Chem, 2004; 34 :1–6 34 A.A Kadav, D.N Vora, “Stability indicating UPLC method for simultaneous determination of atorvastatin, fenofibrate and their degradation products in tablets” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 48, Issue 1, 10 September 2008, Pages 120–126 16 35 NV Nakarani et al,” Estimation of Atorvastatin Calcium and Fenofibrate in Tablets by Derivative Spectrophotometry and Liquid Chromatography”, J AOAC Int 90 (3), 700-705 May-Jun 2007 36 Nagaraj, Simultaneous Quantitative Resolution of Atorvastatin Calcium and Fenofibrate in Pharmaceutical Preparation by Using Derivative Ratio Spectrophotometry and Chemometric Calibrations Analytical Sciences 23(4):445-51 · May 2007 37 Mohamed A Korany, Ismail I Hewala, Karim M Abdel-Hay Determination of etofibrate, fenofibrate, and atorvastatin in pharmaceutical preparations and plasma using differential pulse polarographic and square wave voltammetric techniques J AOAC Int 2008; 91:1051-8 38 Rupali H, Ravindra B, Manish K RP-HPLC method for simultaneous estimation of atorvastatin calcium and fenofibrate in tablet dosage forms J Pharm Res 2010;3:2400-1 39 Choudhari VP, Nikalje AP Simultaneous estimation of atorvastatin, ezetimibe and fenofibrate in pharmaceutical formulation by RP-LC-PDA Pharm Anal Acta 2010;1:111-5 40 Dhabale PN, Gharge DS Simultaneous spectrophotometric estimation of atorvastatin and fenofibrate in bulk drug and dosage form by using simultaneous equation method Int J ChemTech Res 2010;2:325-8 41 R Sahu, and Patel V.B., Simultaneous spectrophotometric determination of amlodipine besylate and atorvastatin calcium from their binary mixture by dual wavelength and zero absorbance measurement, Indian Drugs, 2006, 43(2), 160-161 42 Dhaneshwar S S., Dhaneshwar S R., Deshpande P and Patil M., Development and validation of a method for simultaneous densitometric estimation of atorvastatin calcium and ezetimibe as the bulk drug and in tablet dosage forms, ACTA Chromatographica, 2007, 19, 141-148 17 ... tỏ, đặc biệt chưa thấy có công trình nghiên cứu xác định đồng thời chúng mẫu thuốc Chính vậy, lựa chọn phương pháp von- ampe để nghiên cứu đặc tính điện hóa atorvastatin, fenofibrat ứng dụng phân. .. chất điện hóa chất phân tích dùng để phân tích định tính Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích dung dịch, Ip dùng để phân tích định lượng Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích. .. HỌC TỰ NHIÊN - ĐẶNG MINH HƢƠNG GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN, FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH Chuyên ngành: Hóa môi trƣờng Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ