Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN XUÂN HUY XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội– Năm 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN XUÂN HUY XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội– Năm 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 Lời cảm ơn Đề tài luận văn đƣợc thực Khoa Di Truyền Sinh học phân tử bệnh viện NHI TW Đầu tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, chủ nhiệm môn Di truyền học, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Cô hết lòng quan tâm, hƣớng dẫn, bảo tận tình suốt trình nghiên cứu vừa qua Mỗi lúc gặp khó khăn, cô động viên, giúp đỡ tìm cách giải hợp lý Sự giúp đỡ hƣớng dẫn nhiệt tình cô giúp tôihoàn thành đƣợcluận văn tốt nghiệp Tôi xin đƣợc cảm ơn đồng nghiệp khoa Di Truyền Sinh học phân tử – Bệnh viện Nhi TW nhiệt tình giúp đỡtrong thời gian thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh học, trƣờng Đại học khoa học tự nhiên giảng dạy tạo điều kiện tốt để thực tốt việc nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình bạn bè giúp đỡ, ủng hộ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày …… tháng …… năm 2016 Học viên Nguyễn Xuân Huy Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU .4 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh 1.2.1 Đặc điểm lâm sàng 1.2.2 Phân loại u NBTK 1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK 1.2.4 Một số yếu tố tiên lƣợng u NBTK 10 1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh 14 1.3.1 Khuếch đại gen MYCN .14 1.3.2 Các bất thƣờng nhiễm sắc thể .17 1.4 Mô hình di truyền u NBTK .19 1.5 Tính cấp thiết đề tài 20 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2 Hóa chất thiết bị 22 2.2.1 Hóa chất 22 2.2.2 Trang thiết bị 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Nuôi cấy tế bào mẫu bệnh phẩm tủy xƣơng 22 2.3.2 Phản ứng lai huỳnh quang chỗ 23 2.4 Footer Page of 126 Đạo đức nghiên cứu 24 Header Page of 126 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .26 3.1 Xác định khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u NBTK kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH) 26 3.2 Đánh giá khuếch đại gen MYCN với số yếu tố tiên lƣợng khác 31 3.2.1 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tuổi 31 3.2.2 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới tính 33 3.2.3 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo mô bệnh học 34 KẾT LUẬN .39 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Footer Page of 126 Header Page of 126 Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt COG Children’s Oncology Group Tổ chức Ung thƣ Trẻ em DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DMs Double-Minute chromatin bodies Đoạn nhiễm sắc thể kép ngắn FBS Fetal Bovine Serum Huyết phôi bò FISH Fluorescent in-situ hybridization Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ HSR Homogeneously Staining Vùng bắt màu đồng Regions INPC International Neuroblastoma Hiệp hội Giải phẫu bệnh U Pathology Committee INRGSS International nguyên bào thần kinh Quốc tế Neuroblastoma Hệ thống phân giai đoạn u Risk Group Staging System nguyên bào thần kinh theo nhóm nguy INSS International Neuroblastoma Hệ thống phân giai đoạn u Staging System nguyên bào thần kinh MBH Mô bệnh học MKI Mitosis karyorrhexis Index NBTK Nguyên bào thần kinh RPMI Roswell Park Memorial Institute SSC Saline Sodium Citrate Muối Natri Citrate DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT Footer Page of 126 Chỉ số nhân chia/nhân tan Header Page of 126 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INSS Bảng 1.2 Các giai đoạn theo INRGSS 10 Bảng 1.3 Chỉ số MKI 13 Bảng 1.4 Bảng phân loại mô bệnh học 14 Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào 22 Bảng 3.1 Kết xác định gen MYCN bệnh nhân UNBTK 28 Bảng 3.2 Danh sách 11 bệnh nhân u NBTK có khuếch đại gen MYCN 29 Bảng 3.3 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31 Bảng 3.4 Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31 Bảng 3.5 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK 34 Bảng 3.6 Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK 35 Bảng 3.7 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học 36 Bảng 3.8 Phân bố khôngkhuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học 37 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các vị trí xuất khối u[26] Hình 1.2 Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy [34] 11 Hình 1.3 Cơ chế khuếch đại gen [27] 16 Hình 1.4 Mô hình di truyền phát triển u nguyên bào thần kinh [10] 19 Hình 2.1 Vị trí đánh dấu huỳnh quang nhiễm sắc thể số 24 Hình 3.1 Khuếch đại gen MYCN tế bào u 26 Hình 3.2 Khuếch đại gen MYCN tế bào tủy xƣơng 27 Hình 3.3 Khuếch đại gen MYCN theo dạng HSR DMs 27 Hình 3.4 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN bệnh nhân U NBTK 29 Hình 3.5 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31 Hình 3.6 Tỷ lệ khuếch không đại gen MYCN theo nhóm tuổi 32 Hình 3.7 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới 33 Hình 3.8 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới 33 Hình 3.9 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u 34 Hình 3.10 Tỷ lệ không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u 35 Hình 3.11 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lƣợng MBH 36 Hình 3.12 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lƣợng MBH 37 Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Ung thƣ rối loạn phát triển tế bào, tế bào tăng sinh không kìm hãm, kết hình thành khối u thể Khối u tập hợp tế bào có chung đặc điểm phát triển vô tổ chức, xâm lấn chèn ép vào quan tổ chức xung quanh Ung thƣ xảy lứa tuổi,trong ung thƣ nhi chiếm khoảng 2% tổng số loại ung thƣ U nguyên bào thần kinh dạng khối u bào thai c hệ thần kinh giao cảm , tế bào khởi đầu tế bào tiền thân phát triển chƣa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh, chủ yếu xảy trẻ sơ sinh trẻ nhỏ (dƣới tuổi), tìm thấy trẻ 10 tuổi Bê ̣nh chiếm khoảng 7% số ca ung thƣ ở trẻ em toàn th ế giới [43] Tỷ lệ mắc bệnh viện Nhi Trung Ƣơng khoảng 50 ca/năm Con số ổn định nhiều năm gần Độ tuổi chẩn đoán bệnhtrung bình 18 tháng Các biến đổi di truyền tế bào ung thƣ phong phú, từ bất thƣờng cấu trúc, số lƣợng nhiễm sắc thể đến đột biến gen; dẫn đến làm thay đổi hoạt động tế bào Tuy nhiên, có vài chuyển đoạn hay đột biến gen đặc trƣng loại ung thƣ định, ví dụ nhƣ 90% bệnh nhân mắ c u lympho thể Burkitt có chuyể n đoa ̣n đă ̣c trƣ ng t(8;14) (đầu nhiễm sắc thể đƣợc chuyển đến phần cuối nhiễm sắc thể 14) hay 20-25% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh có đột biến khuếch đại gen MYCN[40] Hiện bất thƣờng di truyền đƣợc sử dụng rộng rãi giới việc tiên lƣợng phân nhóm nguy cho b ệnh nhân u nguyên bào thần kinh Tuy vậy, Việt Nam, việc phát biến đổi di truyền chƣa đƣợc thực hiện, gây nhiều khó khăn cho bác sĩ lâm sàng vi ệc tiên lƣợng bê ̣nh lƣ̣a chọn phác đồ ều trị cho bệnh nhân Vì vậy, từ nhiều năm nay, việc cần thiết có xét nghiệm di truyền cho bệnh u nguyên bào thần kinh đƣợc đặt Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn nhƣ vậy, nghiên cứu đề tài “Xác định khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ” đƣợc thực với mục tiêu sau: Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 - Phát khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ - Xác định đượcsự liên quan với yếu tố tiên lượng khác ý nghĩa khuếch đại gen MYCN Footer Page 10 of 126 Header Page 15 of 126 Hệ thống phân loại INRGSS (International Neuroblastoma Risk Group Staging System) (Bảng 1.2) sử dụng hệ thống yếu tố nguy hình ảnh chặt chẽ[28] Bảng 1.2 Các giai đoạn theo INRGSS Giai đoạn Lâm sàng L1 Khối u khu trú không liên quan đến tạng thiết yếu giới hạn bên thể L2 Khối u khu trú khu vực kèm theo nhiều yếu tố nguy hình ảnh M Bệnh di xa (trừ giai đoạn MS) MS Bệnh di trẻ 18 tháng tuổi, vị trí di da, gan và/hoặc tủy xƣơng Tuy nhiên, với INRGSS, giai đoạn MS phải xem xét đến yếu tố tuổi chẩn đoán (từ 12 đến 18 tháng) khối u tiên phát lớn cắt bỏ đƣợc Bên cạnh đó, nghiên cứu số lƣợng lớn bệnh nhân cho thấy việc sử dụng 18 tháng làm mốc chia nhóm tuổi chẩn đoán có nhiều ý nghĩa với lâm sàng so với việc sử dụng 12 tháng tuổi nhƣ trƣớc đó.Hiện nay, việc sử dụng hệ thống phân giai đoạn INSS hay INRGSS tùy thuộc vào sở vật chất bác sĩ INSS đƣợc lựa chọn nơi có sở vật chất hay bác sĩ chẩn đoán hình ảnh có nhiều hạn chế Do đó, việc xác định giai đoạn dựa vào phẫu thuật điều trị dựa theo phân loại Còn nơi có sở vật chất tay nghề bác sĩ tốt hơn, nhà lâm sàng lại sử dụng hệ thống INRGSS Vì đó, nhiều bệnh nhân không cần có can thiệp y tế mà khỏi bệnh, đặc biệt khối u khu trú trẻ tuổi 1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng u NBTK 1.2.4.1 Sự khuếch đại gen MYCN Nhiều biến đổi di truyền đƣợc xác định u NBTK có ý nghĩa tiên lƣợng bệnh, dựa xác định đƣợc bệnh nhân có nguy tái phát có xu hƣớng tiến triển nặng Trong việc xác định khuếch đại gen MYCN có giá trị tiên lƣợng cao đƣợc sử dụng để phân nhóm nguy [11] 10 Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 Sự khuếch đại MYCN thƣờng xảy u nguyên bào thần kinh tiên phát bệnh nhân chƣa đƣợc điều trị Sự khuếch đại thƣờng gặp giai đoạn muộn bệnh với kết điều trị thấ p, nhƣng có thể đƣợc tìm thấy u tiến triển nhanh có tiên lƣợng xấu, hoă ̣c th ậm chí trẻ sơ sinh hay bệnh nhân giai đoạn khu trú Tỷ lệ khuếch đại MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh 20 – Phân nhóm nguy u NBTK 2004 Giai đoạn 1-3 Giai đoạn 4S Không khuếch đại gen MYCN Khuếch đại gen MYCN Tuổi  Tuổi < Giai đoạn Giai đoạn Khuếch đại gen Không khuếch đại 4S MYCN gen MYCN Không đoạn 1p Giai đoạn Tuổi < Nguy trung bình Mất đoạn 1p Giai đoạn Tuổi 2 Nguy cao Nguy thấp Nguy trung bình 25% [6, 11, 20] Hình 1.2 Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy [34] Nhóm bệnh nhân nguy cao: - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 1,2,3 4S có khuếch đại gen MYCN - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn đoạn tuổi chẩn đoán ≥12 tháng - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuối chẩn đoán ≤ 12 tháng, có khuếch đại gen MYCN Nhóm bệnh nhân nguy trung bình: - Bệnh nhân u NBTK khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 3,có đoạn 1p 11 Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 - Bệnh nhân u NBTK khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 3, không đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≥24 tháng - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuổi chẩn đoán ≤ 12 tháng, khuếch đại gen MYCN Nhóm bệnh nhân nguy thấp: - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4S khuếch đại gen MYCN - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 2, khuếch đại gen MYCN, không đoạn 1p - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 3, khuếch đại gen MYCN, không đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≤24 tháng 1.2.4.2 Tuổi bệnh nhân u NBTK Ngay từ thời điểm đầu nghiên cứu chẩn đoán u nguyên bào thần kinh (1950), nhà lâm sàng nhận thấy liên hệ tuổi chẩn đoán bệnh nhân với tiên lƣợng điều trị Các bệnh nhân sơ sinh có đáp ứng điều trị tốt so với bệnh nhân nhi lớn tuổi[16] Đến năm 1971, Breslow McCann chứng minh tuổi chẩn đoán vừa yếu tố tiên lƣợng quan trọng, vừa yếu tố tham gia vào việc xác định giai đoạn cho bệnh nhân [9] Năm 2009, báo cáo tổ chức Ung thƣ Trẻ em (Children’s Oncology Group - COG) Susan Cohn cộng công bố, điểm cắt nhóm tuổi chẩn đoán có tiên lƣợng khác đƣợc thông qua với đồng thuận quốc tế 18 tháng Tuy nhiên với bệnh nhân giai đoạn M khuếch đại gen MYCN, việc đánh giá tiên lƣợng tuổi áp dụng điểm cắt tuổi 12 tháng [14] Có nhóm nguy đƣợc xác định tỷ lệ sống sót vòng năm dựa độ tuổi, giai đoạn trạng thái gen MYCN nhƣ sau:  Các bệnh nhân giai đoạn 1, 2, hay 4S tất độ tuổi mà khuếch đại MYCN tỷ lệ 95% [23]  Các bệnh nhân giai đoạn nhƣ bệnh nhân sơ sinh giai đoạn 4, khuếch đại MYCN tỷ lệ khoảng 75% [10]  Các bệnh nhân lớn tuổi giai đoạn 4, giai đoạn hay mà có 12 Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 khuếch đại MYCN nhƣ bệnh nhân sơ sinh di căn, có khuếch đại MYCN tỷ lệ 30% [16] U NBTK trẻ lớn (> 13 tuổi) ngƣời lớn có số đặc điểm cận lâm sàng, lâm sàng, tiến triển tiên lƣợng bệnh khác với u NBTK trẻ em [15] 1.2.4.3 Yếu tố mô bệnh học Chỉ số MKI MKI (mitotic – karyorrhectic index) tỷ lệ số lƣợng tế bào kỳ nguyên phân kỳ phân hủy nhân Hình ảnh nguyên phân đặc trƣng khối đặc chất nhiễm sắc hình tròn, có mấu nhọn màng nhân Tế bào phân hủy có hình ảnh khối đặc đoạn kèm theo bào tƣơng đặc bắt kiềm Chỉ số MKI đƣợc chia thành loại (Bảng 1.3): Bảng 1.3 Chỉ số MKI Tỷ lệ phần trăm Số lƣợng tế bào MKI thấp 4% >200/5000 tế bào Chỉ số MKI cao thƣờng gặp u NBTK chƣa biệt hóa có khuếch đại gen MYCN[31] Tiên lƣợng mô bệnh học Hiệp hội Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế phân biệt thành nhóm tiên lƣợng mô bệnh học: mô bệnh học thuận lợi mô bệnh học không thuận lợi (Bảng 1.4) Việc phân chia bệnh nhân vào nhóm tiên lƣợng dựa vào tuổi chẩn đoán, trạng thái biệt hóa khối u số đặc điểm khác nhƣ số nhân chia/nhân tan (MKI), nốt canxi hóa Từ yếu tố tiên lƣợng kết hợp với tuổi chẩn đoán bệnh nhân, hai nhóm mô bệnh học đƣợc phân chia 13 Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 Bảng 1.4 Bảng phân loại mô bệnh học Mô bệnh học MKI Tuổi chẩn đoán Nhóm mô bệnh học thuận lợi U NBTK biệt hóa MKI trung bình Ít 1,5 tuổi U NBTK biệt hóa MKI thấp Ít 1,5 tuổi U NBTK biệt hóa MKI trung bình Ít 1,5 tuổi U NBTK biệt hóa MKI thấp Ít tuổi U hạch NBTK thể hỗn hợp Không áp dụng Mọi độ tuổi U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi U hạch thần kinh Không áp dụng Mọi độ tuổi Nhóm mô bệnh học không thuận lợi U NBTK không biệt hóa Mọi MKI Mọi độ tuổi U NBTK biệt hóa Mọi MKI Mọi độ tuổi U NBTK biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi U NBTK biệt hóa MKI thấp Trên 1,5 tuổi U NBTK biệt hóa MKI cao Mọi độ tuổi U NBTK biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi U NBTK biệt hóa Không áp dụng Trên tuổi U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi Nhiều nghiên cứu xác định yếu tố MBH có giá trị tiên lƣợng quan trọng, nhóm u có MBH thuận lợi có kết điều trị tốt có ý nghĩa thống kê so với nhóm MBH không thuận lợi Yếu tố MBH đƣợc sử dụng nhiều phác đồ để phân nhóm nguy [21, 31, 32] 1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh 1.3.1 Khuếch đại gen MYCN Gen MYCN gen tiền ung thƣ, nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể số vị trí 2p24.3 Gen có kích thƣớc 2602 bp gồm có exon, mã hóa cho protein MYCN gồm 464 axit amin[19] 14 Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 Là gen trội điển hình, biểu MYCNcó thể thấy tế bào xô-ma, thƣờng có kết hợp với yếu tố gây ung thƣ khác Sự biểu mức genMYCN biến đổi tế bào nguyên bào sợi từ giai đoạn bào thai sang giai đoạn lão hóa Đồng thời, có mặt với số lƣợng lớn protein MYCN dòng tế bào nguyên bào thần kinh có làm chậm phát triển giảm trình biệt hóa [25] Mặc dù khuếch đại genMYCN đƣợc khẳng định bệnh u nguyên bào thần kinh với tiên lƣợng xấu, protein MYCN có vai trò khuếch đại khối u hay không gây nhiều tranh cãi Một số dòng tế bào u nguyên bào thần kinh có biểu mức độ cao với protein MYCN mà khuếch đại gen.Điều thay đổi chu trình suy thoái protein trình tự điều hòa dịch mã gene MYCN Ở giai đoạn đầu, biểu protein MYCN đƣợc tìm thấy tất giai đoạn bệnh Điều đƣợc cho biểu MYCN không liên quan đến kiểu hình lâm sàng Tuy nhiên, nhóm khối u khuếch đại genMYCN, số nghiên cứu cho thấy biểu protein MYCN có liên quan tới khả sống sót; đó, số nghiên cứu khác lại không thấy liên quan Trong tƣơng lai, với nghiên cứu lớn việc điều trị bệnh nhân với phƣơng pháp tiêu chuẩn cần thiết để tìm hiểu mức độ biểu protein MYCN có liên quan đến tiên lƣợng tiến triển khổi u thiếu khuếch đại genMYCN[25] Các nghiên cứu u nguyên bào thần kinh cho thấy tế bào u nguyên bào thần kinh có mảnh nhỏ chất nhiễm sắc kép (double-minute chromatin bodies (DM)) nhƣ vùng bắt màu đồng (homogeneously staining regions (HSR)) nhiễm sắc thể lớn Về sau, bất thƣờng nhiễm sắc thể đƣợc khẳng định biểu mặt di truyền tế bào khuếch đại, gen MYCN Tuy nhiên, khuếch đại MYCN thƣờng đƣợc tìm thấy vị trí này: vùng HSR nhiễm sắc thể khác, DM nhiễm sắc thể, hai 15 Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 Hình 1.3 Cơ chế khuếch đại gen[27] Cơ chế khuếch đại MYCN đến chƣa đƣợc hiểu hết Theo nghiên cứu Matsui A cộng (2013), DSB (Double - stranded break) xuất vùng đứt gẫy telomere nhiễm sắc thể Để thay thế, sợi chromatid bị vùng telomere đƣợc tái tạo Hai đầu bị vùng telomere đƣợc ghép nối tạo thành dạng nhiễm sắc thể có hai tâm (dicentric chromosome) Tại thời điểm phân bào, hai tâm đƣợc kéo hai đầu tâm động thoi vô sắc tạo thành cầu nối chromatid Sự phân chia bất thƣờng nhiễm sắc thể gây vị trí đứt gẫy ngẫu nhiên cầu nối chromatid, tạo vùng kết thúc nhƣng thiếu đoạn telomere Cuối giai đoạn phân bào tạo tế bào có dạng nhiễm sắc thể hai tâm tế bào có đoạn nhiễm sắc thể thiếu vùng telomere Các chu kỳ đƣợc lặp 16 Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 lại khuếch đại với trình tự lặp đảo ngƣợc (HSR) - (A) khuếch đại tăng sinh nhiễm sắc thể (DMs) - (B) (Hình 1.3)[27] Trong trình nhân lên tế bào, gen MYCN nằm NST số đƣợc nhân lên theo chu trình tế bào Tuy nhiên, có rối loạn trình đó, gen MYCN đƣợc khuếch đại lên nhiều NST khác tạo nên HSRhoặc gen đoạn lặp nhỏ gen MYCN tách trực tiếp khỏi NST hình thành vòng lặp (DM) Các DM đƣợc tích lũy lại nhờ trình phân chia không phân bào, số trƣờng hợp khác, DM tập hợp thành locus nhiễm sắc thể để tạo nên HSR[12, 16, 24, 37] Vùng khuếch đại NST số có kích thƣớc thay đổi từ 350-2000kb nhƣng có khuếch đại bảo thủ dài 130kb Theo Westermann F (2008)trong công bố giả thiết khuếch đại gen MYCN tính chất sinh học xuất từ đầu nhóm U NBTK ác tính cao khối u khuếch đại gen thời điểm chẩn đoán có đặc điểm sinh học Khuếch đại gen MYCN đƣợc chấp nhận rộng rãi có liên quan đến tiên lƣợng bệnh phần lớn phác đồ điều trị cần có kết trạng thái gen MYCN trƣớc bắt đầu điều trị cho bệnh nhân [38] 1.3.2 Các bất thường nhiễm sắc thể 1.3.2.1 Bất thường số lượng nhiễm sắc thể Phần lớn khối u có nhiễm sắc đồ thể lƣỡng bội Các khối u giai đoạn sớm bệnh thƣờng thể đa bội hay gần tam bội Nhiễm sắc đồ tế bào u có giá trị tiên lƣợng, nhƣng phân tích nhiễm sắc thể khó khăn Trạng thái bội thể có ý nghiã tiên lƣơ ̣ng vào vi ệc dự báo kết điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh dƣới tuổ i nhƣng không có ý nghĩa tiên lƣ ợng bệnh nhân lớn Điều bệnh nhân dƣới tuổ i thể đa bội hay gần tam bội có thêm nhiễm sắc thể mà biến đổi cấu trúc, với bệnh nhân lớn hơn, biến đổi kèm với thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể [36] 17 Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 1.3.2.2 Các biến đổi liên quan đến cấu trúc nhiễm sắc thể  Mất đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số (1p) Mất đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số đƣợc tìm thấy khoảng 35% số ca u nguyên bào thần kinh Các đoạn nhiễm sắc thể số đƣợc tìm thấy nhiều bệnh nhân u nguyên bào thần kinh giai đoạn muô ̣n , đoạn dị hợp tử 1p hay kèm với khuếch đại MYCN Ý nghĩa tiên lƣợng độc lập đoạn dị hợp tử 1p đƣợc tranh luận nhƣng chứng đoạn dị hợp tử vị trí 1p36 kèm với kết điều trị thấ p là yế u t ố tiên lƣợng xấ u ở các b ệnh nhân nguy thấp trung bình [4]  Thêm đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 17 (17q) Biến đổi di truyền hay gặp bệnh nhân u NBTK thêm đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 17 (17q) (khoảng 50% số ca) Bên cạnh phần định số ca thêm đoạn 17q kết thêm đoạn không cân xảy độc lập, phần nhiều trƣờng hợp chuyển đoạn không cân 17q nhiễm sắc thể khác Vị trí chuyển đoạn với 17q hay gặp 1p, sau 11q [36]  Các biến đổi khác Ngoài biến đổi di truyền nói trên, gần bệnh nhân u nguyên bào thần kinh, ngƣời ta đánh giá thêm đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 11 (11q23.3) 14 (14q23-32) Mất đoạn 11q xảy 43% u nguyên bào thần kinh mô ̣t các m ất đoạn phổ biến loại ung thƣ (tỷ lệ đoạn 14q 23%) [13] Mất đoạn 11q 14q thƣờng xảy và ngƣợc với khuếch đại MYCN đoạn 1p 18 Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 1.4 Mô hình di truyền u NBTK Dựa tất biến đổi di truyền nói trên, mô hình di truyền phát triển u nguyên bào thần kinh đƣợc đề xuất nhƣHình 1.4 Hình 1.4 Mô hình di truyền phát triển u nguyên bào thần kinh [10] Theo đó, từ tế bào ban đầu, phụ thuộc vào dạng đột biến xảy ra, u nguyên bào thần kinh theo hai nhánh lớn: Nhánh thứ đƣợc xác định hoạt động giảm phân không bình thƣờng, dẫn đến thể đa bội hay gần tam bội (3N) với tăng số lƣợng nhiễm sắc thể, có thay đổi cấu trúc Các khối u thiên hƣớng biệt hóa tiếp hay chết theo chƣơng trình (apoptosist), tùy thuộc vào có mặt hay không nhân tố phát triển thần kinh môi trƣờng nội bào Các bệnh nhân thuộc nhánh thƣờng dƣới tuổi, khối u khu trú giai đoạn 1, 4S có tiên lƣợng tốt (tỷ lệ sống năm 95%) Nhánh thứ hai thƣờng lƣỡng bội (2N) hay tứ bội (4N), nhƣng đƣợc xác định chủ yếu nhờ bất thƣờng nhiễm sắc thể lớn, nhiều thêm đoạn 17q Tại có hai nhóm nhỏ đƣợc xác định phân biệt Một nhóm có đoạn 11q và/hoặc có đoạn 14q Các bệnh nhân nhóm thƣờng lớn tuổi, 19 Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 khối u giai đoạn với tiến triển chậm, hay tử vong (tỷ lệ sống năm 40 – 50%) Nhóm lại với xuất đoạn dị hợp tử 1p khuếch đại MYCN Đây nhóm có tính chất ác tính nhất, có tiến triển bệnh nhanh Các bệnh nhân thuộc nhóm thƣờng từ – tuổi, giai đoạn hầu hết tử vong (tỷ lệ sống năm 25%) Về di truyền u nguyên bào thần kinh gia đình, thời điểm chƣa có chứng cụ thể di truyền bệnh qua hệ Các nhà nghiên cứu nhận thấy độ tuổi chẩn đoán đứa trẻ có u NBTK di truyền tháng, độ tuổi quần thể 18 tháng Và 20% u nguyên bào thần kinh di truyền có khối u tiên phát hai bên thận nhiều vị trí khác Đã có nhiều bất thƣờng di truyền (nhƣ đoạn 1p) đƣợc nghiên cứu, song chƣa có bất thƣờng có tính đặc hiệu làm tăng tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đƣợc tìm ra[42] 1.5 Tính cấp thiết đề tài Trƣớc đây, việc phân loại bệnh nhân lựa chọn pháp đồ điều trị tiên lƣợng bệnh gặp nhiều khó khăn dựa vào số sinh hóa kết giải phẫu bệnh có độ xác không cao[4].Gần có vài nghiên cứu nhỏ lẻ Thạc sĩ Vũ Đình Quang cộng kết đánh giá khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh[2] Vì tiến hành nghiên cứu để đánh giá cách có hệ thống kết khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bệnh viện Nhi TW Từ kết hỗ trợ bác sĩ lâm sàng việc phân loại lựa chọn pháp đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân Nội dung nghiên cứu luận văn: - Phát đƣợc khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ - Xác định đƣợc liên quan ý nghĩa khuếch đại gen MYCNvới yếu tố tiên lƣợng khác 20 Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phùng Tuyết Lan (2007), Nghiên cứu số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng điều trị u nguyên bào thần kinh trẻ em, Luận án tiến sĩ, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Vũ Đình Quang, Nguyễn Xuân Huy, Nguyễn Thị Phƣơng Mai, Phùng Tuyết Lan, Trần Đức Hậu, Trần Ngọc Sơn, Hoàng Ngọc Thạch, Bùi Khắc Hiếu, Ngô Diễm Ngọc Nguyễn Thanh Liêm (2013), "Đánh giá khuếch đại gen NMYC bệnh nhân u nguyên bào thần kinh", Tạp chí Nhi khoa 6(1), 67-72 Vũ Đình Quang, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phùng Tuyết Lan, Trần Ngọc Sơn, Lê Đình Công, Hoàng Ngọc Thạch, Trần Thị Chi Mai, Nguyễn Xuân Huy, Ngô Diễm Ngọc Nguyễn Thanh Liêm (2015), "Nghiên cứu mối quan hệ trạng thái gen MYCN với số yếu tố tiên lƣợng khác 41 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh", Tạp chi Khoa học: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 31(4S), 288-293 Tiếng Anh 10 11 Attiyeh E F., London W B., Mosse Y P., Wang Q., Winter C., Khazi D., McGrady P W., Seeger R C., Look A T., Shimada H., Brodeur G M., Cohn S L., Matthay K K and Maris J M (2005), "Chromosome 1p and 11q deletions and outcome in neuroblastoma", N Engl J Med 353(21), 2243-53 Bauchinger S., Lackner H., Schwinger W., Sovinz P., Benesch M., Sorantin E., Till H and Urban C (2014), "Primary renal neuroblastoma metastasizing into liver and lungs with tumor thrombus extension into the right atrium", Klin Padiatr 226(6-7), 369-71 Beierle E A., Trujillo A., Nagaram A., Kurenova E V., Finch R., Ma X., Vella J., Cance W G and Golubovskaya V M (2007), "N-MYC regulates focal adhesion kinase expression in human neuroblastoma", J Biol Chem 282(17), 12503-16 Bordbar M., Tasbihi M., Kamfiroozi R and Haghpanah S (2014), "Epidemiological and clinical characteristics of neuroblastoma in southern iran", Iran J Ped Hematol Oncol 4(3), 89-96 Bown N (2001), "Neuroblastoma tumour genetics: clinical and biological aspects", J Clin Pathol 54(12), 897-910 Breslow N and McCann B (1971), "Statistical estimation of prognosis for children with neuroblastoma", Cancer Res 31(12), 2098-103 Brodeur G M (2003), "Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma", Nat Rev Cancer 3(3), 203-16 Canete A., Gerrard M., Rubie H., Castel V., Di Cataldo A., Munzer C., Ladenstein R., Brichard B., Bermudez J D., Couturier J., de Bernardi B., Pearson A J and Michon J (2009), "Poor survival for infants with MYCNamplified metastatic neuroblastoma despite intensified treatment: the 41 Footer Page 26 of 126 Header Page 27 of 126 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 International Society of Paediatric Oncology European Neuroblastoma Experience", J Clin Oncol 27(7), 1014-9 Caren H., Erichsen J., Olsson L., Enerback C., Sjoberg R M., Abrahamsson J., Kogner P and Martinsson T (2008), "High-resolution array copy number analyses for detection of deletion, gain, amplification and copy-neutral LOH in primary neuroblastoma tumors: four cases of homozygous deletions of the CDKN2A gene", BMC Genomics 9(353 Caren H., Kryh H., Nethander M., Sjoberg R M., Trager C., Nilsson S., Abrahamsson J., Kogner P and Martinsson T (2010), "High-risk neuroblastoma tumors with 11q-deletion display a poor prognostic, chromosome instability phenotype with later onset", Proc Natl Acad Sci U S A 107(9), 4323-8 Cohn S L., Pearson A D., London W B., Monclair T., Ambros P F., Brodeur G M., Faldum A., Hero B., Iehara T., Machin D., Mosseri V., Simon T., Garaventa A., Castel V and Matthay K K (2009), "The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report", J Clin Oncol 27(2), 289-97 Esiashvili N., Goodman M., Ward K., Marcus R B., Jr and Johnstone P A (2007), "Neuroblastoma in adults: Incidence and survival analysis based on SEER data", Pediatr Blood Cancer 49(1), 41-6 Evans A E and D'Angio G J (2005), "Age at diagnosis and prognosis in children with neuroblastoma", J Clin Oncol 23(27), 6443-4 Farber S., D'Angio G., Evans A and Mitus A (1960), "Clinical studies on actinomycin D with special reference to Wilms' tumor in children", Ann N Y Acad Sci 89(421-5 George R E., Variend S., Cullinane C., Cotterill S J., McGuckin A G., Ellershaw C., Lunec J and Pearson A D (2001), "Relationship between histopathological features, MYCN amplification, and prognosis: a UKCCSG study United Kingdom Children Cancer Study Group", Med Pediatr Oncol 36(1), 169-76 George R E., Attiyeh E F., Li S., Moreau L A., Neuberg D., Li C., Fox E A., Meyerson M., Diller L., Fortina P., Look A T and Maris J M (2007), "Genome-wide analysis of neuroblastomas using high-density single nucleotide polymorphism arrays", PLoS One 2(2), e255 Gostissa M., Ranganath S., Bianco J M and Alt F W (2009), "Chromosomal location targets different MYC family gene members for oncogenic translocations", Proc Natl Acad Sci U S A 106(7), 2265-70 Goto S., Umehara S., Gerbing R B., Stram D O., Brodeur G M., Seeger R C., Lukens J N., Matthay K K and Shimada H (2001), "Histopathology (International Neuroblastoma Pathology Classification) and MYCN status in patients with peripheral neuroblastic tumors: a report from the Children's Cancer Group", Cancer 92(10), 2699-708 Hallett R M., Seong A B., Kaplan D R and Irwin M S (2016), "Transcript signatures that predict outcome and identify targetable pathways in MYCNamplified neuroblastoma", Mol Oncol 10(9), 1461-1472 42 Footer Page 27 of 126 Header Page 28 of 126 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Hansford L M., Thomas W D., Keating J M., Burkhart C A., Peaston A E., Norris M D., Haber M., Armati P J., Weiss W A and Marshall G M (2004), "Mechanisms of embryonal tumor initiation: distinct roles for MycN expression and MYCN amplification", Proc Natl Acad Sci U S A 101(34), 12664-9 Horvilleur E., Bauer M., Goldschneider D., Mergui X., de la Motte A., Benard J., Douc-Rasy S and Cappellen D (2008), "p73alpha isoforms drive opposite transcriptional and post-transcriptional regulation of MYCN expression in neuroblastoma cells", Nucleic Acids Res 36(13), 4222-32 Maris J M and Matthay K K (1999), "Molecular biology of neuroblastoma", J Clin Oncol 17(7), 2264-79 Maris J M (2010), "Recent advances in neuroblastoma", N Engl J Med 362(23), 2202-11 Matsui A., Ihara T., Suda H., Mikami H and Semba K (2013), "Gene amplification: mechanisms and involvement in cancer", Biomol Concepts 4(6), 567-82 McCarville M B (2011), "Imaging neuroblastoma: what the radiologist needs to know", Cancer Imaging 11 Spec No A(S44-7 Morandi F., Croce M., Cangemi G., Barco S., Rigo V., Carlini B., Amoroso L., Pistoia V., Ferrini S and Corrias M V (2015), "IL-10 and ARG-1 concentrations in bone marrow and peripheral blood of metastatic neuroblastoma patients not associate with clinical outcome", J Immunol Res 2015(718975 Morgenstern D A., London W B., Stephens D., Volchenboum S L., Simon T., Nakagawara A., Shimada H., Schleiermacher G., Matthay K K., Cohn S L., Pearson A D and Irwin M S (2016), "Prognostic significance of pattern and burden of metastatic disease in patients with stage neuroblastoma: A study from the International Neuroblastoma Risk Group database", Eur J Cancer 65(1-10 Rothenberg A B., Berdon W E., D'Angio G J., Yamashiro D J and Cowles R A (2009), "Neuroblastoma-remembering the three physicians who described it a century ago: James Homer Wright, William Pepper, and Robert Hutchison", Pediatr Radiol 39(2), 155-60 Sano H., Bonadio J., Gerbing R B., London W B., Matthay K K., Lukens J N and Shimada H (2006), "International neuroblastoma pathology classification adds independent prognostic information beyond the prognostic contribution of age", Eur J Cancer 42(8), 1113-9 Schmidt M L., Lal A., Seeger R C., Maris J M., Shimada H., O'Leary M., Gerbing R B and Matthay K K (2005), "Favorable prognosis for patients 12 to 18 months of age with stage nonamplified MYCN neuroblastoma: a Children's Cancer Group Study", J Clin Oncol 23(27), 6474-80 Thurman W G., Fernbach D J and Sullivan M P (1964), "Cyclophosphamide therapy in childhood neuroblastoma", N Engl J Med 270(1336-40 Umehara S., Nakagawa A., Matthay K K., Lukens J N., Seeger R C., Stram D O., Gerbing R B and Shimada H (2000), "Histopathology defines prognostic subsets of ganglioneuroblastoma, nodular", Cancer 89(5), 1150-61 43 Footer Page 28 of 126 Header Page 29 of 126 36 37 38 39 40 41 42 43 Vandepoele K., Andries V., Van Roy N., Staes K., Vandesompele J., Laureys G., De Smet E., Berx G., Speleman F and van Roy F (2008), "A constitutional translocation t(1;17)(p36.2;q11.2) in a neuroblastoma patient disrupts the human NBPF1 and ACCN1 genes", PLoS One 3(5), e2207 Westermann F., Muth D., Benner A., Bauer T., Henrich K O., Oberthuer A., Brors B., Beissbarth T., Vandesompele J., Pattyn F., Hero B., Konig R., Fischer M and Schwab M (2008), "Distinct transcriptional MYCN/c-MYC activities are associated with spontaneous regression or malignant progression in neuroblastomas", Genome Biol 9(10), R150 Yoshimoto M., Caminada De Toledo S R., Monteiro Caran E M., de Seixas M T., de Martino Lee M L., de Campos Vieira Abib S., Vianna S M., Schettini S T and Anderson Duffles Andrade J (1999), "MYCN gene amplification Identification of cell populations containing double minutes and homogeneously staining regions in neuroblastoma tumors", Am J Pathol 155(5), 1439-43 Zenitani M., Uehara S., Miyashita E., Hashii Y., Oue T and Okuyama H (2016), "Primary renal neuroblastoma with metastasis and matrix metalloproteinase-14 expression", Pediatr Int 58(2), 161-4 Balmain A., Gray J and Ponder B (2003), "The genetics and genomics of cancer", Nature genetics Supplement 33(238-44 Brodeur G M., Pritchard J , Berthold F., Carlsen N L., Castel V., Castelberry R P., De Bernardi B., Evans A E., Favrot M and Hedborg F (1993), "Revisions of the international criteria for neuroblastoma diagnosis, staging, and response to treatment", Journal Clinical Oncology 11(8), 1466-1477 Schell M and Bergeron C (2003), "Neuroblastoma", Orphanet Encyclopedia Society American Cancer (2015), "Neuroblastoma", Annual report, United States of America 44 Footer Page 29 of 126 ... 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN XUÂN HUY XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG. .. truyền cho bệnh u nguyên bào thần kinh đƣợc đặt Xuất phát từ y u c u lâm sàng thực tiễn nhƣ vậy, nghiên c u đề tài Xác định khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh kĩ thuật lai huỳnh. .. c u luận văn: - Phát đƣợc khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ - Xác định đƣợc liên quan ý nghĩa khuếch đại gen MYCNvới y u tố tiên lƣợng khác 20 Footer