Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG UNG THỊ NHƯ TRUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ CHUYỂN HOÁ MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA AXIT ASIATIC TỪ CÂY RAU MÁ [Centella asiatica (L.) Urban] Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - 2012 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH TRẦN VĂN SUNG Phản biện : PGS.TS LÊ THỊ LIÊN THANH Phản biện : PGS.TS LÊ TỰ HẢI Luận văn ñã ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 14 tháng 11 năm 2012 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại Học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày giới ñại, công nghiệp phát triển kéo theo nhiều vấn ñề môi trường, sinh thái sức khoẻ người Mô hình bệnh tật ngày phức tạp Gần ñây giới phải ñối mặt với dịch bệnh nguy hiểm có khả lan rộng thành ñại dịch quy mô toàn cầu Có thể lấy số ví dụ ñiển HIV/AIDS, ung thư, viêm ñường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, tim mạch v.v Thực tế ñó ñã thúc ñẩy luôn phải tìm thuốc chữa bệnh mới, có hiệu cao hơn, tác dụng chọn lọc giá thành rẻ Một ñường hữu hiệu ñể phát chất có hoạt tính tiềm năng, phát triển thành thuốc chữa bệnh cho người, gia súc trồng ñi từ hợp chất thiên nhiên Các hợp chất thiên nhiên ñã trải qua hàng triệu năm tiến hóa, tương ñối phù hợp với thể sống, ñộc thân thiện với môi trường Người ta sử dụng hợp chất thiên nhiên cách trực tiếp ñể làm thuốc, sử dụng làm mô hình ñể nghiên cứu tổng hợp thuốc Cây rau má thuốc ñược sử dụng rộng rãi y học cổ truyền nước khu vực ñông Á như: Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Sri lanka, Việt Nam…, ñó ñã thu hút ñược nhiều ý nhà hóa học Các nghiên cứu thử nghiệm ống nghiệm dịch chiết rau má CHCl3 etanol 95%, ñã cho thấy dịch chiết ñều có hoạt tính sinh học ñáng ý như: hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính chống u có tác dụng bảo vệ gan Nguồn rau má mọc tự nhiên Việt Nam dồi Tuy vậy, ñược khai thác sử dụng chỗ, chưa trở thành mặt hàng thương mại hóa [1] Thành phần hóa học rau má gồm hợp chất triterpen triterpen glucosid axitasiatic, asiaticosid, axitmadecassic, madecassoid, irahmosid, brahminosid Ngoài Footer Page of 126 Header Page of 126 rau má chứa tinh dầu với mùi thơm ñặc trưng, hợp chất polyacetylen, flavonoid, vitaminC, ancaloid oligosacharid [1, 17] Từ lí luận văn ñặt nhiệm vụ “nghiên cứu chiết tách chuyển hoá số dẫn xuất axit asiatic từ rau má [Centella asiatica (L.) urban] “ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Chiết tách tinh chế axit asiatic từ rau má Việt Nam - Chuyển hoá số dẫn xuất - Thăm dò hoạt tính sinh học + Hoạt tính gây ñộc tế bào + Thăm dò hoạt tính sinh học ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Tách, tinh chế axit asiatic từ dịch chiết EtOH rau má - Tổng hợp dẫn xuất axit asiatic - Thử hoạt tính sinh học dẫn xuất thu ñược PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1 Chiết tách axit asiatic rau má - Chiết tách tinh chế axit asiatic - Định lượng axit asiatic 4.2 Phương pháp tổng hợp hữu Các phản ứng ñược thực phương pháp tổng hợp hữu cơ phương pháp khử, phương pháp oxi hóa, phương pháp ankyl hóa, phương pháp axyl hóa, phương pháp thế, 4.3 Phương pháp sắc ký mỏng theo dõi trình phản ứng Phương pháp sắc ký lớp mỏng ñược sử dụng ñể giám sát tiến trình xảy phản ứng hóa học phân tích chất lượng sản phẩm phản ứng Footer Page of 126 Header Page of 126 4.4 Phương pháp phân lập tinh chế Các hợp chất sau phản ứng ñược phân lập tinh chế phương pháp chiết, phương pháp sắc ký cột silicagel, phương pháp kết tinh, 4.5 Phương pháp xác ñịnh cấu trúc hóa học hợp chất hữu Các chất tinh khiết sau ñược phân lập tinh chế ñược xác ñịnh số lý hóa ñặc trưng như: màu sắc, nhiệt ñộ nóng chảy Sau ñó tiến hành ghi phổ như: - Phổ hồng ngoại (FT-IR) ñối với chất rắn ñược ño dạng viên nén KBr, ñối với chất lỏng ñược ño dạng màng mỏng (film) - Phổ khối (ESI-MS) ñược ghi dung môi CHCl3 CH3OH - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chiều chiều sử dụng chất nội chuẩn TMS (δ = ppm), dung môi CDCl3 DMSO-d6 ñược ghi tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR tần số 125 MHz cho phổ 13C-NMR Cấu trúc hợp chất ñược xác ñịnh kết hợp phương pháp phổ so sánh tài liệu 4.6 Phương pháp sinh học Thăm dò hoạt tính sinh học chất tổng hợp ñược phòng thử hoạt tính Viện Hoá học Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Từ kết nghiên cứu, luận văn ñã thu ñược số kết với ñóng góp thiết thực sau: - Đã xác ñịnh ñược ñiều kiện tối ưu ñể thực qui trình chiết, tách axit asiatic axit madecassic từ rau má - Từ dịch chiết EtOH rau má ñã phân lập ñược chất - Đã tổng hợp ñược dẫn xuất axit asiatic ñó dẫn 41 (RMDV25mE) chất - Cấu trúc chất ñã ñược xác ñịnh việc kết hợp Footer Page of 126 Header Page of 126 phương pháp phổ ñại phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phân giải (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H -NMR, 13C-NMR,DEPT phổ NMR hai chiều (H-H-COSY, HSQC HMBC) - Kết cho thấy hầu hết chất ñều có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) Lu (ung thư phổi) Các chất 40, 42 43 có hoạt tính mạnh axit asiatic ban ñầu BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN Nội dung luận văn chia làm chương Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nguyên liệu hoá chất phương pháp nghiên cứu Chương 3: Thực nghiệm Chương 4: Kết nghiên cứu thảo luận CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY RAU MÁ VIỆT NAM Cây rau má có tên khoa học Centella asiatica (Linn) Urban Thuộc họ hoa tán (Apiaceae), tên thường gọi rau má, có tên khác Tích huyết thảo, Cây thảo mọc bò, phân nhánh nhiều mặt ñất Rễ mọc từ mấu thân Lá có cuống dài mọc từ gốc từ mấu Lá tròn, có mép khía tai bèo, trông giống ñồng tiền tròn ñược xếp nối tiếp nên gọi Liên tiền Cụm hoa hình tán ñơn mọc nách gồm 1-5 hoa nhỏ, cuống màu trắng phớt ñỏ Quả dẹt, có sống rõ Là thứ rau dại ăn ñược thường mọc nơi ẩm ướt thung lủng, bờ mương thuộc vùng nhiệt ñới Việt nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấnñộ, Pakistan, Madagascar [1] Footer Page of 126 Header Page of 126 Dân gian thường dùng rau má trị cảm mạo, phong nhiệt, thuỷ ñậu, sởi, sốt da vàng mặt, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm ñường tiết niệu, ñái dắt ñái buốt, dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hư, bạch ñới, giải ñộc ngón nhân ngôn Dùng trị rắn cắn, mụn nhọt, lở ngứa vết thương chảy máu Ở Trung Quốc, rau má ñược dùng trị cảm mạo, phong nhiệt, viêm phần ñường hô hấp, viêm gan, lỵ, cúm, ăn phải vật có ñộc, viêm màng phổi, rắn cắn, gai ñâm vào thịt, trúng ñộc nấm dại, ngộ ñộc sắn, trúng ñộc thuốc nông dược, ngộ ñộc thức ăn ñòn ngã tổn thương Từ năm 1940, y học ñại bắt ñầu nghiên cứu tác dụng rau má Rau má có hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn ñược gọi tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid asiatic acid Hoạt chất asiaticoside ñã ñược ứng dụng ñiều trị bệnh phong bệnh lao Người ta cho bệnh này, vi khuẩn ñược bao phủ màng giống sáp khiến cho hệ kháng nhiễm thể tiếp cận Chất asiaticoside dịch chiết rau má làm tan lớp màng bao nầy ñể hệ thống miễn dịch thể tiêu diệt chúng Tuy nhiên, nước ta công trình nghiên cứu tập trung vào mặt thực vật học Trong số loại rau má rau má có tên khoa hoc: Centella asiatica (Linn) Urban, ñược sử dụng rộng rã thuốc ñông y, ñặc biệt nhiều nhà khoa học giới ñã nhiều năm nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chúng 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC 1.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU Axit asiatic ñược phân lập từ rau má ñược thu hái Sơn Tây, Hà Nội vào tháng 10 năm 2011 2.2 DUNG MÔI VÀ HOÁ CHẤT NGHIÊN CỨU Các dung môi ñược sử dụng ñể chiết tách tinh chế là: Ethanol, methanol, n-hexan, etyl axetat, chloroform Các tác nhân hóa chất tinh khiết dùng cho trình tổng hợp dẫn xuất phân tích ñược mua từ hãng Sigma-aldrich, Merck Trung Quốc 2.3 CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC TRONG CÂY RAU MÁ Nguyên liệu rau má tươi ñược sấy khô, xay nhỏ chiết với dung môi phương pháp khác Cặn chiết ñược loại tinh dầu chất béo n-hexan Cặn ñược thủy phân dung dịch NaOH, trung hòa với HCl sau ñó ñược kiểm tra sắc ký mỏng, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) ñể xác ñịnh hàm lượng axit asiatic tritecpen khác 2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN HOÁ HOÁ HỌC Các phản ứng hóa học ñược thực theo phương pháp thông dụng phòng thí nghiệm tổng hợp hữu Các phản ứng chất nhạy cảm với ẩm không khí ñược tiến hành môi trường có khí trơ Các dung môi phản ứng ñược làm khan thiết bị chuyên dụng 2.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA CÁC CHẤT Việc xác ñịnh cấu trúc hóa học chất ñược thực thông qua việc kết hợp phương pháp phổ ñại phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (MS), sắc kí lỏng cao áp gắn với khối phổ (LC/MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều (1D 2D NMR) H, DEPT, COSY, HSQC HMBC Trong trường hợp cần thiết ñiều Footer Page of 126 Header Page of 126 chế dẫn xuất acetyl chất chứa nhóm hydroxyl ñể khẳng ñịnh thêm cấu trúc chúng 2.6 PHƯƠNG PHÁP THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.6.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh 2.6.2.Phương pháp thử ñộ ñộc tế bào CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt ñộ chiết tới hàm lượng axit asiatic axit madecassic 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng ñộ dung môi chiết tới hàm lượng axit asiatic 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian tới trình chiết Kết luận Bằng phương pháp phân tích với mẫu thí nghiệm khảo sát, ñã xác ñịnh ñược ñiều kiện tối ưu ñể thực qui trình chiết, tách axit asiatic axit madecassic từ rau má Các ñiều kiện ñó sau: + Nồng ñộ dung môi chiết etanol (80%) + Thời gian chiết cho lần (chiết lần) + Nhiệt ñộ chiết 80OC Từ kết khảo sát này, áp dụng ñể nghiên cứu qui trình chiết, qui mô phòng thí nghiệm 3.2 QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 3.2.1 Quy trình chiết tách (theo sơ ñồ 1) kg rau má tươi ñược sấy 450C, thu ñược 900 gam khô, xay nhỏ ngâm chiết lần với 3,6 lít EtOH nhiệt ñộ 800C giờ, lọc Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 qua phễu lọc thu ñược 2,5 lít dịch chiết Bã ñược chiết thêm lần với EtOH (2,5 lít) Thời gian rút dịch chiết tiếng/lần Gộp dịch lại, quay cất dung môi áp suất giảm, nhiệt ñộ 500C, thu ñược 165 gam cặn EtOH Cặn chiết thu ñược ñược chế thêm nước cất Sau ñó chiết với n-hexan chloroform Các dịch chiết ñược cất loại dung môi cho ñến khô thu ñược 20 gam cặn n-hexan, 25 gam cặn chloroform 120 gam cặn dịch nước Các chất phân lập từ dịch chiết EtOH rau má Tên chất Axit asiatic (RM1) Cấu trúc Hiệu suất (so với mẫu khô) 0,37% Axit Madecassic (RM2) Stigmasterol glucoside + β-sitosterol 0,43% 0,096% glucoside (RM3) 3.3 TỎNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT ASIATIC Sau chiết tách tinh chế ñược axit asiatic có ñộ > 98%, tiến hành tổng hợp dẫn xuất axit asiatic theo sơ ñồ Footer Page 10 of 126 Header Page 12 of 126 10 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 CÁC THÔNG SỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt ñộ chiết tới hàm lượng axit asiatic axit madecassic Chiết mẫu EtOH 80% ba nhiệt ñộ khác 60, 70 800C Kết ñược ñưa bảng 4.1 Kết cho thấy chiết 800C cho hiệu tốt với hàm lượng axit asiatic axit madecassic 0,52% 0,77% tương ứng Bảng 4.1: Ảnh hưởng nhiệt ñộ chiêt ñến hàm lượng axit asiatic axit madecassic Lượng Nhiệt ñộ Nồng ñộ Axit asiatic Axit mẫu (0C) EtOH (%) (g) madecassic (g) 80 60 80 0,297 (0,37%) 0,448 (0,56%) 80 70 80 0,298 (0,37%) 0,449 (0,56%) 80 80 80 0,412 (0,52%) 0,618 (0,77%) 4.1.2 Ảnh hưởng nồng ñộ dung môi chiết tới hàm lượng axit asiatic Nghiên cứu chiết mẫu rau má với ba nồng ñộ cồn 70, 80 90% nhiệt ñộ 800C Kết qủa ñược ñưa Bảng 4.2 Bảng 4.2: Ảnh hưởng nồng ñộ dung môi chiết ñến hàm lượng axit asiatic axit madecassic Lượng mẫu (g) Nồng ñộ EtOH (%) Axit asiatic mẫu (g) Axit madecassic (g) 80 70 0,310 (0,39%) 0,465 (0,58%) 80 80 0,412 (0,52%) 0,618 (0,77%) 80 90 0,262 (0,32%) 0,390 (0,48%) Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 11 Từ kết bảng 4.2: trình chiết với etanol (80%) nhiệt ñộ 800C cho hiệu suất chiết axit asiatic axit madecassic cao Khi chiết với etanol nồng ñộ 70% thu ñược lượng cặn nhiều (13,95gam) so với việc sử dụng etanol 80% (13,21gam) Tuy nhiên, lượng axit asiatic axit madecassic thu ñược lại Điều ñược lý giải tăng hàm lượng nước, trình chiết hợp chất ñường, muối vô , tan vào nhiều hơn, ñó làm tăng lượng cặn gây khó khăn việc tinh chế, không thu ñược triệt ñể lượng axit asiatic axit madecassic có cặn chiết 4.1.3 Ảnh hưởng thời gian tới trình chiết Sau chọn ñược nồng ñộ dung môi chiết tốt 80%, khảo sát thời gian (1, giờ) Chọn nhiệt ñộ 800C Lọc dịch chiết, cất loại quay cất chân không áp suất giảm thu ñược cặn tương ứng (Bảng 4.3 ) Bảng 4.3: Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô Lượng mẫu (g) Thời gian chiết (giờ) Tổng cặn chiết (g) 80 10,36 80 13,21 80 13,24 Từ kết bảng 4.3: thời gian cho lần chiết có hiệu suất chiết tốt so với chiết lần chiết thứ ba ít, ñó chọn thời gian chiết cho lần chiết chiết lần 4.2 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urban.) 4.2.1 Chất (9) (RM1): Axit asiatic Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 12 - Chất (RM1): 3,4 gam, 0,37% tính theo trọng lượng mẫu rau má thô, ñược phân lập từ cặn chiết EtOH dạng tinh thể màu trắng (CHCl3/MeOH), ñiểm nóng chảy 324-3260C Phổ hồng ngoại: cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng nhóm hydroxyl (3411,96 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930,19 2866,43 cm-1) Phổ 1H-NMR cho thấy có nhóm metyl ñó có nhóm metyl gắn với cacbon bậc với tín hiệu singlet tại: 0,717, 0,871; 0,992; 1,067; 1,158 hai nhóm metyl gắn với CH với tín hiệu doublet δH = 0,919 (J = 6,5 Hz) δH = 0,929 (J = 6,5Hz) Ngoài ra, phổ có tín hiệu nhóm CH2 gắn với OH δH = 3,297 (d, J = 11,0 Hz, H-23a); δH = 3,535 (d, J = 11,0 Hz, H23b), nhóm hydroxy gắn với CH δ = 3,387 (J = 9.5 Hz; H-3) 3,718 (m, H-2) tín hiệu nối ñôi δ = 5,260 (br.s, H-12) Phổ 13C-NMR DEPT chất có mặt 30 cacbon ñó có nhóm metyl; nhóm cacbon bậc 2; nhóm cacbon bậc nhóm cacbon bậc 4, nhóm carboxylic với δ = 181,6 ppm tín hiệu nối ñôi C-12 = C-13; δ = 139,8, 126,6 ppm Phổ H-H-COSY cho thấy có tương tác hai proton δH: 3,297 (d, J = 11Hz); 3,535 (d; J = 11Hz) gắn trực tiếp với carbon vị trí C-23, proton δ = 3,387 (J = 9.5 Hz; H-3) tương tác với proton δ = 3,718 (m, H-2) Phổ HSQC cho thấy rõ H-2 (3,72 ppm) C-2 (69,7 ppm), C-3 (72,2 ppm) H-3 (3,38 ppm), tương tác C-12 (126,6 ppm) H-12 (5,26 ppm) Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả phân tử m/z = 487.4 [M-H]+ Kết hợp với phổ 1H- phổ 13C NMR dự ñoán chất có công thức phân tử C30H48O5 So sánh số liệu phổ MS, 1H- 13C-NMR chất với số liệu axit asiatic tài liệu [24, 25], thấy hoàn toàn trùng khớp Do kết luận chất axit asiatic, thành phần triterpenoid rau má Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 13 Hình 4.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR chất 4.2.2 Chất (10) (RM2): Axit madecassic - Phổ hồng ngoại chất (10) cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng nhóm hydroxyl (3416,16 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930,19 2867,91 cm-1) Phổ 1H-NMR cho thấy có metyl singlet, hai metyl doublet 0,92 1,10 ppm Ngoài phổ có tín hiệu nhóm hydroxymetin (CHOH) δH: 3,31 (d, J = 9,5 Hz, H-3); 4,4 (m, H-6); tín hiệu δH = 5,31 ppm ñặc trưng cho nhóm metin olephinic (= CH) tín hiệu doublet ñặc trưng cho nhóm CH2 gắn với OH δH: 3,46 3,61ppm - Sự có mặt nhóm ñược củng cố tín hiệu phổ 13 C-NMR δC: 69,6 ppm (C-2), 78,2 (C-3), 68,4 (C-6), 126,9 139,0 ppm (C1-2 C-13) Phổ 1H 13C- NMR chất 10 gợi ý chất 10 Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 14 có khung cacbon với chất Phổ khối cho pic ion phân tử m/z = 505,35 [M+1]+ , kết hợp với phổ 1H- 13C - NMR suy chất 10 phù hợp với công thức phân tử C30H48O6 - Các số liệu phổ MS, 1H- 13C-NMR chất 10 hoàn toàn phù hợp với số liệu axit madecassic tài liệu [7] Bảng 4.4 Do ñó chất 10 axit madecassic, triterpen có rau má Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR chất 10 4.2.3 Chất 39: RM3 (Hỗn hợp stigmasterol glucoside + β sitosterol glucoside) So sánh kiện phổ ESI-MS, phổ 1H, 13CNMR DEPT với tài liệu hỗn hợp stigmasterol glucoside + β-sitosterol glucoside [26], cho phép xác ñịnh ñây hỗn hợp stigmasterol glucoside + β - sitosterol glucoside Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 15 Bảng 4.4: Số liệu phổ H- 13C-NMR chất 10 TT Chất (RM1) δC δH (Hz) 48,0 69,7 3,71(1H,m) 69,4 3,64(1H, m) 78,2 3,38 (d, J = 9,5Hz) 78,2 3,30 (d, J = 9,6Hz) 44,1 43,8 3,6 (1H, d, 78,5 J = 11,0Hz) 44,7 44,5 48,2 48,2 48,5 19,1 33,6 40,7 18,5 32,9 40,2 68,4 4,4 (1H, m) 67,7 4,8 (1H,m) 41,2 41,1 39,7 39,7 10 48,5 38,9 47,9 38,3 48,7 38,1 48,8 38,1 11 24,5 23,8 24,2 24,0 12 126,6 5,26 (1H, br.s) 125,9 13 139,8 139,2 126,9 5,3 (1H, m) 126,5 5,5(dd, J=3,4; 3,7Hz) 139,0 138,4 14 43,4 42,8 43,8 43,2 15 29,1 28,6 28,8 28,8 16 25,3 24,8 24,5 24,8 17 48,7 48,4 48,6 48,6 18 54,3 53,7 54,3 53,4 19 40,4 39,8 40,4 39,5 20 21 40,4 31,6 39,7 30,9 40,4 31,6 39,6 30,9 22 38,1 37,4 38,5 37,4 23 66,3 24 13,9 14,2 15,3 66,2 3,29(d,J=11,0 Hz) 3,54(d,J=11,0 Hz) 15,9 25 17,6 17,4 19,2 19,4 26 17,7 17,4 19,1 19,3 27 28 29 24,1 181,5 17,8 23,8 180,8 17,3 23,9 181,6 17,6 23,8 180,8 17,3 30 21,5 21,3 21,5 21,2 3,29 (d, J =11,0Hz) 3,53(d, J=11,0Hz) Footer Page 17 of 126 Axit asiatic [ 24, 25 ] δC δH (Hz) 47,8 66,4 5,16 (1H, br.s) 3,23 (d, J= 11,2Hz) 3,30 (d, J=11,2Hz) Chất 10 (RM2) δC δH (Hz) 50,3 Axit madecassic [ ] δC δH ( Hz) 50,5 69,6 3,7 (1H, m) 69,1 78,2 65,9 4,2 (1H, m) 3,4 (d, J = 10,4Hz) 48,7 3,30 (d, J = 11,0Hz) 3,54 (d, J=11,0Hz) Header Page 18 of 126 16 4.3 TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT AMIT CỦA AXIT ASIATIC Sau chiết tách tinh chế ñược axit asiatic có ñộ > 98%, tiến hành tổng hợp dẫn xuất axit asiatic theo sơ ñồ 4.3.1 Chất: 3, 23-O-isopropyliden asiatic acid (40) Phổ 1H-NMR (Hình 4.2, 4.3 4.4) cho thấy có nhóm metyl ñó có nhóm metyl gắn với cacbon bậc với tín hiệu singlet δH = 0,694 (3H, s, CH3); 0,806 (3H, s, CH3); 1,004 (3H, s, CH3); 1,033 (3H, s, CH3) xuất nhóm acetyl với tín hiệu singlet δH = 1,915 (3H, s, OCOCH3); 1,958 (3H, s, OCOCH3); 2,020 (3H, s, OCOCH3) Phổ 13 C-NMR phổ DEPT-90, DEPT-135 chất (40) (Hình 4-10, Hình 4-11) có mặt 33 carbon ñó có nhóm CH3 cacbon bậc (CH3); nhóm cacbon bậc (CH2); nhóm cacbon bậc (CH) nhóm cacbon bậc Đặc biệt phổ 13C-NMR có tín hiệu cacbon bậc δ = 100,7 ppm Từ số liệu phổ hồng ngoại, phổ khối, 1H -NMR 13C-NMR chất (40) hoàn toàn phù hợp với liệu phổ tài liệu [ 23] (xem bảng 4.4) Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 17 Hình 4.7 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR chất 40 Hình 4.11 Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất 40 Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 4.3.2 Chất: 18 2-[(3-carboxypropanoyl)oxy] 3,23-O-isopropyliden asiatic acid (41) 41 Khi cho chất (40) phản ứng với succinic anhydrit CH2Cl2 trietylamin, thu ñược hợp chất este (41) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (Hình 4.12 4.13) xuất hai tín hiệu δ (ppm) : 2,57- 2,71 (4H, m, x CH2) mạch nhánh ñược gắn vào tín hiệu H-2 dịch chuyển từ trường cao δH = 3,6 ppm phía trường thấp δH = 5,03 ppm Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất 41 cho tín hiệu 37 nguyên tử cacbon, ñó có 11 nguyên tử cacbon bậc 2, 10 cacbon bậc 4, nguyên tử cacbon bậc cacbon bậc (xem hình 4.14 4.15) Đặc biệt phổ 13C-NMR xuất thêm tín hiệu nhóm CH2: δ/ppm = 23,7 ( C-2’); 23,1 (C-3’) , nhóm este δ/ppm = 171,8 (C-1’) nhóm cacboxylic δ/ppm = 178,0 (C-4’) xem (Hình 4.14 4.15) Kết hợp phổ hồng ngoại, phổ 13C-NMR phổ DEPT nhóm hydroxy vị trí C-2 tham gia phản ứng este với succinic anhydric ñể tạo thành chất 41, phù hợp với cấu trúc Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 19 Hình 4.12 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR chất 41 4.3.4 Chất: 2-O-acetyl-3,23-O-isopropylidene asiatic acid (42) COOH AcO O O 42 Chất 42 ñược tổng hợp qua phản ứng acetyl hóa chất 40 với anhydric axetic dung môi pyridin Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR tín hiệu nhóm CH3 chất 40, xuất hai tín hiệu singlet δ = 1,42 1,47 ppm nhóm (CH3)2CO2 xetan tín hiệu singlet nhóm axetylen δ = 2,0 ppm ( Hình 4.16 , 4.17 4.18) Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 Phổ 13 20 C-NMR phổ DEPT chất 42 cho tín hiệu 35 nguyên tử cacbon, ñó có 10 nguyên tử cacbon bậc 2, cacbon bậc 4, nguyên tử cacbon bậc cacbon bậc (xem hình 4.19 4.20) Đặc biệt phổ 13 C-NMR xuất thêm tín hiệu nhóm CH3: δ/ppm = 21,2 (COCH3); 23,1 nhóm este δ/ppm = 173,1 ppm (OCOCH3); xem (Hình 4.19 4.20) Kết hợp phổ hồng ngoại, phổ 13C-NMR phổ DEPT nhóm hydroxy vị trí C-2 tham gia phản ứng este với anhydric acetic ñể tạo thành chất 42 Như nhóm hydroxy vị trí C-3 ñã ñược acetyl hoá tạo thành chất 42 Hình 4.16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR chất 42 Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 21 4.3.3 Chất: 2-acetyl-asiatic acid (43) AcO COOH HO HO Chất 43 nhận ñược thủy phân chất 42 HCl (1%) vòng xetan, hiệu suất phản ứng ñạt 82% Sản phẩm nhận ñược ñã ñược khảng ñịnh phương pháp phổ Phổ 1H-NMR (Hình 4.21, 4.22 4.23) cho thấy có nhóm metyl ñó có nhóm metyl gắn với cacbon bậc với tín hiệu singlet δ (ppm): 0,76 (3H, s, CH3); 0,87 (3H, s, CH3); 0,99 (3H, s, CH3); 1,11 (3H, s, CH3) xuất nhóm acetyl với tín hiệu singlet δH = 2,06 (3H, s, OCOCH3) Phổ 13C-NMR phổ DEPT-90, DEPT-135 chất (43) (Hình 4-24 4-25) có 32 cacbon ñó có nhóm CH3 cacbon bậc (CH3); nhóm cacbon bậc (CH2); nhóm cacbon bậc (CH) nhóm cacbon bậc 4, tín hiệu vòng xetal không còn, ñã ñược thủy phân Từ số liệu phổ hồng ngoại, phổ khối, 1H -NMR 13C-NMR chất (43) hoàn toàn phù hợp với cấu trúc chất (43) Hình 4.21 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR chất 43 Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 22 Hình 4.25 Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất 43 4.4 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.4.1 Thử hoạt tính gây ñộc tế bào Bảng 4.5: Kết thử hoạt tính gây ñộc tế bào STT Tên chất Ký hiệu mẫu RM1(axit asiatic ) RM-12DMSBV 40 RMDV25mE 41 RM2AcV 42 RM2Ac 43 Chất tham khảo (Ellipticine) KB 30,22 17,88 59,42 11,66 17,23 IC50 (µg/ml) HepG2 32,0 57,62 128 16,19 21,04 0,62 - 1,25 Lu 75,19 78,99 19,41 19,41 Trong ñó: RM (dịch chiết EtOH) Kết Bảng 4.5, cho thấy hầu hết chất ñều có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) Lu (ung thư phổi) Các chất 40, 42 43 có hoạt tính mạnh axit asiatic ban ñầu Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 23 4.4.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Bảng 4.6 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Nồng ñộ ức chế 50% phát triểncủa vi sinh vật nấm kiểm ñịnh IC50 (µg/ml) Chất Gram (+) Gram (-) Nấm Staphylo coccus aureus Bacillus subtilis Lactobacillus Fermentum Salmonella enterica Escheri chia coli Pseudomo nas aeruginosa Candida albicans 54,37 17,18 2,197 >128 >128 >128 >128 40 2,33 12,00 >128 >128 >128 >128 >128 41 0,28 20,31 >128 >128 >128 >128 >128 42 1,41 20,7 >128 >128 >128 >128 >128 43 1,92 86,55 >128 >128 >128 >128 >128 Bảng 4.6 cho thấy chất 40, 41, 42 43 có hoạt tính kháng vi khuẩn gram (+) S.aureus mức ñộ mạnh axit asiatic RM1 với nồng ñộ ức chế 50% cá thể (IC50= 0,28-2,33 µg/ml) ñối với khuẩn S Aureus Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 24 KẾT LUẬN Đã chiết tách ñược hợp chất axit asiatic từ rau má (Centella asitica (Lim)) Urban, thu hái Sơn Tây Hà Nội với hàm lượng 0,37% (tính theo trọng lượng khô) với ñộ tinh khiết ≥ 98% Đã khảo sát ảnh hưởng nhiệt ñộ, nồng ñộ dung môi, thời gian ñến trình chiết tách axit asiatic triterpen khác Đã tổng hợp ñược dẫn xuất axit asiatic ñó dẫn 41 (RMDV25mE) chất Các sản phẩm thu ñược ñã ñược xác ñịnh cấu trúc hóa học việc kết hợp phương phương pháp phổ ñại như: Phổ hồng ngoại (FTIR); phổ khối (ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR DEPT Đã thử hoạt tính gây ñộc tế báo ung thư axit asiatic dẫn xuất tổng hợp ñược dòng tế bào BK (tế bào ung thư biểu mô), Hep-G2 (tế bào ung thư gan) Lu (tế bào ung thư phổi) hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Kết cho thấy tất chất ñều có hoạt tính mạnh ức chế hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm BK Hep-G2 Đặc biệt dẫn xuất 40, 42 43 có hoạt tính mạnh ức chế phát triển dòng tế bào ung thư BK (IC50= 11,66 – 17,88 µg/ml) Hep-G2 (IC50= 16,19 – 21,04 µg/ml) Các chất 40, 41, 42 chât 43 có hoạt tính kháng vi khuẩn gram (+) Staphylococcus aureus mức ñộ mạnh với nồng ñộ ức chế 50% cá thể ((IC50= 0,28 – 2,33 µg/ml) CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ Trần Văn Lộc, Trần Văn Sung, Đào Đức Thiện, Nguyễn Minh Thư, Phạm Đức Thắng, Huỳnh Thị Thanh Tâm Ung Thị Như Truyền (2011) Tổng hợp số dẫn xuất axit Asiatic phân lập từ rau má [Centella asiatica (L.) Urban.] Việt Nam, Hội nghị khoa học viện Hóa học Tuyển tập báo cáo toàn văn, Tr 39-44 Footer Page 26 of 126 ... chuyển hoá số dẫn xuất axit asiatic từ rau má [Centella asiatica (L.) urban] “ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Chiết tách tinh chế axit asiatic từ rau má Việt Nam - Chuyển hoá số dẫn xuất - Thăm dò hoạt tính... TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Tách, tinh chế axit asiatic từ dịch chiết EtOH rau má - Tổng hợp dẫn xuất axit asiatic - Thử hoạt tính sinh học dẫn xuất thu ñược PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1 Chiết tách. .. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT AMIT CỦA AXIT ASIATIC Sau chiết tách tinh chế ñược axit asiatic có ñộ > 98%, tiến hành tổng hợp dẫn xuất axit asiatic theo sơ ñồ 4.3.1 Chất: 3, 23-O-isopropyliden asiatic acid