ENZIM CẮT GIỚI HẠN (Restriction enzim) Có thể khẳng định : Khi nói tới công nghệ sinh học (đặc biệt sinh học phân tử ) người ta không nói tới công nghệ enzim Bởi lẽ, enzim công nghệ enzim xác lập thúc đẩy ngành công nghệ sinh học phát triển lên bước tiến Có nhiều loại en zim đựợc dùng sinh học phân tử Tính riêng hệ thống enzim sửa đổi axit nucleotit (nucleotid modifying enzymes) phát enzim giới hạn có vai trò quan trọng, đặc biệt công nghệ ADN tái tổ hợp, chuyển ghép gen Vậy enzim giới hạn ? I/ Enzym giới hạn (Restriction enzym) I.1 Hiện tượng giới hạn Từ năm 1950 , S.Luris,đã phát thấy phage hệ sinh từ thí nghiệm gây nhiễm phage T vào nòi E.Coli B/4 không khả sinh sản nòi vật chủ E.Coli bình thường cho phage sinh từ E.Coli B/4 bị sửa đổi theo cách nói đó, làm cho phage khả sinh trưởng vật chủ bình thường: enzim giới hạn Trong tượng chức quan trọng enzym giới hạn bảo vệ chất di truyền vi khuẩn không bị “ xâm lấn” ADN lạ, nói cách khác có chế bảo vệ virút để trì ADN riêng vi khuẩn Vào năm 1962, V.arber lần chứng minh đựợc có loại enzim đặc biệt có khả phân biệt ADN tế bào chủ ADN ngọai lai ( ADN phage) Các enzim có khả hạn chế khả sinh sản phage tế bào vi khuẩn cách phân huỷ chúng cách đặc hiệu người ta gọi restriction enzim I.2 Enzym giới hạn (Restriction enzym) Người phát enzym giới hạn H.Smith D.Nathaus (1970) hai ông tách restriction endonuclease từ vi khuẩn Haemophilus influenzase gọi Hind II Ngay sau ông chứng minh phần lớn vi khuẩn có hệ thống enzim chuyên biệt dùng để hạn chế - biến đổi (restriction -modification system) , bảo vệ tế bào khỏi xâm nhập ADN lạ Với công trình nghiên cứu ông cộng nhận giải thưởng Nobel năm 1978 I.3 Những qui định chung danh pháp phân loại RE a/ Danh pháp Tên đầy đủ restriction endonuclease kèm theo tên hệ thống người ta thường gọi theo tên hệ thống , bỏ tiền ngữ Tên hệ thống thường biểu thị 3-4 chữ viết tắt tên vi khủn mà người ta tách enzim Các chữ viết hoa để giống chữ viết để loài , cần thiết viết thêm chữ thứ để nòi hay chủng Ví dụ EcoB : Là en zim cắt giới hạn tách từ vi khuẩn E.coli nòi B Ngoài để nhận biết enzim khác nòi nguời tacòn dùng thêm chữ số la mã kem theo tên hệ thống Ví dụ : Hind II , Hind III enzim giơí hạn có đoạn đích khác chiết từ vi khuẩn Haemophilus influenzase nòi d b/ Phân loại Đến nay, người ta tách chiết hàng trăm loại enzym giới hạn khác dựa vào đặc tính loại RE mà chia chúng làm loại ĐẶC TÍNH Điểm cắt Khả metyl hoá gốc Adenin Điều kiện để cắt Cấu trúc enzim (Số chuỗi LOẠI I LOẠI II LOẠI III Cách xa điểm nhận Nằm điểm biết (trên 1000bp) nhận biết Nằm điểm nhận biết (gần loại I) có Không có ATP,Mg++, S-AdoMet Mg++hoặc Mn++ Mg++, S-AdoMet chuỗi khác chuỗi giống chuỗi khác polypeptít) c/ Chức Chức nói chung enzym giới hạn thuỷ phân ADN, cắt sợi dài ADN vị trí (site) đặc thù, thành đoạn ngắn (sequence), điều nhận biết xác enzim đặc thù Mỗi loại endonuclease giới hạn có khả nhận biết cắt phân tử ADN vị trí đặc hiệu gọi vị trí giới hạn (restriction site) Tất vị trí giới hạn nhiễm sắc thể vi khuẩn chủ bảo vệ với thân nuclease giới hạn cuả chúng để ngăn tượng tự biến tính Điều thực metyl hoá nhiều nucleotit mỗi đoạn nucleotit nhận biết nuclease giới hạn thân vi khuẩn Sự methyl hoá xảy nhanh chóng sau vi khuẩn tái xúc tác methylase đặc hiệu mã hoá nhiễm sắc thể vi khuẩn chủ Mỗi enzym giới hạn cắt phân tử ADN lạ từ loài khác, thành số đoạn, nhiều hay phụ thuộc vào số site giới hạn phân tử ADN Độ dài, kích thước đoạn xác định qua diện di gen agaose polyacrilamid Enzym giới hạn mang trình tự nucleotit định, sử dụng làm dầu dính Khi dầu dính đoạn ADN có trình tự nucleotit bổ sung cho theo nguyên lý bổ sung Chargaff, đoạn có khả đối lại với nhờ mối liên kết hydro xúc tác cuả enzym nối ligase Các mối thực từ ADN tái tổ hợp (ADN lai) phục hồi toàn vẹn phương diện vật lý phân tử, trở thành ổn định, bền vững qua xử lý tiếp ligase Trong nhóm enzim giới hạn nhóm thứ II dùng nhiều sinh học phân tử Đó enzim nhận biết ADN mạch kép trình tự nhận biết cắt ADN vị trí đặc hiệu đoạn nhận biết ( Ngay điểm nhận biết hay kế cận ) Các điểm nhận biết thường có trình tự 4-6bp đối xứng đảo ngược gọilà palindrom Trong cấu trúc phân tử câu tạo chuỗi polypéptit đồng chúng có giá trị kỹ thuật phân tích mức phân tử ADN chúng có điểm cắt đặc trưng lại mngay đoạn nhận biết không cần lượng bổ sung để tiến hành phản ứng , chúng chức metyl hoá Điểmcắt điểm nhận biết RE thuộc nhóm có thứ tự gốc nucleotit đối xứng ví dụ điểm nhận biết điểm cắt số loại RE thuộc nhóm bày sau : + EcoRI 5' - G A A T T C 3' 3' -C T T A A G 5' 5' - G A A T T C 3' 3' -C T T A A G 5' + PstI 5' C T G C A G 3' 5' C T G C A 3' -G.A C G T C 5' 3' -G G 3' A C G T C 5' Các enzim thuộc nhóm cắt ADN mạch kép tạo đầu lệch cố kết hay "dính " baze bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại với lúc chưa bị cắt dời Nếu có đoạn ADN lạ khác có bị cắt enzim hạn chế dễ dàng đính xen vào sơ đồ sau: G-A A T T C G A A T T C -G-A A T T C-X T T A A G X T T A A G- X T T A A G G AAT T C C T T AA G A A T T C -GG- - C T T A A G A A T T C G - A A T T C -C T T A A G - C- T T A A G Đoạn ADN xen Đầu dính Đầu đính CÁC LOẠI RE VÀ ĐIỂM CẮT HAY DÙNG THUỘC NHÓM II STT TÊN ENZIM VI KHUẨN ĐIỂM CẮT ( ) BamHI Bacillus amyloliquefaciens H G ATCC BglII Bacillus globiggi A GATCT EcoRI E.coli RY13 G AATTC EcoRII E.coli R245 CC GG HaeIII Haemophilus aegyptius GG.CC HgaI Haemophilus gallinarum GACGCNNNNN Hba I Haemophilus baemolyticus GCG.C HindII Haemophilus infuenzae Rd GTPy.PuAC HindIII Haemophilus infuenzae Rd A.AGCTT 10 HinfI Haemophilus infuenzae Rf GANTC 11 HpaI Haemophilus parain fuenzae GTT.AAC 12 HpaII Haemophilus parain fuenzae C CGG 13 MspI Moracella species C.CGG 14 NotI Nocardia rubra GC GGCCGC 15 PleI Pseudomonas lemoignei GAGTCNNNN Nhóm thứ cấu tạo chuỗipolypeptit khác : + Một chuỗi thực chức nhận biết , + Một chuỗi thực chức cắt + Một chuỗi thực chức metyl hoá Các enzim thuộc nhóm thứ quan tâm Chúng cấu tạo chuỗi polypeptit khác chuỗi polypeptit thực chức cắt chuỗi lại vừa thực chức nhận biết metyl hoá Trong hoạt động cắt chúng cho điểm cắt không đặc trưng Ngày đãcó tới 500 loại RE phát chúng có khả cắt ADN với tổngcộng hơn120 trình tự nhận biết khác I.4/ Các kiểu cắt RE Có hai kiểu cắt RE 1/Cắt thẳng điểm qua trung tâm đối xứng luân phiên Cắt điểm ( liên kết trục đối xứng) 3' C-A-A T-T-G -5' 5' G-T-T -A-A-C 3' Ví dụ Re: E.CoRI cắt ADN SV40 điểm ( site) Site qui ước vị trí số ADN SV40 2/ Cắt nhiều điểm đoạn ADN Các enzim giới hạn Hpal HindIII cắt ADN SV40 site Khi SV40 tác động enzym trên, có 11 đoạn giới hạn tạo Cắt nhiều điểm 3' -T-T-C -G-A-A 5' 5' A-A-G -C-T-T -3' đầu tận sợi đơn đựơc cắt 3' -T-T-C -G-A' 5' A-G -C-T-T -3' đầu tận sợi đơn đựơc cắt tạo đoạn ADN cần II/ Vai trò RE công nghệ gen 1/ Tạo ADN tái tổ hợp 2/ Dùng enzim cắt giới hạn để phân tích tổ chức ADN + Nghiên cứu hệ gen + Lập đồ số hệ gen Như đồ ɸX174, SV40 3/ Dùng en zim cắt chuẩn đoán y học , phát bệnh di truyền + Một số đột biến di truyền ảnh hưởng đến điểm dành cho enzim cắt giới hạn + Phân biệt kiểu gen bình thường ( kiểu dại ) với kiêu đột biến cách : *Cắt mẫu ADN hệ gen enzim giới hạn thích hợp * Phân tích đoạn ADN gen điện di ( qua độ dài khác đoạn ) * Chuyển đoạn lên màng lọc * Cho lai với mãu đánh dấu (probe) thích hợp ( dùng ARN ) , đánh dấu phóng xạ ( thường 32p) * ảnh phóng xạ tự ghi cho thấy vị trí dòng ADN bổ trợ với mẫu ARN * Các dòng nàyđược tách để nghiên cứu *Chọc ối lấy tế bào phôi , phân tích chuẩn đoán , phát khác biệt mẫu xử lý enzim giới hạn 4/ Dùng tính chất đặc hiệu enzim giới hạn để tìm hiểu mối quan hệ di truyền , nguồn gốc quần thể TÀI LIỆU THAM KHẢO 1/ Phan Cự Nhân - Nguyễn Minh Công - Đặng Hữu Lanh Di truyền học tập II - Nhà xuất Giáo dục 1999 (Từ trang 264 đến 271) 2/ Lê Bình - Lê Thị Muội Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng - Nhà xuất nông nghiệp - Hà nội 1997 ( Từ trang 38 đến trang 46) 3/ Lê Duy Thành - Tạ Toàn - Đỗ Lê Thăng - Trần Văn Diễn Di truyền học - Nhà xuất nông nghiệp 1995 (Từ trang 317-322 ) 4/ Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Sinh học phân tử - Nhà xuất giáo dục 1998 (Từ trang 135 -140 ) / Phạm Thành Hổ Di truyền học - Nhà xuất giáo dục1999 (Từ trang379 đến 381) ... phân tử, trở thành ổn định, bền vững qua xử lý tiếp ligase Trong nhóm enzim giới hạn nhóm thứ II dùng nhiều sinh học phân tử Đó enzim nhận biết ADN mạch kép trình tự nhận biết cắt ADN vị trí đặc... Diễn Di truyền học - Nhà xuất nông nghiệp 1995 (Từ trang 317-322 ) 4/ Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Sinh học phân tử - Nhà xuất giáo dục 1998 (Từ trang 135 -140 ) / Phạm Thành Hổ Di truyền học - Nhà xuất... Các dòng nàyđược tách để nghiên cứu *Chọc ối lấy tế bào phôi , phân tích chuẩn đoán , phát khác biệt mẫu xử lý enzim giới hạn 4/ Dùng tính chất đặc hiệu enzim giới hạn để tìm hiểu mối quan