CHUYÊN ĐỀ HỘI THẢO CÁC TRƯỜNG CHUYÊN VÙNG ĐỒNG BẰNG VÀ DUYÊN HẢI BẮC BỘ MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………….……………… NỘI DUNG BÁO CÁO……………………………….……………………………………………2 Các công cụ dùng kĩ thuật ADN tái tổ hợp…………………………….….2 1.1 Các enzym chủ yếu … …………………………….………………………………………2 1.1.1 Enzym giới hạn ……………………………….…………………………………………2 1.1.2 Enzym polymerase ……………………………….……………………………………3 1.1.3 Enzym nối (ligase) ……………………………….………………………………………4 1.1.4 Nuclease……………………………….……………………………………………….….5 1.2 Các vector thông dụng……………………………….……………………………………5 Tạo dòng gen hay ADN tái tổ hợp……………………………….…………………… …10 2.1 Nguyên tắc chung…………………………………………………………………………10 2.2 Quy trình tạo dòng gen tái tổ hợp…………………………………… ………………11 2.3 Tổng hợp tạo dòng cADN……………………………………………………………14 Ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp……………………………………………….15 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP…………………………………………………………………….……16 MỞ ĐẦU Công nghệ ADN tái tổ hợp đời dựa sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trò cách mạng phát triển công nghệ sinh học Kỹ thuật ADN tái tổ hợp cho phép nhà công nghệ sinh học phân lập khuếch đại gen đơn từ genome sinh vật để tạo dòng gen, sản xuất gen, đồng thời nghiên cứu, biến đổi chuyển vào thể sinh vật khác Sự đời đặt móng cho việc sửa chữa, trao đổi, cải tạo, tạo vật chất di truyền cấp độ phân tử từ có nhiều ứng dụng thực tiễn như: tuyển chọn dần tạo thêm nhiều giống trồng, vật nuôi có suất, chất lượng cao, sức chống chịu tốt; chuẩn đoán, phòng ngừa hay cứu chữa bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền bệnh tiểu đường, khối u, ung thư, lùn bẩm sinh, thiếu máu; bệnh nhiễm sắc thể thường nhiễm sắc thể giới tính; viêm gan B, viêm não Nhật Bản, bại liệt, sốt rét, …; tạo ngày nhiều chủng, loài vi sinh vật định vi sinh vật tạo protein, enzim có hoạt tính cao hay sản phẩm khác mà trước không làm được… Vì khả ứng dụng cao, tính đại, cập nhật mà năm gần đây, kiến thức ADN tái tổ hợp ngày sử dụng cách thường xuyên đề thi học sinh giỏi Quốc gia Olimpic Quốc tế phần thi lí thuyết thực hành Trong nội dung báo cáo này, nội dung lí thuyết muốn gửi tới bạn đồng nghiệp số câu hỏi, tập ADN tái tổ hợp bao gồm câu hỏi đề thi Olimpic Quốc tế năm gần NỘI DUNG BÁO CÁO ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) phân tử ADN tạo ống nghiệm cách kết hợp ADN từ nguồn (loài) khác nhau, theo quy trình kỹ thuật định, gọi kỹ thuật tái tổ hợp ADN Thông thường phân tử ADN tái tổ hợp bao gồm phân tử ADN có chất plasmid phage nguyên vẹn gọi vector (thể tải) đoạn ADN từ nguồn khác mang gen yếu tố điều hòa mong muốn cho xen vào hay gọi ADN ngoại lai Các công cụ dùng kĩ thuật ADN tái tổ hợp: 1.1 Các enzym chủ yếu: 1.1.1 Enzym giới hạn: Trong công nghệ di truyền muốn tạo ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải có plasmid, công cụ cắt plasmid đoạn ADN tế bào nối chúng lại với Công cụ cắt ADN enzym giới hạn Enzym giới hạn enzym có khả nhận biết đoạn trình tự ADN định cắt ADN điểm hay điểm kế cận Tuỳ theo phương thức cắt nguồn gốc enzym giới hạn mà người ta phân loại đặt tên cho enzym giới hạn Các enzym giới hạn phân lập từ sinh vật prokaryot, có khả phân hủy ADN bacteriophage để hạn chế khả sinh trưởng chúng tế bào vi khuẩn Hiện nay, người ta tìm thấy 900 enzym giới hạn khác từ khoảng 250 chủng vi sinh vật Enzym giới hạn có ba loại (type): I, II III Các enzym dùng phổ biến thuộc type II, có chế tác động đơn giản Đây nuclease cắt vị trí đặc hiệu nằm bên sợi ADN (chứ không phân hủy ADN từ hai đầu), nên gọi endonuclease Tên gọi đầy đủ chúng Restriction Endonuclease type II, hay gọi đơn giản enzym giới hạn (RE) Cách đặt tên enzym giới hạn kiểu II enzym giới hạn khác dựa quy ước chung Tên enzym giới hạn ghép chữ đẩu tiên tên chi hai chữ hai chữ tên loài vi sinh vật mà enzym tách chiết Còn chữ số La mã tên chủng dòng loài sinh vật cụ thể tách chiết enzym: Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại khác E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, …) Giá trị enzym giới hạn tính đặc hiệu chúng Các enzym cắt ADN vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, đoạn ngắn gọi palindrome (đoạn đối xứng, đoạn đích) Ví dụ: enzym EcoRI nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide) Nhìn chung, enzym giới hạn khác có hai kiểu cắt sau đây: cắt lệch cắt thẳng Với kiểu cắt lệch tức vị trí cắt hai sợi ADN sợi kép so le, tạo đoạn ADN có đầu sợi đơn gồm số base bổ sung gọi đầu dính Các enzym giới hạn có vai trò to lớn việc tạo ADN tái tổ hợp in vitro Điển hình EcoRI BamHI (bảng 1) Với kiểu cắt thẳng, tức cắt vị trí hai sợi ADN sợi kép, tạo đoạn ADN có đầu bằng; ví dụ, SmaI (bảng 1) Các enzym giới hạn khác có đoạn đích giống nhau, vị trí kiểu cắt giống khác nhau, gọi enzym giới hạn tương ứng (isoschizomers); ví dụ, SmaI XmaI (bảng 1) Bảng Các trình tự nhận biết vị trí cắt enzym giới hạn chọn lọc (mũi tên vị trí cắt; trình tự sợi 5'→3') Nguồn vi sinh vật Tên enzym Trình tự nhận biết Arthrobacter luteus Bacillus myloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Haemophilus influenzae Rd Nocardia otitidis-caviarum Providencia stuartii Serratia marcescens Sb Xanthomonas malvaccarum AluI BamHI EcoRI HindII HindIII NotI PstI SmaI XmaI AG↓CT G↓GATCC G↓AATTC GTPy↓PuAC A↓AGCTT GC↓GGCCGC CTGCA↓G CCC↓GGG C↓CCGGG Với bốn loại nitrogen base phân tử ADN giả thiết trình tự xếp chúng ngẫu nhiên, tần số mong đợi (kỳ vọng) đoạn trình tự xác định nào, theo tính toán 4n, n chiều dài đoạn nhận biết (cặp base) Từ đó, thấy với đoạn có bốn nucleotide cách 256 cặp base chúng lặp lại lần, đoạn sáu nucleotide cách 4096 cặp base lặp lại Tất nhiên, giá trị dao động lớn, nói chung chiều dài đoạn sinh sau cắt enzym giới hạn gần với giá trị tính toán Chẳng hạn, enzym nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sản sinh đoạn ngắn so với enzym nhận biết đoạn với sáu nucleotide 1.1.2 Enzym polymerase: ADN polymerase dùng để tổng hợp ADN thể điều kiện in vitro Khi nói enzym polymerase đó, người ta thường dùng thuật ngữ “ phụ thuộc ADN ” “ phụ thuộc ARN ” để axit nucleic mà enzym xúc tác cho việc chép ADN polymerase phụ thuộc ADN chép ADN sang ADN; ADN polymerase phụ thuộc ARN chép ARN sang ADN, enzym ARN polymerase phụ thuộc ADN phiên mã ADN sang ARN Các enzym tổng hợp axit nucleic cách nối nucleotide với theo nguyên tắc bổ sung dựa theo mạch khuôn Quá trình tổng hợp mạch bổ sung diễn theo chiều 5’-3’ khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự Các ADN polymerase: (ADN polymerase I, đoạn Klenow ADN polymerase I E coli, T4 ADN polymerase, Taq ADN polymerase …) Hiện có nhiều loại ADN polymerase khác lưu hành thị trường T7 ADN polymerase, Vent ADN polymerase … Các enzym ARN polymerase: Có ba loại enzym ARN polymerase thường dùng thực tế, SP6 ARN polymerase, T3 ARN polymerase T7 ARN polymerase … Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase): Có khả tổng hợp ADN mạch gọi ADN bổ trợ (cADN) từ khuôn mARN, từ đoạn polynucleotit tổng hợp đường hóa học Nhờ có đường phiên mã ngược mà tổng hợp hầu hết gen riêng biệt có mặt mARN gen Các cADN mạch đơn biến thành mạch kép nhờ ADN polymerase gọi cADN mạch kép (c-DNA duplex) Đoạn cADN mạch kép gắn vào plasmid biến nạp vào vi khuẩn, từ tạo dòng c-ADN Nếu cADN có nguồn gốc từ gen ta tạo dòng gen Trong trường hợp mARN trưởng thành nhân ta thu dòng gen chứa đoạn mã hóa (exon) Không có đoạn không mã hóa (intron) 1.1.3 Enzym nối (ligase): Enzym ligase enzym nối quan trọng tế bào Các enzym xúc tác hình thành liên kết phosphodiester để nối đoạn axit nucleic với ADN ligase xúc tác nối hai đoạn ADN với nhau, ARN ligase enzym chủ yếu sử dụng rộng rãi Có loại enzym nối thường dùng Công nghệ di truyền Đó enzym E.coli ADN ligase tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu sole; enzym T ADN ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli, có chức giống E.coli ADN ligase lại có khả nối hai đoạn trình tự ADN có đầu bằng; enzym T ARN ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả nối hai trình tự ARN liên kết phosphodiester Trong enzym T4 ADN polymerase enzym sử dụng rộng rãi phòng thí nghiệm Enzym chuỗi polypeptide (M = 68.000 Da) xúc tác cho tạo thành liên kết phosphodiester đầu 3’- OH tự phân tử ADN với đầu cuối 5’- PO4 phân tử ADN khác ADN ligase có tác dụng cho trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, nhiên đầu enzym đòi hỏi nồng độ cao điều kiện phản ứng khác Ngoài loại enzym nối kể trên, người ta sử dụng đoạn nối (đầu dính adapter) cho enzym cắt đầu Adapter xúc tác nối đoạn ADN có enzym giới hạn cắt đầu từ tạo nên đầu so le Mỗi đoạn enzym cắt đầu có loại adapter đặc trưng riêng 1.1.4 Nuclease: Là nhóm enzym xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester phân tử ADN ARN, bao gồm endonuclease (cắt bên phân tử axit nucleic) exonuclease (cắt bên phân tử axit nucleic) Các RE endonuclease, chúng có tính đặc hiệu cao cho trình tự nucleotide Dưới nuclease thường sử dụng: Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy bò, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết sau bazo nito mạch đơn mạch kép hoàn toàn ngẫu nhiên Enzym S1 nuclease (endonuclease) enzym tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae S1 nuclease BAL (endonuclease) phân cắt đầu 5’ 3’ ADN khả cắt nội liên kết Enzym exonuclease III tách chiết từ E coli, 3’ exonuclease cắt đầu 3’ mạch đơn tạo thành đoạn ADN có đầu 5’ nhô Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò Enzym thường sử dụng để loại bỏ ARN hỗn hợp ADN ARN Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN phân tử lai ADN-ARN, sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai cADN, từ tạo nên phân tử cADN kép 1.2 Các vector thông dụng: Muốn chuyển gen mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể nhận), tách dòng gen cần phải có vector chuyển gen Vector phân tử ADN có kích thước bé vừa phải, đóng vai trò vật trung gian truyền đoạn ADN ngoại lai nghiên cứu vào tế bào thể nhận (tế bào khả biến) đường biến nạp (transformation) tải nạp (transduction) Vector chuyển gen phải có đặc điểm quan trọng cần thiết sau: + Có điểm khởi đầu chép (origin of replication – ori) để tự chép mà tồn độc lập tế bào + Có đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn cắt để hở tạo nơi lắp ráp đoạn gen lạ + Có trình tự khởi điểm (promoter) + Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát nhận biết chúng tế bào chủ nhận Thông thường dấu chuẩn chọn lọc gen kháng chất kháng sinh, gen tổng hợp chất màu Để đảm bảo cho tính bền vững ADN tái tổ hợp, đặc điểm vector chuyển gen cần có đặc tính khác việc tạo, tách dòng dễ thực hiên như: + Chứa gen vô hiệu hóa đoạn ADN không mong muốn bị gắn nhầm vào + Có khả tạo nhiều để tách khỏi tế bào số lượng lớn, đảm bảo khuếch đại gen lạ mong muốn gắn vào + Giá trị vector chuyển gen chỗ cấu tạo thuận tiện cho mục đích sử dụng Hiện chưa có loại vector chuyển gen toàn năng, mà cần phải lựa chọn vector chuyển gen cho tưng đối tượng tùy thuộc kích thước đoạn gen cần chuyển 1.2.1 Hai loại vector thông dụng: Có hai loại vector thông dụng plasmid phage Plasmid vi khuẩn (hình 1, 2) sử dụng rộng rãi cả, chúng có đặc điểm sau: (i) có khả xâm nhập vào tế bào vật chủ mà hoạt động (tái bản, biểu gen) bình thường; (ii) có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng tinh chiết; (iii) số tế bào vi khuẩn thường cao; (iv) đặc biệt là, số plasmid có chứa gen kháng thuốc tiện lợi cho việc theo dõi phát có mặt plasmid tái tổ hợp vi khuẩn chủ Plasmid cải tiến qua hệ: Thế hệ thứ plasmid tự nhiên ngày không sử dụng pSC1001, ColE1, … Plasmid hệ thứ hai cấu tạo phức tạp Một plasmid hệ thứ hai sử dụng rộng rãi plasmid pBR322 có nguồn gốc từ plasmid nhỏ ColE1 Plasmid hệ thứ ba plasmid đa (polycloning plasmid), chuyên dụng có kích thước nhỏ có đoạn đa liên kết (polylinker), điểm đa tách dòng (multiple cloning site) Đoạn đa liên kết đoạn polynucleotide tổng hợp, mang chuỗi vị trí nhận biết nhiểu loại enzym giới hạn Nhóm plasmid plasmid pUC, plasmid pBluescript, Hình1 Plasmid hệ thứ hai pBR 322 Hình Plasmid hệ thứ ba pUC 18 pBluescript II SK Trong số phage dùng làm vector phage lambda ( λ ) có nhiều ưu nhất, lẽ phần gen có chứa số gen không quan trọng không liên quan với tái nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn ADN mong muốn vào Các phage không chứa gen kháng thuốc việc theo dõi phage tái tổ hợp xác định dựa vào vết tan dương tính vi khuẩn ADN có dạng mạch thẳng kép có hai đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (đầu cos) Có nhiều loại phage λ như: EMBL3, EMBL4, λ GEM11, phage M13… Phage M13 thường sử dụng làm vector tách dòng có ADN sợi đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6400 bp xâm nhiễm vào E.coli Hình Sơ đồ vector phage M13 1.2.2 Các vector khác: Vector cosmid: Là vector đặc biệt xây dựng plasmid đầu cos phage λ dùng để tạo dòng đoạn ADN có kích thước lớn eukaryot Cosmid có đặc điểm: mang marker kháng kháng sinh locus khởi đầu plasmid (ori), mang đoạn ADN với đầu kết dính cos phage λ , kích thước nhỏ cho đoạn ADN eukaryot dài 45 kb thích ứng Hình Vector cosmid: pWEB – TNCTM 10 Plasmid Ti: Được sử dụng rộng rãi để chuyển gen vào tế bào thực vật Plasmid Ti bắt nguồn từ vi khuẩn đất - Agrobacterium tumifaciens gây bệnh khối u (tumor) thực vật Vector YAC: vector tạo dòng mạch thẳng dựa cấu trúc NST tự nhiên nấm men Vector YAC cắt thành đoạn nhánh NST để nhận đoạn lớn có kích thước lên đến 2000 kb Tuy nhiên vector YAC có số nhược điểm: hiệu suất tạo dòng thấp, xuất dòng khảm, đoạn chèn hoạt động ổn định, thao tác kĩ thuật khó Vector virus: Các vector virus thường sử dụng loại virus SV40 (Smian virus) adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus herpes … Các vector nhóm sử dụng tách dòng gen chuyển gen tế bào động thực vật bậc cao Nhìn chung có nhiều loại vector khác dùng Công nghệ di truyền Mỗi loại vector có tế bào chủ đặc trưng khả xen đoạn ADN có kích thước khác Tạo dòng gen hay ADN tái tổ hợp Nguyên tắc chung: Kỹ thuật ADN tái tổ hợp hay tạo dòng (cloning) gồm bước sau: (1) Tách chiết tinh ADN thuộc nguồn khác (gồm vector ADN mang gen mong muốn); (2) tạo phân tử ADN tái tổ hợp in vitro; (3) đưa phân tử ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận, thường E coli nấm men; (4) phát phân lập dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu Để tạo phân tử ADN tái tổ hợp, tiến hành cắt ADN vector ADN mang gen mong muốn enzym giới hạn sau trộn lại nối chúng lại với enzym nối Tuy nhiên, thực tế, bước (4) bước tiến hành phức tạp gặp nhiều khó khăn Bởi kết thúc bước (3) sản phẩm thu plasmid tái tổ hợp sản phâm nhiều plasmid không tái tổ hợp 11 Hình Qui trình biến nạp ADN tái tổ hợp với vector plasmid, enzym giới hạn EcoRI, enzym nối ADN ligase tế bào nhận E.coli Trong tế bào chủ, phân tử ADN tái tổ hợp biểu gen mong muốn (cho sản phẩm protein) tái độc lập nhiều lần để tạo hàng loạt nó, tế bào chủ phân chia kéo theo tạo dòng phân tử (molecular cloning) Mặt khác, tốc độ phân chia nhanh vi khuẩn nên tạo hàng triệu mong muốn thời gian ngắn Vì tách dòng gen để dùng cho nghiên cứu cho sản xuất quy mô công nghiệp số lượng lớn chế phẩm y sinh học 2 Quy trình tạo dòng gen tái tổ hợp: • Bước 1: Tinh chiết ADN Giả sử tinh chiết plasmid có chứa hai gen kháng ampicillin tetracyclin, ký hiệu AmpR TetR; giả thiết gen TetR có chứa điểm cắt EcoRI, phân tử ADN người có mang gen insulin • Bước 2: Tạo phân tử ADN tái tổ hợp in vitro Trước tiên, dùng enzym giới hạn đầu dính EcoRI để cắt vòng plasmid gen Tet R cắt ADN người, số đoạn bị cắt có đoạn mang gen insulin Sau đem trộn lẫn hai loại ADN ống nghiệm với ADN ligase Kết xảy ba trường hợp: 12 (1) Plasmid tự nối lại thành mạch vòng lúc đầu; (2) Đoạn ADN tự nối lại thành mạch vòng; (3) Plasmid tái tổ hợp có mang gen insulin, mang đoạn ADN gen • Bước 3: Biến nạp phát dòng ADN tái tổ hợp chung Đưa ADN xử lý vào tế bào E coli Nếu phân tử có kích thước lớn người ta phải xử lý vi khuẩn “thể nhận” CaCl để làm cho màng trở nên thấm dễ dàng Sau đem cấy riêng rẽ vi khuẩn môi trường có ampicillin theo dõi + Nếu xuất khuẩn lạc (các vi khuẩn khuẩn lạc thuộc dòng chúng bắt nguồn từ vi khuẩn ban đầu) chứng tỏ vi khuẩn có mang gen Amp R, tức chúng có mang plasmid ban đầu (trường hợp A) plasmid tái tổ hợp (trường hợp C) Ngược lại, chỗ cấy không xuất khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn mang ADN tự nối (trường hợp B) + Tiếp theo đem cấy riêng rẽ vi khuẩn thu sang môi trường có tetracyclin Nếu có xuất khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn có mang gen Tet R nguyên vẹn (trường hợp A) Nếu khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn đem cấy có mang ADN tái tổ hợp (trường hợp C); gene TetR bị bất hoạt đoạn ADN xen vào Bằng cách theo dõi cho phép xác định dòng vi khuẩn mang ADN tái tổ hợp, chưa biết đâu dòng đặc hiệu, nghĩa dòng có mang gen insulin Hình Qui trình tạo dòng vi khuẩn mang gen insulin người 13 • Bước 4: Chọn dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu: Có hướng để chọn lọc dòng ADN lai axitnucleic dùng mẫu dò ARN đặc hiệu, phát kiểu hình, phát phản ứng miễn nhiễm tùy theo tính chất dòng gen Trong trường hợp ta sử dụng phương pháp miễn dịch học để chọn dòng ADN tái tổ hợp Bằng cách dùng kháng thể chống lại protein sinh dòng vi khuẩn tương ứng (tức huyết tìm gen kháng insulin) Ngoài để tìm dòng lai đặc hiệu người ta sử dụng mẫu dò mARN rARN đặc hiệu Chẳng hạn, trường hợp cần chọn dòng lai mang đoạn mARN cụ thể, người ta đem cấy dòng vi khuẩn có chứa ADN tái tổ hợp lên mặt thạch hộp petri chứa môi trường nuôi cấy Sau đóng dấu lên màng lọc nitrocellulose thu Việc xử lý NaOH làm cho tế bào vi khuẩn tan vỡ chỗ (in situ), ADN thoát từ chúng bị biến tính (các sợi đơn tách rời nhau) dính vào màng lọc Sau đem nhúng màng lọc vào mẫu mARN tương ứng đánh dấu phóng xạ (P 32) mẫu ARN gọi vật dò phóng xạ Nếu dòng có chứa ADN mã hoá cho mARN xảy tượng lai mARN vùng sợi đơn tương ứng ADN Sau loại bỏ mARN không lai được, người ta đặt miếng phim ảnh lên màng lọc; vết ảnh xuất ảnh phóng xạ tự ghi cho thấy vị trí dòng mang ADN bổ trợ với mẫu ARN Từ tách riêng dòng lai đặc hiệu để sử dụng cho nghiên cứu Hình Các bước xác định dòng vi khuẩn mang ADN tái tổ hợp đặc hiệu 14 Tổng hợp tạo dòng cADN: Khi muốn biểu gen quan tâm (tổng hợp protein cần thiết) vi khuẩn, ta tổng hợp gen dựa khuôn mẫu mARN enzym phiên mã ngược tinh chế từ virus ARN Sau cho xen gen vào plasmid, đem cấy vào vi khuẩn xác định dòng cADN đặc hiệu Ở ta xét hai bước: Bước 1: Tổng hợp cADN Vì mARN eukaryot có đuôi poly (A) đầu 3' nên trình tự sử dụng để tổng hợp sợi ADN bổ sung, cADN Khi đem trộn lẫn đoạn ngắn gồm nucleotide thymine (oligodT) với mARN xảy lai hoá với vùng đuôi mARN Đoạn oligo(dT) làm mồi cho enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) tổng hợp sợi cADN mà sản phẩm sợi kép lai ARN - cADN Ở đầu 3' sợi cADN tổng hợp có “mũ” tương tự đầu 5' mARN Tiếp theo, cách xử lý với NaOH, sợi mARN bị loại ra; “mũ” đầu 3' cADN lại làm mồi cho ADN polymerase I tổng hợp sợi thứ hai dọc theo sợi khuôn vốn có Sản phẩm cADN có dạng vòng sợi đơn Sau đó, vòng cắt bỏ cách xử lý với nuclease S1 để tạo cADN sợi kép Hình Sơ đồ tổng hợp cADN từ khuôn mẫu mARN 15 Bước 2: Xen đoạn cADN vào plasmid Tạo linker adapter nhờ xúc tác ADN ligase T4 gắn thêm vào hai “đầu bằng” sợi kép cADN oligonucleotide gồm 8-10 cặp base Sau đó, dùng enzym giới hạn thích hợp để cắt ''đoạn nối'' tạo đầu dính Đồng thời sử dụng enzym giới hạn để cắt plasmid Hai ADN nói nối với ADN ligase để tạo plasmid lai Hình Một linker tổng hợp Hình 10 Một adapter tổng hợp Ứng dụng kĩ thuật ADN tái tổ hợp: Đối với người, kĩ thuật ADN tái tổ hợp dùng để sản xuất vaccine tái tổ hợp, sản xuất chất có hoạt tính sinh học giúp nâng cao chất lượng sống kháng sinh, hoocmon, kháng thể đơn dòng Ngoài ra, dùng y học để chuẩn đoán bệnh, tư vấn trước sinh, sở liệu pháp gen để chữa bệnh nan y Trong nông nghiệp, nhờ kĩ thuật ADN tái tổ hợp giúp chuyển gen mong muốn từ tạo giống trồng kháng bệnh, suất cao, chất lượng tốt mang đặc tính quí 16 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP Bài tập lập đồ enzym giới hạn * Phân tử ADN mạch vòng có n điểm giới hạn tạo n đoạn xử lý enzym giới hạn Ví dụ: Khi cắt plasmid pBR322 HaeI, có 11 đoạn ADN tạo Khi cắt BamHI, có đoạn tạo Có điểm giới hạn cho loại enzym? Đáp án: ADN plasmid có mạch vòng Vậy có 11 điểm giới hạn cho HaeI cho BamHI * ADN mạch thẳng có n điểm giới hạn tạo n+1 đoạn Ví dụ: Một phân tử ADN mạch thẳng cắt EcoRI tạo đoạn kb, 4,2 kb kb Hãy xác định đồ giới hạn Đáp án: Có ba đoạn, phải có điểm giới hạn Các điểm phân bố sau: ↓ ↓ ↓ ↓ 4,2 ↓ ↓ 4,2 4,2 Đột biến làm thay đổi bazơ điểm nhận biết BgIII, và, vậy, enzym cắt phân tử lần Đoạn tổng hai đoạn 1,7 2,1 kb, cho thấy hai đoạn nằm kề phân tử ADN bình thường * Đột biến tạo điểm giới hạn làm đoạn cũ xuất hai đoạn ngắn Ví dụ: Khi xử lý AND tách từ đột biến khác BgIII, người ta thấy xuất đoạn 1,3 kb, 1,7 kb, 1,9 kb 2,1 kb Hãy giải thích kết thu Đáp án: Chúng ta thấy đoạn 1,7 2,1 kb có ADN bình thường ADN đột biến Điểm giới hạn sinh hai đoạn phải nguyên vẹn ADN đột biến Hai đoạn lại, 1,3 1,9 kb có tổng 3,2 kb, đoạn bị Vậy, điểm giới hạn tạo ADN gốc * Nếu đoạn enzym giới hạn tạo xuất xử lý enzym hỗn hợp hai enzym đoạn điểm giới hạn cho enzym thứ hai Ví dụ: Một phân tử ADN mạch thẳng xử lý enzym kết sau: 17 EcoRI: 1,7; 2,1; 3,2 kb HaeI: 1,0; 1,4; 4,6 kb Hỗn hợp: 0,7; 1,0; 1,4; 1,8; 2,1 kb Những đoạn giới hạn EcoRI không chứa điểm giới hạn HaeI ngược lại? Đáp án: Đoạn 2,1 EcoRI xuất “hỗn hợp”, , điểm giới hạn HaeI Các đoạn khác EcoRI xử lý hai enzym, nên chúng phải chứa điểm giới hạn HaeI Tương tự, đoạn 1,0 1,4 HaeI không chứa điểm giới hạn HaeI * Để lập đồ giới hạn, phải xem xét đoạn giới hạn tạo xử lý hai enzym với đoạn tạo xử lý enzym riêng biệt Ví dụ: Hãy xét lại đoạn xây dựng đồ giới hạn Đáp án: Vì 1,0 + 0,7 = 1,7 1,4 + 1,8 = 3,2 nên đoạn 1,7 EcoRI phải có điểm giới hạn cho HaeI từ đầu: E 1,0 H 0,7 E Tương tự, đoạn 3,2 phải có điểm giới hạn cho doạn HaeI dài 1,8 từ đầu: E 1,8 H 1,4 E Bây giờ, xếp trật tự có cho đoạn EcoRI: 1,7 ↓ ↓ 2,1 1,7 2,1 ↓ 1,7 ↓ 3,2 ↓ 3,2 ↓ 3,2 2,1 Hãy thêm điểm giới hạn biết HaeI vào vị trí Một trật tự là: E H E H ↓ ↓ ↓ ↓ 18 2,1 1,0 0,7 1,4 1,8 Chúng ta nhận đoạn 3,1 kb xử lý ADN HaeI Nếu trật tự 2,1; 0,7; 1,0; 1,4 1,8, xử lý HaeI phải tạo đoạn 2,8 kb Vậy đoạn 1,7 kb không nằm Nếu đoạn 3,2 kb nằm phải gặp đoạn 3,5 kb đoạn 3,9 kb xử lý HaeI Điều không xảy ra, trật tự phải là: E ↓ 1,7 1,0 E 2,1 ↓ ↑0,7 3,2 1,8 ↑ H 1,4 H Nếu điểm giới hạn HaeI 0,7 kb từ đầu ta phải gặp đoạn 0,7 kb xử lý ADN HaeI Biện luận tương tự cho đoạn 1,8 kb Dựa vào bảng 1: biết enzym giới hạn EcoRI nhận trình tự cắt vị trí G A: G↓AATTC Hãy vẽ trình tự ADN sợi kép trước sau enzym cắt Trả lời: 5’ GAATTC 3’ CTTAAG 3’ ECoRI 5’ G 3’ 5’ AATTC 3’ 5’ 3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’ Giả sử tiến hành tạo plasmid tái tổ hợp hình vẽ: 19 AmpR: gen kháng ampicillin, lacZ: gen mã hóa β galactosidase Nếu môi trường nuôi cấy vi khuẩn bước (*) không chứa ampicillin có X - gal loại khuẩn lạc mọc được? Trả lời: Trong môi trường có chứa X - Gal, vi khuẩn sinh trưởng tốt chứng tỏ chúng mang plasmid tái tổ hợp (mang gen lac Z nguyên vẹn) không xuất khuẩn lạc có nghĩa vi khuẩn mang gen lac Z (vì gen lac Z bị bất hoạt đoạn ADN cài xen vào) (đề thi quốc tế năm 2009, phần A) Trình tự nhận biết enzyme giới hạn Aval CYCGRG, Y pyrimidine R purin Khoảng cách mong đợi (tính theo cặp bazơ nitơ) hai điểm cắt Aval chuỗi ADN dài, có trình tự ngẫu nhiên bao nhiêu? A 4096 cặp bazơ nitơ B 2048 cặp bazơ nitơ C 1024 cặp bazơ nitơ D 512 cặp bazơ nitơ E 256 cặp bazơ nitơ F 64 cặp bazơ nitơ (đề thi quốc tế năm 2009, phần A) Sự nhân đôi trình tự nucleotit gen gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới chức gen số trường hợp, 20 trường hợp khác không Kiểu nhân đôi trình tự nhiều khả dẫn đến tổng hợp loại protein chức cả? A Một cặp bazơ nitơ nhân đôi trước điểm bắt đầu dịch mã B Ba cặp bazơ nitơ nhân đôi trước điểm bắt đầu dịch mã C Một cặp bazơ nitơ lặp lại vùng mã hóa gần điểm bắt đầu dịch mã D Ba cặp bazơ nitơ nhân đôi vùng mã hóa gần điểm bắt đầu dịch mã E Một cặp bazơ nitơ nhân đôi vùng mã hóa gần ba kết thúc F Ba cặp bazơ nitơ nhân đôi vùng mã hóa gần ba kết thúc (đề thi quốc tế năm 2010, phần B) Hình mô tả trình tạo chuyển gen biến nạp gen X sử dụng plasmit Ti vi khuẩn Agrobacterium Chú thích hình: Restriction enzyme site = Vị trí cắt enzym giới hạn Recombinant Ti-plasmid = Plasmid Ti tái tổ hợp Introduce recombinant vector into Agrobacteria = Biến nạp véctơ tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium Introduce gen X into plant cells using Agrobacteria = Gen X vi khuẩn Agrobacterium chuyển vào tế bào thực vật Callus formation = Tế bào biến nạp hình thành mô sẹo Differentiate into whole plant = Biệt hóa thành hoàn chỉnh Transformant harboring gene X = Cây chuyển gen mang gen X 6.1 Các phát biểu trình sai? Explanation / Các câu giải thích I Các enzym giới hạn ligaza dùng để tạo phân tử ADN tái tổ hợp II Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật dùng để kích thích mô tái sinh 21 III Toàn plasmid Ti với gen X tái tổ hợp kết hợp vào hệ gen thực vật IV Có thể dùng kỹ thuật PCR phân tích Southern để khẳng định chuyển gen biến nạp gen X thành công V Có thể sử dụng kỹ thuật RT(phiên mã ngược)-PCR, phân tích Northern Western để kiểm tra biểu gen X chuyển gen Trả lời: Phát biểu đúng: I, IV, V Phát biểu sai: II, III 6.2 Các phát biểu nói véctơ biểu gen thực vật nói chung sai? Description / Các câu phát biểu I Nó thường phải mang gen đánh dấu hay thị chọn lọc để nhận tế bào chuyển gen thành công II Nó thường phải mang promoter giúp gen biến nạp biểu tế bào thực vật III Nó thường phải chứa vị trí đa nhân dòng để cài gen ngoại lai vào thể truyền IV Nó phải chứa trình tự nucleotit giống hệt phần đặc hiệu hệ gen thực vật gen đích cài vào hệ gen tế bào chủ chế tái tổ hợp tương đồng V Nó thường phải chứa vị trí khởi đầu tái để nhân lên thành nhiều trình tạo vectơ tái tổ hợp Trả lời: Phát biểu đúng: I, II, III, V Phát biểu sai: IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 Nguyên lí kĩ thuật di truyền, Lê Đình Lương, NXB Khoa học Kĩ thuật Sinh học, Campbell Reece, NXB Giáo dục Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, Võ Thị Thương Lan, NXB Giáo dục Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, Lê Trần Bình, NXB Nông nghiệp Công nghệ sinh học - công nghệ di truyền, Trịnh Đình Đạt, NXB Giáo dục 6.http://www.thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/5173-adn-taito-hop.html http://www.daibio.com.vn/cong-nghe-dna-tai-to-hop/ 8.http://old.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-va-cong-nghe/cong-nghe-dna-tai-to-hop-va-sutach-dong.html http://congnghesinhhoc24h.com/tai-lieu/cong-nghe-dna-tai-hop-139.html 23 ... linker tổng hợp Hình 10 Một adapter tổng hợp Ứng dụng kĩ thuật ADN tái tổ hợp: Đối với người, kĩ thuật ADN tái tổ hợp dùng để sản xuất vaccine tái tổ hợp, sản xuất chất có hoạt tính sinh học giúp... ĐẦU Công nghệ ADN tái tổ hợp đời dựa sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trò cách mạng phát triển công nghệ sinh học Kỹ thuật ADN tái tổ hợp cho phép nhà công nghệ sinh học phân lập khuếch... phân tử ADN tái tổ hợp in vitro; (3) đưa phân tử ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận, thường E coli nấm men; (4) phát phân lập dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu Để tạo phân tử ADN tái tổ hợp, tiến hành