MỘT SỐ VẤN ĐỀ CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG CHƯƠNG TRÌNH THPT A - LÍ THUYẾT CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ GEN Khái niệm công nghệ gen Công nghệ gen hay kĩ thuật di truyền bao gồm kĩ thuật thao tác vật liệu di truyền để điều chỉnh, sửa chữa, tạo gen mới, từ tạo thể với đặc điểm Hiện công nghệ gen thực phổ biến tạo phân tử ADN tái tổ hợp để chuyển gen 1.1 Các khâu kĩ thuật chuyển gen a Tạo ADN tái tổ hợp - Tách chiết thể truyền gen cần chuyển khỏi tế bào (phân lập gen) - Xử lí loại enzim giới hạn để tạo loại đầu dính - Dùng enzim nối để gắn chúng tạo ADN tái tổ hợp b Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận Dùng muối CaCl2 xung điện cao áp làm giãn màng sinh chất tế bào để ADN tái tổ hợp dễ dàng qua c Phân lập dòng tế bào chứa ADN tái tổ hợp - Chọn thể truyền có dấu chuẩn dễ nhận biết dùng gen “đánh dấu” hay gen “thông báo” - Bằng kỹ thuật định nhận biết tế bào có ADN tái tổ hợp dựa vào sản phẩm đánh dấu 1.2 Các công cụ kĩ thuật công nghệ gen a Vectơ tách dòng (thể truyền) Đó phương tiện chuyển gen, thường phân tử ADN nhỏ, cho phép gắn gen (ADN) ngoại lai, có khả tự chép, tồn độc lập tế bào chủ đặc biệt phải mang tín hiệu nhận biết tế bào mang vectơ tái tổ hợp Các loại vectơ tách dòng (thể truyền) thường dùng : Plasmit (có nguồn gốc vi khuẩn), Phage (có nguồn gốc virut), Cosmit (thể truyền lai, có thuộc tính plasmit phage), Ti-plasmit (dùng để nhân dòng chuyển gen thực vật), Các NST nhân tạo Các thể truyền khác số thuộc tính phân tử, loại tế bào chủ kích thước tối đa đoạn ADN mà chúng mang * Plasmit : Plasmit cấu trúc nằm tế bào chất vi khuẩn Tùy loài vi khuẩn, tế bào chứa vài đến vài chục plasmit Plasmit chứa ADN dạng vòng, có khả nhân đôi độc lập với hệ gen tế bào tế bào, loại plasmit thường có nhiều - Đặc điểm thể truyền có nguồn gốc từ E.coli plasmit : + Có trình tự khởi đầu tái ADN (Ori) Trình tự thiết yếu để plasmit tái tế bào E coli + Có vị trí giới hạn đặc thù Đây điểm để cài đoạn ADN (hoặc gen) cần chuyển vào thể truyền + Có gen thị chọn lọc Gen biểu gen trội, nhờ giúp phân biệt dễ dàng tế bào E coli mang ADN tái tổ hợp - Ưu điểm : + Cấu trúc tương đối đơn giản, kích thước nhỏ + Dễ tinh phân tích sản phẩm ADN tái tổ hợp + Có thể nhân lên số lượng lớn tế bào chủ với tốc độ nhanh, hiệu suất nhân dòng cao - Nhược điểm : + Hiệu suất biến nạp ADN tái tổ hợp nhiều loại tế bào chủ (không phải vi khuẩn) thấp + Không mang đoạn ADN lớn (>10kb) * Phage : Phần lớn thể truyền phage có nguồn gốc từ ADN hệ gen phage λ, phage M13 - Ưu điểm : + Hiệu biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ thường cao thể truyền plasmit (do phage khả tự lây nhiễm, đóng gói phân tử ADN tái tổ hợp giải phóng khỏi tế bào chủ) + Có thể chuyển gen hiệu vào tế bào vi khuẩn số tế bào sinh vật nhân thực + Có thể mang đoạn ADN có kích thước lớn thể truyền plasmit (tới ∼ 30kb) + Rất bền bảo quản nhiệt độ oC Các dòng virút mang ADN tái tổ hợp bảo quản thời gian dài (nhiều năm) chưa có nhu cầu sử dụng - Nhược điểm : + Kích thước lớn (so với thể truyền plasmit) việc phân tích trình tự phức tạp + Số phage tế bào chủ thường thấp so với thể truyền plasmit * Ti-plasmit : Là plasmit kích thước lớn (∼ 200kb) tìm thấy vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gây nốt sần thực vật Ti-plasmit vectơ chuyển gen vào tế bào thực vật * Các vectơ NST nhân tạo : - NST nhân tạo nấm men (YAC) : Là thể truyền có khả tự tái tế bào nấm men Cấu trúc gồm : + Đầu mút NST (TEL) có đầu vectơ Cấu trúc đầu mút cần thiết để NST bền vững ổn định tế bào nấm men + Tâm động nấm men (CEN) Trình tự thiết yếu để NST nhân tạo phân li xác tế bào tế bào nấm men phân chia + Mỗi vai NST nhân tạo có gen thị để phát tế bào nấm men mang YAC + Một trình tự khởi đầu tái Trình tự giúp vectơ tái tế bào nấm men + Một vị trí đa nhân dòng mang trình tự nhận biết enzim giới hạn dùng làm điểm gắn ADN cần nhân dòng - NST nhân tạo vi khuẩn (BAC ): Được dùng để nhân dòng đoạn ADN kích thước lớn đến 300kb tế bào E.coli BAC chứa : + Một trình tự khởi đầu chép plasmit có tự nhiên + Một vị trí đa nhân dòng + Một gen thị chọn lọc + Ngoài có thêm số trình tự chức khác * Cosmit : - Là vectơ nhân tạo gồm phần có cấu trúc plasmit với hai đầu Cos phage λ giúp vectơ tự đóng gói thành phân tử ADN vòng sau biến nạp vào tế bào chủ - Vectơ mang đoạn ADN ngoại lai có kích thước lớn khoảng 40 - 50kb - Vectơ vừa thừa hưởng khả tự tái plasmit vừa có khả tự đóng gói phage * Vectơ thoi : Là nhóm vectơ vừa có khả tái tế bào vi khuẩn vừa có khả biến nạp biểu chức tế bào động vật có vú tế bào nhân thực khác Nói cách khác chúng dùng để biến nạp vào hai hay nhiều loại tế bào chủ khác b Enzim cắt, enzim nối * Enzim cắt giới hạn (Restrictaza) : Là enzim có khả nhận biết đoạn trình tự phân tử ADN cắt ADN điểm đặc hiệu Enzim cắt giới hạn chia làm nhóm tùy thuộc vào kiểu cắt ADN chúng : - Enzim cắt giới hạn đầu so le : Là enzim có khả nhận biệt đoạn trình tự lại cắt vị trí lệch mạch đơn theo kiểu cắt chữ Z Khi sử dụng enzim cắt giới hạn đầu so le cắt nguồn ADN tạo đầu dính, từ nối đoạn ADN bị cắt lại với - Enzim cắt giới hạn đầu : Là enzim có khả nhận biết đoạn trình tự cắt vị trí giới hạn để tạo đầu - Cần phải sử dụng enzim nối ligaza đoạn nối chuyên dụng cho loại enzim * Enzim nối (Ligaza) : Xúc tác phản ứng nối tạo liên kết photphodieste hai nuclêôtit liên tiếp c Tế bào chủ Mục đích sử dụng máy di truyền tế bào chủ để chép ADN tái tổ hợp thành lượng lớn nên người ta thường dùng loại tế bào chủ : - Vi khuẩn E coli : Dễ nuôi cấy, dễ thao tác, tốn lại sinh sản nhanh tạo dòng ADN tái tổ hợp nhanh - Tế bào động vật, thực vật nuôi cấy tế bào nấm men Loại tế bào chủ thường dùng vào mục đích cụ thể Các phương pháp chuyển gen 2.1 Chuyển gen trực tiếp Là phương pháp sử dụng kĩ thuật kĩ thuật siêu âm, kĩ thuật xung điện, vi tiêm, bắn gen để nạp gen vào tế bào chủ - Kĩ thuật siêu âm : Là kĩ thuật dùng máy siêu âm để đưa ADN ngoại lai xâm nhập vào gen tế bào trần vật chủ - Kĩ thuật xung điện : Là kĩ thuật sử dụng dòng điện cao áp khoảng 500V/cm với thời gian 4-5%o giây tạo lỗ thủng tế bào trần làm cho gen lạ bên dễ xâm nhập vào gen tế bào chủ - Kĩ thuật vi tiêm : Là kĩ thuật sử dụng lượng nhỏ ADN (các gen) tiêm vào tế bào chủ tiêm vào tế bào trứng thụ tinh giai đoạn phôi có 4-8 tế bào - Kĩ thuật bắn gen : Là kĩ thuật sử dụng sử dụng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển (súng bắn gen) vào gen tế bào chủ Vi đạn hạt vonfram vàng trộn với gen cần chuyển phụ gia làm gen chuyển bao quanh vi đạn Vi đạn gắn vào đầu viên đạn lớn hơn, sau nạp vào súng bắn gen Súng bắn gen có lưới thép mịn đầu nòng cho phép bắn viên đạn lớn giữ lại, vi đạn bắn vào tế bào với gia tốc lớn Gen cần chuyển bắn vào tái tổ hợp với gen tế bào chủ, tạo nên tế bào mang gen chuyển, từ tạo thể chuyển gen 2.2 Chuyển gen gián tiếp Là kĩ thuật chuyển gen (tải nạp) nhờ nhân tố trung gian vi khuẩn Agrobacterium virút phage - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium : Là phương pháp sử dụng vi khuẩn gây khối u thực vật Vi khuẩn Agrobacterium chứa plasmit lớn tạo nên khối u thực vật gọi Ti-plasmit Cây bị nhiễm Agrobacterium qua vết xước vi khuẩn truyền đoạn ADN Ti-plasmit có mang gen sản sinh auxin, opin cho cây, làm hình thành khối u Ti-plasmit biến đổi cách loại bỏ gen gây khối u mà lại gắn gen để chuyển gen vào trồng - Chuyển gen nhờ virút phage : Là phương pháp sử dụng virut (SV 40, BPV ) phage (phage λ, phage M13) để chuyển gen vào vi khuẩn tế bào thực vật Ứng dụng công nghệ gen tạo giống biến đổi gen * Thành tựu bật ứng dụng kĩ thuật di truyền khả cho tái tổ hợp thông tin di truyền loài đứng xa bậc thang phân loại mà lai hữu tính thực Công nghệ gen tạo sinh vật biến đổi gen - Sinh vật biến đổi gen : Là sinh vật mà hệ gen làm biến đổi phù hợp với lợi ích người Trong đó, cách làm biến đổi hệ gen sinh vật đưa thêm gen lạ vào hệ gen sinh vật loại bỏ làm bất hoạt gen hệ gen Ví dụ cà chua biến đổi gen có gen làm chín bị bất hoạt, cà chua vận chuyển xa bảo quản lâu, không bị thối - Một số thành tựu tạo giống biến đổi gen : + Tạo chủng vi sinh vật biến đổi gen nhằm phục vụ mục đích khác người Điển hình công nghệ gen tạo chủng vi sinh vật có khả sản suất nhiều loại sản phẩm sinh học có giá trị axít amin, prôtêin, vitamin, enzim, hoócmôn, kháng sinh quy mô công nghiệp với số lượng lớn giá thành rẻ Công nghệ gen tạo chủng vi sinh vật làm môi trường phân hủy rác thải, dầu loang Ví dụ tạo chủng vi khuẩn E coli sản suất hoócmôn insulin để chữa tiểu đường người, tạo chủng vi khuẩn E.Coli sản suất hooc môn Somatostatin, chuyển gen tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn (sinh sản chậm) vào chủng vi khuẩn (sinh sản nhanh) nhằm mục đích hạ giá thành thuốc kháng sinh, tạo chủng vi khuẩn chuyển gen có khả phân hủy nhanh rác thải … + Tạo động vật chuyển gen, tạo động vật có suất chất lượng sản phẩm cao hơn, đặc biệt tạo động vật chuyển gen sản xuất thuốc chữa bệnh cho người Ví dụ tạo giống cừu sản xuất prôtêin người, tạo giống bò chuyển gen mà sữa sản xuất prôtêin chữa bệnh máu vón cục gây tắc mạch máu người + Tạo giống trồng biến đổi gen cách đưa nhiều gen quy định đặc tính quý suất hàm lượng dinh dưỡng cao, kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ dại chịu điều kiện bất lợi, tăng thời hạn bảo quản, khó bị dập nát vận chuyển vào trồng Ví dụ chuyển gen trừ sâu vào tạo giống kháng sâu hại, tạo giống lúa “gạo vàng” có khả tổng hợp βcarôten (tiền chất tạo vitamin A) hạt B - MỘT SỐ CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ GEN Câu : Trình bày bước sử dụng kĩ thuật cấy gen vào E coli để sản xuất vacxin tái tổ hợp phòng chống bệnh lở mồm, long móng động vật móng guốc Biết hệ gen loại virut có chất ARN vacxin phòng bệnh prôtêin kháng nguyên (VP1) hệ gen virut mã hóa Hướng dẫn * Các bước : - Tách ARN virut mang gen kháng nguyên VP1 - Phiên mã ngược tạo cADN-VP1 - Tách plasmit từ E.coli - Dùng enzim giới hạn cắt plasmit VP1 - Nối pasmit E.coli với đoạn cADN-VP1 tạo plasmit tái tổ hợp - Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli - Nuôi E.coli có plasmit tái tổ hợp để vi khuẩn sản xuất vacxin Câu : Trong kỹ thuật di truyền, việc lựa chọn vectơ plasmit cần quan tâm đến đặc điểm ? Hướng dẫn - Plazmit có kích thước ngắn - Có gen chuẩn (gen đánh dấu) - Có điểm cắt enzym giới hạn - Có thể nhân lên nhiều tế bào nhận Câu : Plasmid ? Để dùng làm thể truyền (vector) cần phải biến đổi plasmid ? Hướng dẫn - Plasmid phân tử ADN, vòng, sợi kép, tự tái bản, trì vi khuẩn thực thể độc lập nhiễm sắc thể - Một số plasmid mang thông tin việc di chuyển từ tế bào sang tế bào khác (F plasmid), số khác mã hóa khả kháng lại kháng sinh (R plasmid), số khác mang gen đặc biệt để sử dụng chất chuyển hóa bất thường (plasmid phân huỷ) - Để dùng làm vector plasmid cần phải có : + Vùng nhân dòng đa vị chứa điểm cắt cho endonucleaza giới hạn, dùng để chèn ADN nhân dòng + Plasmid chứa gen để chọn (như gen kháng ampicillin, ) + Điểm khởi động chép hoạt động E coli Câu : Trong kĩ thuật cấy gen, cho biết : * Thể truyền ? Vì thể thực khuẩn xem loại thể truyền lý tưởng ? * Thế ADN tái tổ hợp ? Nêu tóm tắt bước tạo ADN tái tổ hợp Hướng dẫn * Thể truyền phân tử ADN nhỏ có khả tự nhân đôi cách độc lập với hệ gen tế bào Thể truyền plasmit virut * Thể thực khuẩn xem loại thể truyền lý tưởng thoả mãn tiêu chuẩn thể truyền có khả biến nạp vào tế bào nhận * ADN tái tổ hợp phân tử ADN nhỏ lắp ráp từ đoạn ADN lấy từ tế bào khác (thể truyền gen cần chuyển) * Các bước tạo ADN tái tổ hợp : Tách chiết tinh ADN nguồn khác nhau, cắt nối Câu : Trong kĩ thuật di truyền, người ta cần phải tách dòng tế bào mang ADN tái tổ hợp khỏi loại tế bào khác Hãy mô tả qui trình chọn lọc dòng tế bào mang ADN tái tổ hợp Vectơ biểu dùng công nghệ sinh học loại vectơ giúp tạo nhiều sản phẩm gen protêin Để đáp ứng điều vectơ biểu cần có đặc điểm ? Hướng dẫn Để tách dòng tế bào có chứa ADN tái tổ hợp khỏi loại tế bào khác người ta thường phải dùng plasmit có chứa gen đánh dấu gen kháng kháng sinh Một plasmit dùng làm thể truyền cần phải chứa gen kháng lại hai chất kháng sinh khác tế bào nhận không chứa gen kháng kháng sinh Tại hai gen kháng chất kháng sinh phải chứa trình tự nhận biết cắt enzym cắt giới hạn Do đó, dùng enzim cắt giới hạn cắt plazmit để gắn gen tạo ADN tái tổ hợp gen kháng kháng sinh bị hỏng ADN tái tổ hợp kháng lại loại kháng sinh mà Như xử lí dòng tế bào loại kháng sinh sau tách tế bào có ADN tái tổ hợp Vectơ biểu cần có đặc điểm : - Vectơ biểu cần có promotơ khoẻ, tức có lực cao với ARN polymeraza Nhờ gen phiên mã nhiều cho nhiều sản phẩm (protein) - Vectơ biểu loại có khả tạo nhiều tế bào (véctơ đa phiên bản) Câu : Trước người ta hay chuyển gen người vào tế bào vi khuẩn để sản sinh protein định người với số lượng lớn Tuy nhiên, nhà sinh học phân tử lại ưa dùng tế bào nấm men làm tế bào để chuyển gen người vào dùng tế bào vi khuẩn Tại ? Hướng dẫn Vì tế bào nấm men tế bào nhân chuẩn nên có enzym để loại bỏ intron khỏi ARN trình tinh chế để tạo mARN, tế bào nhân sơ vi khuẩn chúng gen phân mảnh nên enzim cắt intron Câu : Trong công nghệ sinh học, người ta tạo nhiễm sắc thể nhân tạo Theo em, cần lắp ráp trình tự nucleotit để tạo nên nhiễm sắc thể nhân tạo dạng thẳng, cho hoạt động nhiễm sắc thể bình thường tế bào nhân thực ? Hướng dẫn - Phải có trình tự khởi đầu chép (xuất phát tái bản) – trình tự giúp enzim nhận biết khởi đầu trình tự nhân đôi ADN - Có trình tự nucleotit làm nhiệm vụ tâm động (liên kết với thoi vô sắc trình phân bào) - Có trình tự đầu mút đầu nhiễm sắc thể để trì ổn định nhiễm sắc thể nhân tạo, để nhiễm sắc thể không dính vào Câu : Để tổng hợp loại prôtêin đơn giản người nhờ vi khuẩn qua sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp, người ta có hai cách : * Cách thứ : Tách gen mã hóa prôtêin trực tiếp từ hệ gen nhân tế bào, cài đoạn gen vào plasmit vi khuẩn nhờ enzim ligaza * Cách thứ hai : Tách mARN trưởng thành gen mã hóa prôtêin đó, sau dùng enzim phiên mã ngược tổng hợp lại gen (cADN), cài đoạn cADN vào plasmit nhờ enzim ligaza Trong thực tế, người ta thường chọn cách ? Tại ? Hướng dẫn * Trong thực tế, người ta chọn cách thứ hai * Giải thích : - ADN (gen) tách trực tiếp từ hệ gen người thường mang intron, cADN (được tổng hợp từ mARN tế bào chất) không mang intron - Các tế bào vi khuẩn khả cắt bỏ intron gen eucaryote, nên đoạn ADN cài tách trực tiếp từ nhân không tạo prôtêin bình thường - Đoạn ADN phiên mã ngược (cADN) tương ứng mARN dùng để dịch mã prôtêin, có kích thước ngắn nên dễ tách dòng biểu gen điều kiện in-vitro Câu : Trong công nghệ gen, người ta sản xuất prôtêin đơn giản động vật có vú nhờ vi khuẩn, chẳng hạn E coli Trên sở đặc điểm khác cấu trúc gen sinh vật nhân sơ nhân thực, nêu cải biến cần thực gen cấy, để tế bào vi khuẩn sản xuất prôtêin động vật có vú Hướng dẫn * Cấu trúc gen sinh vật nhân thực khác sinh vật nhân sơ chỗ : - Có chứa intron - Trình tự ADN khởi đầu phiên mã - Trình tự kết thúc phiên mã - Trình tự tín hiệu khởi đầu dịch mã * Để tế bào vi khuẩn sản xuất protein động vật có vú, gen động vật có vú trước cấy vào E coli thường : - Được dùng dạng cADN (không chứa intron) - Cải tiến phần trình tự khởi đầu phiên mã - Cải tiến phần trình tự kết thúc phiên mã - Cải tiến phần trình tự khởi đầu dịch mã 10 ... thực Công nghệ gen tạo sinh vật biến đổi gen - Sinh vật biến đổi gen : Là sinh vật mà hệ gen làm biến đổi phù hợp với lợi ích người Trong đó, cách làm biến đổi hệ gen sinh vật đưa thêm gen lạ... chuyển gen trừ sâu vào tạo giống kháng sâu hại, tạo giống lúa “gạo vàng” có khả tổng hợp βcarôten (tiền chất tạo vitamin A) hạt B - MỘT SỐ CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ GEN Câu : Trình. .. hệ gen sinh vật loại bỏ làm bất hoạt gen hệ gen Ví dụ cà chua biến đổi gen có gen làm chín bị bất hoạt, cà chua vận chuyển xa bảo quản lâu, không bị thối - Một số thành tựu tạo giống biến đổi gen