Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm isaria japonica và phellinus pini ở vùng bắc trung bộ (tt)

28 144 0
  • Loading ...
Loading...
1/28 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 26/04/2017, 17:28

1 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NẤM Isaria japonica Phellinus pini BẮC TRUNG BỘ CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 62 44 01 14 TÓM TẮT UẬN ÁN TI N S HÓA HỌC NGHỆ AN – 2017 C P ệ C T N H ơ, V H , GS TS T T GS TS Tian Shung-Wu P ệ PGS TS ặ P ệ GS TS H P ệ GS TS N ệ 00 C , N Q H ễ H N H T 12 ă 03 t 017 ệ T ệ Q T T Vinh Vệ N T ệ N ễ T H –T MỞ ẦU ý Nấm sinh vật thiếu đời sống, nấm, chu trình tuần hoàn vật chất bị mắt xích quan trọng việc phân hủy chất bã hữu Nấm nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ axit amin thiết yếu, hàm lƣợng chất béo chủ yếu axit béo chƣa bão hòa, giá trị lƣợng cao, giàu khoáng chất vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe ngƣời Ngoài ra, nấm chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, góp phần ngăn ngừa điều trị bệnh cho ngƣời Ngày nay, ngày nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài nấm nhằm phát hoạt chất có dƣợc tính mạnh bệnh nan y nhƣ viêm gan, kháng viêm ung thƣ, HIV…Việc đƣa vào sử dụng rộng rãi chế phẩm đƣợc tách chiết từ nấm giúp ngƣời khỏe mạnh, phòng chống đƣợc nhiều bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm [1], [2], [5], [6], [13] Việt Nam quốc gia có đa dạng sinh học cao giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, kiểu sinh thái khác nhau… góp phần tạo nên đa dạng khu hệ nấm Việt Nam Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đƣợc ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam, số khoảng 1400 loài thuộc 120 chi loài nấm lớn [3], [4], [9] Các loài nấm lớn Việt Nam có giá trị tài nguyên đáng kể nhiều mặt, có khoảng 50 loài nấm ăn quý nhƣ: loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hƣơng (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), nấm chàm (Boletus aff felleus Bull.), nấm bào ngƣ (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) [4], [6] Có khoảng 200 loài nấm dùng làm dƣợc liệu, có nhiều loài dƣợc liệu quý nhƣ: linh chi (G.lucidum), linh chi sò (G.capense), cổ linh chi (G.applanatum), vân chi (Trametes versicolor), phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hƣơng (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)…[8], [20], [21] Những nghiên cứu bƣớc đầu hợp chất có hoạt tính sinh học số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng giàu hợp chất có khối lƣợng phân tử lớn nhƣ polysaccharit, polysaccharitpeptit, lectin… chất có khối lƣợng phân tử nhỏ nhƣ flavonoit, steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị bệnh hiểm nghèo nhƣ ung thƣ, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả sinh enzym số hoạt chất quý đƣợc ứng dụng công nghệ sinh học bảo vệ môi trƣờng Bắc Trung khu vực có nhiều vƣờn Quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên nhƣ Phong Nha - Kẻ Bàng, Vũ Quang, Hồ Kẻ Gỗ, Pù Mát, Pù Huống, Pù Hoạt Bến En Đây vùng đƣợc đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, có chứa đựng nguồn lợi lớn đa dạng sinh học, có nguồn lợi lớn nấm sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm… [15], [16], [37], [212], [213] Các nghiên cứu nấm Việt Nam nói chung khu vực Bắc Trung nói riêng vấn đề mới, chƣa nhận đƣợc quan tâm mức nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu nấm vùng Bắc Trung yêu cầu thiết, có ý nghĩa lý luận thực tiễn, góp phần quan trọng việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, giá trị kinh tế tầm quan trọng nguồn dƣợc liệu thiên nhiên nƣớc ta nói chung tỉnh vùng Bắc Trung nói riêng lý chọn đề tài: “N ứ s ủ Isaria japonica Phellinus pini ù B T B ” ứ Đối tƣợng nghiên cứu luận án sợi nấm Isaria japonica Yasuda thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam N ệ ụ ứ - Chiết hỗn hợp hợp chất từ sợi nấm Isaria japonica Yasuda thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer; - Sử dụng phƣơng pháp sắc ký để phân lập hợp chất từ dịch chiết hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc; - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập đƣợc P ứ - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu sau lấy đƣợc rửa sạch, phân lập, nuôi cấy bảo quản nhiệt độ thích hợp Việc xử lý tiếp mẫu phƣơng pháp chiết chọn lọc với dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp hợp chất dùng cho nghiên cứu đƣợc nêu phần thực nghiệm - Phƣơng pháp phân tích, tách hỗn hợp phân lập chất: sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với pha tĩnh khác nhƣ silica gel, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích pha đảo, pha silica gel - Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hợp chất: cấu trúc hoá học hợp chất đƣợc phân lập đƣợc xác định phƣơng pháp vật lý đại nhƣ phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR) hai chiều (2D-NMR) với kỹ thuật khác nhƣ 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC HMBC - Cấu trúc lập thể tƣơng đối hợp chất đƣợc xác định phƣơng pháp phổ NMR - Thăm dò hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật kháng nấm N ủ - Đây nghiên cứu có hệ thống Việt Nam thành phần hóa học loài nấm Isaria japonica nấm Phellinus pini khu vực Bắc Trung Bộ - Từ dịch chiết nấm Isaria japonica thu đƣợc 15 hợp chất Trong đó, hợp chất IJM-1 isarin hợp chất Đồng thời, hợp chất 11, 22dihydroxyhopane (IJM-3) lần phân lập đƣợc xác định cấu trúc phổ 1D- 2D-NMR chƣa đƣợc công bố công trình Ngoài ra, 06 hợp chất bao gồm: beauveriolide I (IJM-2), (17R)-17-methylincisterol (IJM-4), fungisterol ((3,5α,22E)-ergosta-6,8,22-trien-3-ol) (IJM-5), 4,4dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol (IJM-6), 3-O-ferulylcycloartenol (IJM-7), tricin (IJM-10) lần phân lập đƣợc từ loài nấm - Từ dịch chiết thể nấm Phellinus pini phân lập đƣợc 05 hợp chất bao gồm: 02 hợp chất triterpenoid: gilvsin A (PPH-1) gilvsin B (PPE-1) Hai triterpenoid PHH-1 PPE-1 lần phân lập đƣợc từ loài nấm này; 03 hợp chất steroit: ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2), ergosterol (PPH-2) ergosterol peroxide (PPE-3) Hợp chất PPE-2 hợp chất lần đƣợc phân lập từ loài nấm - Lần thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định kháng nấm 12 hợp chất (IJM-1, IJM-2, IJM-3, IJM-5, IJM-6, IJM-10, IJM-11, IJM-13, PPH-1, PPE-1, PPE-2, PPE-3) Kết cho thầy có 06 hợp chất (IJM-1, IJM-2, IJM-6, IJM-13, PPH-1 PPE-2) có khả kháng với chủng vi sinh vật kiểm định Gr (+) (Staphylococcus aureus subsp AureusATCC 11632) với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 50 g/ml C ủ n Luận án bao gồm 125 trang với 22 bảng số liệu, 64 hình sơ đồ với 249 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (33 trang), phƣơng pháp thực nghiệm (24 trang), kết thảo luận (63 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (24 trang) Ngoài có phần phụ lục gồm 140 phổ số hợp chất chọn lọc CH NG T NG QUAN Luận án tiến hành tổng quan tài liệu nội dung: Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấmsinh côn trùng - Giới thiệu hợp chất chuyển hóa bậc hai: polyketide, polyketide không bị khử, polyketide bị khử không hoàn toàn bị khử hoàn toàn, nonribosomal peptide, nonribosomal peptide mạch thẳng, nonribosomal (depsi)peptide dạng vòng, cyclooligomer (depsi)peptide, hợp chất chuyển hóa kết hợp polyketide–nonribosomal peptide , terpenoid… Nấm Isaria japonica Yasuda - Giới thiệu đặc điểm phân bố loài nấm Isaria japonica - Thành phần hóa học nấmsinh côn trùng Isaria japonica - Hoạt tính sinh học nấmsinh côn trùng Isaria japonica Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm thuộc chi Phellinus - Giới thiệu hợp chất chuyển hóa bậc hai: polysaccharide proteinpolysaccharide, steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, flavone, styrylpyrone, furanone, polychlorinat… Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer - Giới thiệu đặc điểm phân bố loài nấm Phellinuspini - Thành phần hóa học Phellinuspini CH P NG PH NG PHÁP TH C NGHIỆM ứ P : Mẫu nấm đƣợc thu hái vào thời điểm thích hợp năm Mẫu tƣơi sau lấy đƣợc rửa sạch, để nơi thoáng mát, tiến hành phân lập nuôi cấy, bảo quản điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm P ế x , ,x ị : Sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thƣờng (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); phƣơng pháp kết tinh P s : Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tƣơng hợp chất đƣợc xác định phƣơng pháp phổ NMR P s Quá trình thử hoạt tính Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên đƣợc thực theo phƣơng pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane H ế ị 2.2.1 H : Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm dùng loại tinh khiết (pure), dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) T ế ị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lƣợng (MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng N Yasuda) Q ứ ừs s ù (Isaria japonica ứ Thu thập mẫu Định loại Nhân giống PDA Nhân giống môi trƣờng lỏng Cao chiết Phân tích thành phần hóa học Đánh giá hoạt tính sinh học Sơ - Nội dung quy trình Phƣơng pháp lẫy mẫu, phân lập Cách nuối cấy môi trƣờng PDA Cách nuôi cấy môi trƣờng lỏng Cách chiết dịch nuôi cấy sợi nấm Phƣơng pháp sắc ký cột phƣơng pháp sắc ký mỏng Phƣơng pháp xác định cấu tạo hợp chất Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học Quy trình nghiên cứu nấmsinh côn trùng 2.3.2 Ph Mẫu nấmsinh công trùng đƣợc thu thập vào tháng 11 năm 2013 Vƣờn Quốc gia Pù Mát, đƣợc PGS TS Trần Ngọc Lân giám định tên khoa học lƣu giữ khoa Hóa học, trƣờng Đại học Vinh Mẫu đƣợc xem xét đánh giá dƣới kính hiển vi điện tử theo phƣơng pháp Lacey Brooks, phân lập sử dụng theo phƣơng pháp Goettel Inglis, phân lập bào tử đơn dựa theo phƣơng pháp Choi, cấy chuyển sang môi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA) theo phƣơng pháp Samson Đặc điểm hình thái bào tử, sợi nấm, cấu trúc qủa thể số đặc điểm sinh học khác đƣợc đánh giá, nhận dạng loài nấmsinh côn trùng theo phƣơng pháp Luangsaard P Mẫu nấmsinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) sau đƣa phòng thí nghiệm khoa Hóa học, thuộc trƣờng Đại học Vinh, Nghệ An đƣợc tiến hành nghiên cứu nhân nuôi Tiếp đến, Isaria japonica Yasuda đƣợc đƣa phân tích thành phần hoá học, đƣợc nuôi cấy môi trƣờng PDA sau nhân nuôi số lƣợng lớn môi trƣờng lỏng P Nấmsinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) đƣợc nuôi cấy môi trƣờng PDA, nhiệt độ 240C 15 ngày, cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng (đƣờng glucose, nƣớc dừa, dịch trích từ củ khoai tây, dứa, giá, tằm) vòng ngày, nhiệt độ 250C, đƣợc lọc, rửa phễu lọc chân không Phần sợi nấm sau lọc chiết với methanol, quay cất chân không thu đƣợc dịch dầu thô (25 g) 10,7 lit môi trƣờng nuôi- Phân bố nƣớc, lọc 12 lit dịch nƣớc Ngâm chiết với lit etylacetat Dịch chiết ethyl acetate Chƣng cất thu hồi dung môi Cao ethyl acetate 12 gam 530 gam sợi nấm Ngâm lit methanol, ngày Dịch chiết methanol Chƣng cất thu hồi dung môi Cao methanol 25 gam Sơ Chiết hợp chất từ môi trƣờng nuôi cấy Cao methanol đƣơc hòa tan nƣớc, chiết phân bố với dung môi ethyl acetate, cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao ethyl acetate (15 g) dịch nƣớc (10 g) Tiến hành phân tích định tính thành phần hóa học của cao ethyl acetate hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC/UV) chọn điều kiện chạy máy là: dung dịch pha động MeOH:ACN (85:15 v/v ), thể tích bơm mẫu: 20 μl, nhiệt độ cột RP 18: 300C, detector UV (VWD): λ= 210 nm, tốc độ dòng: 1,0 ml/min áp suất cột: 71 bar Cao methanol (25 g) ethyl acetate, Cao ethyl acetate ị ( g) Cao ethyl acetate (15g) C ị n (10g) CC, Silica gel Hexane:acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) CHCl3-MeOH (10:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) IJM1 1,6 (g) IJM2 (2,4g) IJM3 (1,2g) IJM4 (1,4g) (8,6 g) (g) (g) (g) CC, Silica gel Hexane:acetone (15:1) IJM-8 (123mg) (1g) IJM-10 (15mg) CC, Silica gel (8,6 g)Hexane:etylaxetat (100:1-1:1) CC, Silica gel (8,6 g)CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1, 1:1) CC, Silica gel Hexane:acetone (7:3) IJM34 IJM33 IJM32 IJM22 CC, Silica gel CHCl3:MeOH (30:1) IJM-13 (13mg) IJM-1 (13mg) (8,6 g) CC, Silica gel CHCl3:MeOH (100:0, 50:1, 10:1, 2:1,1:1 1:1) CC, Silica gel (8,6 g) Hexane:acetone (9:1-2:1) IJM41 IJM43 IJM42 IJM51 CC, Silica gel CC, Silica gel CC, Silica gel CC, Silica gel CC, Silica gel Hexane:acetone Hexane:acetone CHCl3:MeOH CHCl3:MeOH Hexane:acetone (4:1) (7:3) (9:1) (10:1) (15:1, 9:1) IJM-11 (38mg) IJM-4 (9,5mg) IJM5 (1,8g) IJM-5 (5,7mg) IJM-2 (25mg) (1g) (1g) (1g) IJM-7 (7mg) IJM-9 (31mg) CC, Silica gel CC, Silica gel Hexane:acetone CHCl :MeOH (7:3) (30:1,25:1) IJM-6 (8.0mg) IJM-12 (30mg) IJM-14 (16,5mg) (1g) Sơ (1g) 4: Phân lập hợp chất từ nấmsinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) (1g) (1g) (1g) CC, Silica gel CHCl3:MeOH (15:1) IJM-15 (14,5mg ) IJM-3 (6,4mg) (1g) (1g) IJM53 IJM52 (1g) (1g) (1g) N q Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer M Mẫu nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 10 năm 2013 Mẫu đƣợc định danh PGS.TS Ngô Anh (Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế), tiêu đƣợc lƣu giữ khoa Hóa học, trƣờng Đại học Vinh P Mẫu nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer (5,0 kg) phơi khô, nghiền nhỏ ngâm chiết với methanol nhiệt độ phòng, thu dịch chiết cất thu hồi dung môi dƣới áp suất thấp đƣợc cao methanol (580,0 g) Phân bố dịch chiết vào nƣớc chiết hexane, ethyl acetate, sau cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao hexane PPH (54,0 g), cao ethyl acetate PPE (170,0 g) dịch nƣớc Tiến hành phân tích định tính thành phần hóa học của cao hexane cao ethyl acetate hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC/UV) chọn điều kiện chạy máy là: dung dịch pha động MeOH:ACN (85:15 v/v ), thể tích bơm mẫu: 20 μl, nhiệt độ cột RP 18 : 30 0C, detector UV (VWD) : λ = 205 nm, tốc độ dòng: 1,0 ml/min áp suất cột: 71 bar T s ủ Hợp chất Isarin (IJM-1) hợp chất IJM-2, IJM-3, IJM-5, IJM6, IJM-10, IJM-11, IJM-13, PPH-1, PPE-1, PPE-2, PPE-3 đƣợc tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật với dòng vi khuẩn: khuẩn Gr (-) (Escherichia coli-ATCC25922; Pseudomonas aeruginosa- ATCC25923); khuẩn Gr (+) (Bacillus subtillis- ATCC11774; Staphylococcus aureus subsp Aureus- ATCC 11632) Hoạt tính kháng nấm với chủng nấm: nấm sợi (Aspergillus nige- 439; Fusarium oxysporum- M42); nấm men (Cadida albicans- ATCC 7754; Saccharomyces cerevisiae- SH 20) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh mẫu chất đƣợc thực phiến vi lƣợng 96 giếng theo phƣơng pháp đại Vander Bergher, Vlietlinck McKane Giống nấm men nấm sợi đƣợc trì bảo tồn môi trƣờng tiêu chuẩn: Saboraud Dextrose Broth (SDB-Sigma), vi khuẩn đƣợc trì bảo tồn môi trƣờng Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma) 12 Phổ 13C-NMR DEPT (hình 3.4 3.5) cho thấy hợp chất IJM-1 có chứa 29 carbon, bao gồm bốn carbon carbonyl (C 170,5, 171,1, 169,8, 169,3 ppm), tám carbon thơm (C 109,7, 127,0, 111,1, 118,0, 120,7, 118,0, 136,0, 123,2 ppm), carbon oxygenat (C 75,5 ppm), năm carbon nhóm methine, sáu carbon nhóm methylene năm carbon nhóm methyl Hơn nữa, độ dịch chuyển hóa học tín hiệu bốn carbon carbonyl cho thấy tồn ba liên kết peptide nhóm ester Hình 3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất IJM-1 Hình 3.5 Phổ DEPT hợp chất IJM-1 Phố COSY (hình 3.6 3.7) hợp chất IJM-1 cho phép xác định đƣợc sáu phần cấu trúc I đến VI Hình 3.6 Các phần cấu trúc I đến VI hợp chất IJM-1 13 Hình 3.7 Phổ COSY hợp chất IJM-1 Phổ HSQC (hình 3.11) hợp chất IJM-1 cho thấy tín hiệu proton H-1 [H 4,41(1H, dt, J = 7,0, 7,0 Hz)] tƣơng quan với C-1 (C 52 ppm), nhóm methine liên kết trực tiếp NH [H 8,24 (1H, d, J = 7,0 Hz)]; tín hiệu H-2 [H 1,46 (2H, m)] tƣơng quan với C-2 (C 40,8 ppm); tín hiệu H-3 [H 1,53 (1H, m)] tƣơng quan với C-3 (C 40,8 ppm); tín hiệu H-4, H-5 [H 0,88 (6H, m)] tƣơng quan lần lƣợt với C-4 (C 15,2 ppm) C-5 (C 15,1 ppm) Ngoài ra, phổ HMBC (hình 3.9 3.10) cho thấy tín hiệu tƣơng tác xa H-1 với C2/C-6 (C 169,3 ppm); H-2 với C-1/C-3/C-5/C-6; H-3 với C-1/C-4; H-4 với C2/C-3/C-5; H-5 với C-4, kết luận phần cấu trúc I phần cấu trúc axit amin leucine có hợp chất IJM-1 Mặt khác, từ số liệu phổ so sánh tài liệu axit amin leucine [105], [155] cho thấy hợp chất IJM-1 có chứa phần cấu trúc axit amin leucine (hình 3.8) Hình 3.8 Phần cấu trúc axit amin leucine hợp chất IJM-1 14 Hình 3.9 Phổ HMBC hợp chất IJM-1 Hình 3.10 Phổ HMBC hợp chất IJM-1 15 Hình 3.11 Phổ HSQC hợp chất IJM-1 Phổ H-NMR (hình 3.3) hợp chất IJM-1 xuất tín hiệu proton đặc trƣng cho nhóm amide 25-NH [H 10,69 (1H, br s)] tín hiệu proton thơm H-25 [H 7,10 (1H, s)] ghép cặp với 16-NH (H 7,08 ppm) Thêm vào đó, phổ HSQC (hình 3.11) hợp chất IJM-1 xuất tín hiệu H-20 [H 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz)], H-21 [H 6,97 (1H, t, J = 7,5 Hz)], H-22 [H 7,05 (1H, d, J = 7,5 Hz)], H-23 [H 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz)], tín hiệu proton nhóm methine thuộc vòng thơm bị vị trí 1,2 tƣơng quan lần lƣợt với C20 (H 118,0 ppm), C-21 (H 118,1 ppm), C-22 (H 120,7 ppm), C-23 (H 111,1 ppm) Ngoài ra, phổ HMBC (hình 3.9) cho thấy tƣơng tác xa H-17 với C-18/C-19/C-25/C-26; H-20 với C-22/C-24; H-21 với C-23/C-19; H-22 với C21/C-24; H-23 với C-21/C-19, chứng tỏ phần cấu trúc V diện phần cấu trúc axit amin tryptophan hợp chất IJM-1 Từ số liệu kết hợp so sánh với số liệu phổ tryptophan [160], kết luận cấu trúc hợp chất IJM-1 có chứa phần cấu trúc axit amin tryptophan Hình 3.12 Phần cấu trúc axit amin tritophan hợp chất IJM-1 Phổ 1H-NMR hợp chất IJM-1 xuất tín hiệu đặc trƣng nhóm 27-NH [H 8,11 (1H, d, J = 7,0 Hz)] Theo phổ 13C-NMR hợp chất IJM-1 xuất tín hiệu C-29 (C 170,5 ppm) tín hiệu carbon carbonyl Kết hợp với phổ HSQC xuất tín hiệu tƣơng quan proton H-27 [H 16 3,94 (1H, t, J = 7,0 Hz)], H-28 [H 1,16 (3H, d, J = 7,5 Hz)] lần lƣợt với C27(C 48,2 ppm), C-28 (C 15,1 ppm) Thêm vào đó, phổ HMBC hợp chất IJM-1 cho phép xác định tƣơng tác xa H-28 với C-27/C-29; H-27 với C-29, chứng tỏ phần cấu trúc VI thuộc phần cấu trúc alanine So sánh số liệu phổ IJM-1 với tài liệu axit amin alanine [46] kết luận phần cấu trúc axit amin alanine có hợp chất IJM-1 Hình 3.13 Phần cấu trúc axit amin alanine hợp chất IJM-1 Ngoài carbon carbonyl axit amin trên, phổ 13C-NMR, DEPT hợp chất IJM-1 xuất tín hiệu C-15 (C 171,1 ppm) tín hiệu carbon carbonyl C-7 (C 75,5 ppm) tín hiệu carbon oxygenat Các tƣơng tác xa khác phổ HMBC bao gồm H-14 với C-7/C-15; H-8 với C-7; H-9 với C-7/C-8/C-10; H-10 với C-9 cho phép xác định phần cấu trúc II gắn trực tiếp với phần cấu trúc III Hơn nữa, tƣơng tác xa H-11 với C-12/C-13; H-12 với C-13; H-13 với C-12/C-11 xác nhận liên kết phần cấu trúc III liên kết trực tiếp với phần cấu trúc IV Do đó, phần cấu trúc liên kết với theo trật tự II-III-IV hình thành cấu trúc 3hydroxy-4-methyl-octanoyl Từ phân tích liệu phổ kết hợp với so sánh với tài liệu [46] phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methylheptanoyl phân tử hợp chất IJM-1 Hình 3.14 Phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methyloctanoyl hợp chất IJM-1 Mặt khác, phổ HMBC hợp chất IJM-1 cho thấy tƣơng tác xa H-1 với C-29 độ chuyển dịch hóa học C-1 chứng tỏ tồn liên kết amide ester alanyl-leucinyl Tƣơng tác xa H-1 H-7 với C-6 độ chuyển dịch hóa học C-7 cho thấy phần cấu trúc leucine lại liên kết với axit 3-hydroxy-4-methyl-octanoylic dƣới dạng liên kết ester Dựa vào độ dịch chuyển hóa học hai nguyên tử carbon C-16 C-27 chứng tỏ hai nguyên tử carbon liên kết với liên kết amide ester Do đó, cấu trúc hợp chất IJM-1 có khung carbon dạng vòng Nhƣ vậy, phần cấu trúc axit amin tryptophan nằm alanine 3hydroxy-4-methyl-octanoyl, cấu trúc dạng vòng đáp ứng đƣợc độ bất bão hòa rút từ công thức phân tử Cấu hình tƣơng đối hợp chất IJM-1 giống nhƣ cấu hình IJM-2 (Beauveriolide I) [159] 17 P Leucine 3-hidroxyl-4methyloctanoic B : Số liệu phổ NMR IJM-1 Carbon C(ppm) H (ppm) 1-NH 8,24 (1H, d, J = 7,0 Hz) C-1 52,0 4,41(1H, dt, J = 7,0, 7,0 Hz) C-2 40,8 1,46 (2H, m) C-2, C-6 C-1, C-3, C-5, C-6 C-4 C-3, C-5 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 24,2 15,2 15,1 169,3 75,5 C-8 C-9 34,7 15,2 C-10 30,5 C-11 C-12 C-13 C-14 28,5 22,1 13,5 35,5 C-15 16-NH C-16 171,1 C-17 25,5 7,05 (1H, m) 4,23 (1H, dd, J = 9,5, 7,0 Hz) 3,15 (1H, dd, J =14,0, C-18, C-19, 6,5 Hz) C-25, C-26 3,06 (1H, dd, J =14,5, 7,5 Hz) C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24 109,7 127,0 118,0 118,1 120,7 111,1 136,0 7,05 (1H, t, J = 8,0 Hz) 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz) 6,97 (1H, t, J = 7,5 Hz) 7,05 (1H, d, J = 7,5 Hz) 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz) 55,7 Tryptophan 1,53 (1H, m) 0,88 (3H, m) 0,88 (3H, m) HMBC 4,87 (1H, ddd, J =10,0, 4,5, 4,0 Hz) 2,09 (1H, m) 0,81 (3H, d, J =7,0 Hz) 1,06 (1H, m) 1,40 (1H, m) 1,23 (1H, m) 1,30 (2H,m) 0,87 (3H, t, J = 6,5 Hz) 2,46 (1H, dd, J =18,5, 4,0 Hz) 2,36 (1H, dd, J =14,0, 8,0 Hz) C-7 C-7, C-8 C-10 C-12, C-13 C-13 C-12 C-7, C-15 C-24, C-22 C-19, C-23 18 25-NH 10,69 (1H, br s) C-25 123,2 7,10 (1H, s) C-26 169,8 27-NH 8,11 (1H, d, J = 7,0 Hz) Alanine C-27 48,2 3,94 (1H, t, J = 7,0 Hz) C-29 C-28 15,1 1,16 (3H, d, J = 7,5 Hz) C-27, C-29 C-29 170,5 H (Đo 500 MHz DMSO-d6), C (Đo 125 MHz DMSO-d6) H-1H COSY , HMBC: H C Hình 3.15 Tƣơng quan tƣơng tác xa hợp chất IJM-1 B : Tính chất lý hóa IJM-1, IJM-2, beauveriolides I IJM-1 IJM-2 Beauveriolide I [159] Trạng thái Chất bột không Chất bột màu trắng Chất bột màu màu trắng CTPT C29H42N4O5 C27H42N3O C27H42N3O + + ESI-MS (m/z) 549 [M+Na] 510 [M+Na] 510 [M+Na]+ HR-ESI-MS (m/z) Thực tế 549,3023 [M+Na]+ 486,2940 [M-H]488,3112 [M+H]+ Tính toán 549,3053 [M+Na]+ 486,2968 [M-H]488,3124 [M+H]+ Đ.n.c 250-2510C 248-2490C 248-2500C [α]D25 (c 0,4, -250 -210 -210 CHCl3-MeOH) 207, 258, 290 215 UV max (MeOH) nm 1724, IR (KBr) max 3383, 3316, 3298, 3674, 3650, 3628, 3298, -1 1723, 1677, 1534, 3567, 1722, 1681, 1684, 1641, (cm ) 1532 1641, 1538 1535 Tan dung EtOH, CH3CN, EtOH, CH3CN, EtOH, CH3CN, môi CH3OH, CHCI3, CH3OH, CHCI3, CH3OH, CHCI3, 19 EtOAc EtOAc EtOAc Không tan H2O, Hexan H2O, Hexan H2O, Hexan dung môi Các tính chất hóa lý hợp chất IJM-1, IJM-2 beauveriolide I [159] gần nhƣ tƣơng đồng nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ IR, tính tan loại dung môi (bảng 3.3) Mặt khác, so sánh số liệu phổ 1HNMR 13C-NMR hợp chất IJM-1 IJM-2 cho thấy tƣơng đồng phần cấu trúc leucine, 3-hidroxyl-4-methyloctanoic, alanine (bảng 3.4) Có thể kết luận cấu hình tuyệt đối phần cấu trúc D-leucyl, (3S,4S)-3-hydroxy-4-methyloctanoyl L-alanyl B 4: So sánh số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR phần cấu trúc leucine, 3-hidroxyl-4-methyloctanoic, alanine IJM-1 beauveriolides I P C C* H (ppm) H* (ppm) (ppm) (ppm) [159] [159] NH 8,24 (1H, d, J = 7,0 8,22 (1H, d, J = 7,0 Hz) Hz) Leucine 52,0 53,49 4,41(1H, dt, J = 7,0, 4,60 (1H, t, J = 7,0 7,0 Hz) Hz) 40,8 41,91 1,46 (2H, m) 1,53 (2H, m) 24,2 25,71 1,53 (1H, m) 1,52 (1H, m) 15,2 22,67 0,88 (3H, d, J = 6,5 0,93 (3H, d, J = 6,0 Hz) Hz) 15,1 22,57 0,88 (3H, d, J = 6,5Hz) 0,91 (3H, d, J = 6,0Hz) 169,3 170,59 75,5 77,30 4,87 (1H, ddd, J =10,0, 4,94 (1H, ddd, J = 4,5, 4,0 Hz) 10,0, 4,5, 4,0 Hz) 34,7 36,56 2,09 (1H, m) 2,05 (1H, m) 315,2 15,87 0,81 (3H, d, J =7,0 Hz) 0,89 (3H, d, J = hidroxyl7,0Hz) 430,5 31,44 1,40 (1H, m) 1,40 (1H, m) methyloct 1,06 (1H, m) 1,04 (1H, m) anoic 28,5 30,32 1,23 (1H, m) 1,23 (1H, m) 22,1 23,65 1,30 (2H, m) 1,27 (1H, m) 13,5 14,30 0,87 (3H, t, J = 6,5 Hz) 0,88 (3H, t, J =7,0 Hz) 35,5 36,69 2,46 (1H, dd, J =18,5, 2,53 (1H, dd, J=14,0, 4,0 Hz) 4,5 Hz) 2,36 (1H, dd, J =14,0, 2,41 (1H, dd, J=14,0, 8,0 Hz) 10,5 Hz) 20 171,1 NH 173,14 48,2 50,33 15,1 15,33 170,5 172,54 Alanine  * H 8,11 (1H, d, J = 7,0 Hz) 3,94 (1H, t, J = 7,0 Hz) 1,16 (3H, d, J = 7,5 Hz) 8,24 (1H, d, J = 8,0 Hz) 3,80 (1H, q, J =7,0 Hz) 1,20 (3H, d, J =7,0 Hz) H (Đo 500 MHz DMSO-d6), C (Đo 125 MHz DMSO-d6) (Đo 500 MHz CDCl3&CD3OD), C* (Đo 125 MHz CDCl3&CD3OD) Ngoài ra, phổ 1H-NMR IJM-1 cho thấy điểm khác so với IJM-2 xuất proton H 10,69 (1H, br s) 7,08 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,97 (1H, t, J = 7,5 Hz), 7,05 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz) Kết hợp với phổ 13C-NMR IJM-1 xuất tín hiệu tám carbon thơm (C 109,7, 127,0, 111,1, 118,0, 120,7, 118,0, 136,0, 123,2 ppm), khẳng định lần nhóm indole thay cho nhóm phenyl Nhƣ vậy, hợp chất IJM-1 khác biệt so với IJM-2 phần cấu trúc tryptophan thay cho phần cấu trúc phenylalanine Phân tích chi tiết tƣơng tác phổ 1H-1H COSY HMBC so sánh với tài liệu [159], kết luận hợp chất IJM-1 loại cyclodepsipeptide ((3S,4S)-3-hydroxy-4-methyloctanoyl-trytophanyl-L-alanyl-D-leucyl) với khung carbon gồm axit carbonxylic ba axit amin Hợp chất IJM-1 hợp chất đƣợc gọi Isarin N Isarin (IJM-1) (Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer) P Quá trình phân lập chất từ thể nấm thƣợng hoàng (Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer) đƣợc trình bày cụ thể phần thực nghiệm Trong trình nghiên cứu nghiên cứu thành phần hoá học từ dịch chiết methanol Quả thể nấm thƣợng hoàng (Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer) cách kết hợp phƣơng pháp chiết, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột 21 silica gel, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích với hệ dung môi rửa giải khác phù hợp với phân đoạn Kết trình nghiên cứu đƣợc thể bảng 3.15 B Các hợp chất phân lập từ nấm thƣợng hoàng (Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer) STT Ký ệ T C ứ K phâ ( ) PPH-1 Gilvsin A C31H50O2 25 PPH-2 Ergosterol C28H44O 302 PPE-1 Gilvsin B C31H50O4 30 PPE-2 Ergosta-7,22-dien-3-ol C28H46O 13 PPE-3 Ergosterol peroxide C28H44O3 135 3.3 H s ủ Kết cụ thể trình thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất IJM-1, IJM-2, IJM-6, IJM-13, PPH-1 PPE-2 có khả kháng với chủng vi sinh vật kiểm định Gr (+) (Staphylococcus aureus subsp AureusATCC 11632), nhƣng khả kháng khuẩn Gr (-) (Escherichia coli-ATCC25922; Pseudomonas aeruginosa- ATCC259232); khuẩn Gr (+) (Bacillus subtillis- ATCC11774); nấm sợi (Aspergillus nige- 439; Fusarium oxysporum- M42); nấm men (Cadida albicans- ATCC 7754; Saccharomyces cerevisiae- SH 20) đƣợc thể bảng 3.19 Các hợp chất lại PPE2, IJM-3, IJM-5, IJM-10, IJM-11, PPE-1 PPE-3 khả kháng chủng vi sinh vật nấm nêu CÁC HỢP CHẤT PHÂN ẬP ỢC TỪ NẤMSINH CÔN TRÙNG (Isaria japonica YASUDA) Isarin (IJM-1) 11, 22-dihydroxyhopane (IJM-3) Beauveriolide I (IJM-2) Fungisterol ((3,5α,22E)-ergosta -6,8,22-trien-3-ol) (IJM-5) 22 4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol (IJM-6) (17R)-17-methylincisterol (IJM-4) Ergosterol (IJM-8) Tricin (IJM-10) 3-O-ferulylcycloartenol (IJM-7) Ergosterol peroxide (IJM-9) Adenosine (IJM-11) Axit 2-hydroxyl D-mannitol (IJM-14) -3-phenylpropanoic (IJM-13) Uracil (IJM-12) Axit 3-amino butanoic (IJM-15) 23 CÁC HỢP CHẤT PHÂN ẬP ỢC TỪ QU THỂ NẤM TH ỢNG HOÀNG (Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer) Gilvsin A (PPH-1) Ergosterol (PPH-2) Gilvsin B (PPE-1) Ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) Ergosterol peroxide (PPE-3) 24 K T UẬN Đây công trình nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập đƣợc từ nấm Isaria japonica Yasuda thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer lần Việt Nam Từ dịch chiết sợi nấm Isaria japonica phân lập đƣợc 15 hợp chất: - 02 hợp chất cyclodepsipeptide: isarin (IJM-1) beauveriolide I (IJM-2) Isarin (IJM-1) hợp chất cyclodepsipeptide mới, lần đƣợc công bố loài - 02 hợp chất triterpenoid: 11, 22-dihydroxyhopane (IJM-3) 3-Oferulylcycloartenol (IJM-7) Trong đó, IJM-3 lần phân lập đƣợc xác định cấu trúc phổ 1D- 2D- NMR chƣa đƣợc công bố công trình nào; IJM-7 hợp chất lần phân lập loài - 05 hợp chất steroit: ergosterol (IJM-8), ergosterol peroxide (IJM-9), 4,4dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol (IJM-6); fungisterol ((3,5α,22E)ergosta-6,8,22-trien-3-ol) (IJM-5); (17R)-17-methylincisterol (IJM-4) Các hợp chất IJM-4, IJM-5 IJM-6 lần phân lập đƣợc từ loài - 01 hợp chất flavonoid: tricin (IJM-10); IJM-10 hợp chất flavonoid đƣợc phân lập từ loài lần - 01 hợp chất carbohydrat: D-mannitol (IJM-14) - 01 dẫn xuất axit carbonxylic: axit 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic (IJM-13) - 01 hợp chất amino axit: axit 3-amino butanoic (IJM-15) - Các hợp chất khác: uracil (IJM-12); adenosine (IJM-11) Từ dịch chiết thể nấm thể nấm Phellinus pini phân lập xác định cấu trúc 05 hợp chất: - 02 hợp chất triterpenoid: gilvsin A (PPH-1) gilvsin B (PPE-1) Hai triterpenoid PHH-1 PPE-1 lần phân lập đƣợc từ loài nấm - 03 hợp chất steroit: ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2), ergosterol (PPH-2) ergosterol peroxide (PPE-3); PPE-2 hợp chất lần đƣợc phân lập từ loài nấm Lần thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất IJM-1, IJM-2, IJM-3, IJM-5, IJM-6, IJM-10, IJM-11, IJM-13, PPH1, PPE-1, PPE-2, PPE-3 Kết cho thầy hợp chất IJM-1, IJM-2, IJM6, IJM-13, PPH-1 PPE-2 có khả kháng với chủng vi sinh vật kiểm định Gr (+) (Staphylococcus aureus subsp Aureus- ATCC 11632) 25 DANH MỤC CÔNG TRÌNH IÊN QUAN N UẬN ÁN N ễ N T , Nguyễn Tân Thành, Nguyễn Thị Hải Dâu, Trần Đình Thắng (2015), Nghiên cứu thành phần hóa học thể nấm thƣợng hoàng (Phellinus pini) Việt Nam, Tạp chí Hoá học, 53(6E12) 305-308 Nguyen Ngoc Tuan, Nguyen Tan Thanh, Dao Thanh Xuan, Tran Dinh Thang (2016), Chemical constituents from the mycelium of Isaria japonica Yasuda, Journal of Science And Technology, 54(2C), 334-341 N ễ N T , Nguyễn Tân Thành, Trần Đình Thắng (2016), Các hợp chất triterpenoid steroid từ sợi nấmsinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) Việt Nam, Tạp chí Khoa học Đại học Vinh (nhận đăng) Nguyen Ngoc Tuan, Nguyen Thi Ngan, Ping-Chung Kuo, Hsin-Yi Hung, Tran Ngoc Lan, Nguyen Tan Thanh, Dao Thi Thanh Xuan, Tran Dinh Thang, Tian-Shung Wu (2016), Characterization of cyclodepsipeptides from the fruiting bodies of Isaria japonica in Vietnam, Natural Product Communications (accepted) Nguyen Ngoc Tuan, Tran Thi Kim Anh, Ping-Chung Kuo, Tran Dinh Thang, Tian-Shung Wu (2016), A hopane triterpenoid from the mycelium of Isaria japonica in Vietnam, Journal of Science And Technology (Submitted) 26 ... hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật kháng nấm N ủ - Đây nghiên cứu có hệ thống Vi t Nam thành phần hóa học loài nấm Isaria japonica nấm Phellinus pini khu vực Bắc Trung Bộ - Từ dịch chiết nấm. .. s ủ Isaria japonica Phellinus pini ù B T B ” ứ Đối tƣợng nghiên cứu luận án sợi nấm Isaria japonica Yasuda thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer đƣợc thu hái vùng Bắc Trung Bộ Vi t... khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài nấm nhằm phát hoạt chất có dƣợc tính mạnh bệnh nan y nhƣ vi m gan, kháng vi m ung thƣ, HIV Vi c đƣa vào sử dụng rộng rãi chế
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm isaria japonica và phellinus pini ở vùng bắc trung bộ (tt) , Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm isaria japonica và phellinus pini ở vùng bắc trung bộ (tt) , Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm isaria japonica và phellinus pini ở vùng bắc trung bộ (tt)

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Từ khóa liên quan

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay
Nạp tiền Tải lên
Đăng ký
Đăng nhập